सरलीकृत रिवर्स जेनेटिक्स विधि रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त Recombinant रोटावायरस को ठीक करने के लिए
Summary
प्लाज्मिड डीएनए से पुनः संयोजन रोटावायरस का उत्पादन रोटावायरस प्रतिकृति और रोगजनन के अध्ययन और रोटावायरस अभिव्यक्ति वेक्टर और टीकों के विकास के लिए एक आवश्यक उपकरण प्रदान करता है। इसके साथ ही, हम फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त करने वाले उपभेदों सहित पुनः संयोजन रोटावायरस पैदा करने के लिए एक सरलीकृत रिवर्स जेनेटिक्स दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं।
Abstract
रोटावायरस खंडित डबल-फंसे आरएनए वायरस की एक बड़ी और उभरती आबादी है जो मनुष्यों सहित कई स्तनधारी और एवियन मेजबान प्रजातियों के युवा में गंभीर आंत्रशोथ का कारण बनती है। रोटावायरस रिवर्स जेनेटिक्स सिस्टम के हालिया आगमन के साथ, रोटावायरस जीव विज्ञान का पता लगाने, मौजूदा रोटावायरस टीकों को संशोधित करने और अनुकूलित करने और रोटावायरस मल्टीटारगेट वैक्सीन वैक्टर विकसित करने के लिए निर्देशित म्यूटाजेनेसिस का उपयोग करना संभव हो गया है। इस रिपोर्ट में, हम एक सरलीकृत रिवर्स जेनेटिक्स प्रणाली का वर्णन करते हैं जो पुनः संयोजन रोटावायरस की कुशल और विश्वसनीय वसूली की अनुमति देता है। यह प्रणाली टी7 ट्रांसक्रिप्शन वैक्टर के सह-ट्रांसफेक्शन पर आधारित है जो पूर्ण लंबाई रोटावायरस (+) आरएनए व्यक्त करती है और बीएचके कोशिकाओं में आरएनए कैपिंग एंजाइम को एनकोडिंग करने वाला सीएमवी वेक्टर संविलियन टी7 आरएनए पॉलीमरेज (बीएचके-टी7) का उत्पादन करता है। पुनः संयोजन रोटावायरस MA104 कोशिकाओं के साथ ट्रांससंक्रमित बीएचके-T7 कोशिकाओं को ओवरसीज़ करके परिलक्षित होते हैं, एक बंदर गुर्दे की कोशिका रेखा जो वायरस के विकास के लिए अत्यधिक स्वीकार्य है। इस रिपोर्ट में, हम पुनः संयोजन रोटावायरस पैदा करने के लिए एक दृष्टिकोण का भी वर्णन करते हैं जो जीनोम सेगमेंट 7 (एनएसएसपी3) में 2ए ट्रांसलेशनल स्टॉप-रीस्टार्ट तत्व की शुरुआत के माध्यम से एक अलग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त करते हैं । यह दृष्टिकोण वायरल ओपन रीडिंग फ्रेम में से किसी को हटाने या संशोधित करने से बचा जाता है, इस प्रकार एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते समय पूरी तरह से कार्यात्मक वायरल प्रोटीन को बनाए रखने वाले रिकॉम्बिनेंट रोटावायरस के उत्पादन की अनुमति देता है।
Introduction
रोटावायरस शिशुओं और छोटे बच्चों में गंभीर आंत्रशोथ के प्रमुख कारण हैं, साथ ही कई अन्य स्तनधारी और एवियन प्रजातियों के युवा1। Reoviridae परिवार के सदस्यों के रूप में, रोटावायरस एक खंडित डबल फंसे आरएनए (dsRNA) जीनोम है । जीनोम खंड प्रोटीन2की तीन गाढ़ा परतों से बनने वाले एक गैर – लिफाफे वाले इकोसाहेड्रल विरिशन के भीतर समाहित होते हैं । जीनोम खंडों के अनुक्रमण और फिलोजेनेटिक विश्लेषण के आधार पर रोटावायरस (ए−डी, एफ−जे) की नौ प्रजातियों को3परिभाषित किया गया है । रोटावायरस प्रजाति ए वाले उपभेद मानव रोग के विशाल बहुमत के लिए जिम्मेदार हैं। पिछले दशक में शुरू होने वाले बचपन के प्रतिरक्षण कार्यक्रमों में रोटावायरस टीकों की शुरूआत रोटावायरस मृत्यु दर और रुग्णता में महत्वपूर्ण कटौती के साथ सहसंबद्ध है। सबसे विशेष रूप से, रोटावायरस से जुड़ी बचपन में होने वाली मौतों की संख्या 2000 में लगभग 528,000 से घटकर 2016 में 128,500 हो गईहै4,5. रोटावायरस टीके वायरस के लाइव तनु उपभेदों से तैयार किए जाते हैं, जिसमें 6 महीने की उम्र तक बच्चों को 2 से 3 खुराक ें प्रशासित की जाती हैं। मनुष्यों और अन्य स्तनधारियों की प्रजातियों में घूम रहे आनुवंशिक रूप से विविध रोटावायरस उपभेदों की बड़ी संख्या, जो म्यूटाजेनेसिस और पुनर्वर्गीकरण के माध्यम से तेजी से विकसित होने की उनकी क्षमता के साथ संयुक्त है, बच्चों को संक्रमित करने वाले रोटावायरस के प्रकारों में एंटीजेनिक परिवर्तन का कारण बन सकती है।,7,8 इस तरह के परिवर्तन मौजूदा टीकों की प्रभावकारिता को कमजोर कर सकते हैं, उनके प्रतिस्थापन या संशोधन की आवश्यकता है ।
11 रोटावायरस जीनोम खंडों में से किसी में हेरफेर को सक्षम करने वाली पूरी तरह से प्लाज्मिड आधारित रिवर्स जेनेटिक्स प्रणालियों का विकास हाल ही में9हासिल किया गया था। इन प्रणालियों की उपलब्धता के साथ, रोटावायरस प्रतिकृति और रोगजनन के आणविक विवरणों को सुलझाना, एंटी-रोटावायरस यौगिकों के लिए बेहतर उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधियों को विकसित करने और रोटावायरस टीकों के नए संभावित अधिक प्रभावी वर्ग ों को बनाने के लिए संभव हो गया है। रोटावायरस प्रतिकृति के दौरान, छाया हुआ वायरल (+) आरएनए न केवल वायरल प्रोटीन के संश्लेषण का मार्गदर्शन करता है, बल्कि संतान डीएसआरएनए जीनोम सेगमेंट10,,11के संश्लेषण के लिए टेम्पलेट्स के रूप में भी काम करता है। आज तक वर्णित सभी रोटावायरस रिवर्स जेनेटिक्स सिस्टम सीटीएना-व्युत्पन्न (+) आरएनए के स्रोत के रूप में स्तनधारी कोशिका रेखाओं में T7 प्रतिलेखन वेक्टर के ट्रांसफेक्शन पर भरोसा करते हैं जो पुनः संयोजन,वायरस9,,12,13को ठीक करने में उपयोग किया जाता है। प्रतिलेखन वैक्टर के भीतर, पूर्ण लंबाई वायरल सीडीएनए एक अपस्ट्रीम T7 प्रमोटर और डाउनस्ट्रीम हेपेटाइटिस डेल्टा वायरस (HDV) रिबोज़िम के बीच तैनात हैं जैसे कि वायरल (+) आरएनए T7 आरएनए बहुलक द्वारा संश्लेषित किए जाते हैं जिसमें प्रामाणिक 5 ‘ और 3’-टर्मिनी(चित्रा 1A)होते हैं। पहली पीढ़ी के रिवर्स जेनेटिक्स सिस्टम में, 11 टी7 (pT7) ट्रांसक्रिप्शन वैक्टर के साथ T7 आरएनए पॉलीमरेज (बीएचके-टी7) को व्यक्त करने वाले बेबी हम्सटर किडनी कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करके पुनः संयोजन वायरस बनाए गए थे, सिमियन SA11 वायरस तनाव के एक अद्वितीय (+) आरएनए के प्रत्येक निर्देशन संश्लेषण, और तीन सीएमवी प्रमोटर-ड्राइव अभिव्यक्ति प्लाज्मिड्स, एक एवियन reovirus p10FAST संलयन प्रोटीन और vaccinia वायरस D1R-D12L कैपिंग एंजाइम परिसर9के दो एन्कोडिंग उपइकाइयों को एन्कोडिंग । ट्रांससंक्रमित बीएचके-टी7 कोशिकाओं में उत्पन्न पुनः संयोजन SA11 वायरस MA104 कोशिकाओं के साथ ओवरसीज़िंग द्वारा परिलक्षित किए गए थे, रोटावायरस विकास के लिए एक सेल लाइन स्वतंत्र। पहली पीढ़ी के रिवर्स जेनेटिक्स सिस्टम के एक संशोधित संस्करण का वर्णन किया गया है कि अब समर्थन प्लाज्मिड्स12का उपयोग करता है । इसके बजाय, संशोधित प्रणाली सफलतापूर्वक 11 SA11 T7 प्रतिलेखन वैक्टर के साथ बीएचके-T7 कोशिकाओं को स्थानांतरित करके पुनः संयोजन रोटावायरस उत्पन्न करती है, चेतावनी के साथ कि वायरल कारखाने (विरोप्लाज्म) बिल्डिंग ब्लॉक (गैर संरचनात्मक प्रोटीन NSP2 और NSP5) के लिए वैक्टर अन्य वैक्टर14, 14,,15की तुलना में 3 गुना अधिक स्तरों पर जोड़े जाते हैं। रिवर्स जेनेटिक्स सिस्टम के संशोधित संस्करण भी विकसित किए गए हैं जो रोटावायरस16,17के मानव केयू और ओडलिया उपभेदों की वसूली का समर्थन करते हैं । रोटावायरस जीनोम रिवर्स जेनेटिक्स द्वारा हेरफेर करने के लिए उल्लेखनीय रूप से उत्तरदायी है, जिसमें वीपी418,एनएसएसपी19,एनएसपी219,एनएसपी320,,21और एनएसएसपी522,,23में उत्परिवर्तन के साथ आज तक उत्पन्न पुनः संयोजन वायरस उत्पन्न होते हैं। अब तक उत्पन्न किए गए सबसे उपयोगी वायरसों में वे हैं जिन्हें फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन (एफपी)9,12,,21,24,25व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया गया है ।
इस प्रकाशन में, हम रिवर्स जेनेटिक्स सिस्टम के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जिसे हम अपनी प्रयोगशाला में SA11 रोटावायरस के पुनर्संयोजन उपभेदों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग करते हैं। हमारे प्रोटोकॉल की प्रमुख विशेषता 11 pT7 प्रतिलेखन वैक्टर के साथ बीएचके-T7 कोशिकाओं का सह-ट्रांसफेक्शन है (pT7/NSP2SA11 और pT7/NSP5SA11 वैक्टर) के 3x स्तर को शामिल करने के लिए संशोधित और अफ्रीकी सूअर बुखार वायरस (ASFV) NP868R कैपिंग एंजाइम21 Figure 2 हमारे हाथों में, NP868R प्लाज्मिड की उपस्थिति ट्रांससंक्रमित बीएचके-टी7 कोशिकाओं द्वारा पुनः संयोजन वायरस के उच्च टिटर के उत्पादन की ओर ले जाती है। इस प्रकाशन में, हम pT7/NSP3SA11 प्लाज्मिड को संशोधित करने के लिए एक प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं जैसे कि पुनः संयोजन वायरस उत्पन्न किए जा सकते हैं जो न केवल सेगमेंट 7 प्रोटीन उत्पाद NSP3 बल्कि एक अलग एफपी को भी व्यक्त करते हैं। यह पीटी7/एनएसपी3एसए11 प्लाज्मिड में एनएसपी 3 ओपन रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) को फिर से इंजीनियरिंग करके पूरा किया जाता है ताकि एक डाउनस्ट्रीम 2A ट्रांसलेशनल स्टॉप-रीस्टार्ट तत्व हो सके जिसके बाद एफपी ओआरएफ(चित्रा 1बी)24,,26। इस दृष्टिकोण के माध्यम से, हमने विभिन्न एफपी व्यक्त करते हुए पुनः संयोजन रोटावायरस उत्पन्न किया है: UnaG (ग्रीन), एमकेट (दूर-लाल), एमएमआई (लाल), टैगबीआरपी (नीला), सीएफपी (सियान), और वाईएफपी (पीला)24,,27,,28। ये एफपी-एक्सप्रेसिंग रोटावायरस NSP3 ORF को हटाने के बिना किए जाते हैं, इस प्रकार वायरस पैदा होते हैं जो वायरल प्रोटीन के कामकाज के पूर्ण पूरक को एन्कोड करने की उम्मीद करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारी प्रयोगशाला में, हम नियमित रूप से रिवर्स जेनेटिक्स प्रोटोकॉल पर भरोसा करते हैं जो यहां वर्णित है ताकि पुनः संयोजन SA11 रोटावायरस का उत्पादन किया जा सके। इस दृष्टिकोण के साथ, आणविक जीव विज्ञान तकनीक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को NIH अनुदान R03 AI131072 और R21 AI144881, इंडियाना विश्वविद्यालय स्टार्ट-अप फंडिंग, और लॉरेंस एम ब्लैट एंडोमेंट द्वारा समर्थित किया गया था। हम रिवर्स जेनेटिक्स प्रोटोकॉल विकसित करने में उनके कई योगदान और सुझावों के लिए आईयू रोटाहुसियर प्रयोगशाला, उल्रिच डेस्सलबर्जर और गुइडो पापा के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
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