Summary
مضاعفة في الكهربائي الرحم يسمح استهداف مجموعات الخلايا التي يتم فصل مكاني وزمنيا. هذه التقنية مفيدة لتصور التفاعلات بين تلك الخلايا التي تستخدم البروتينات الفلورية في الظروف العادية ولكن أيضا بعد التجارب الوظيفية ل الجينات التي تثير الاهتمام.
Abstract
في الإلكتروبور الرحمي هو في تقنية نقل الحمض النووي في الجسم الحي تستخدم على نطاق واسع لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة في الثدييات corticogenesis. يستفيد هذا الإجراء من بطين الدماغ للسماح بإدخال الحمض النووي ذات الاهتمام ويستخدم زوجًا من الأقطاب لتوجيه مدخل المادة الوراثية إلى الخلايا المبطنة للبطين ، وهي الخلايا الجذعية العصبية. هذه الطريقة تسمح للباحثين لتسمية الخلايا المطلوبة و / أو التلاعب في التعبير عن الجينات من الاهتمام في تلك الخلايا. لديها تطبيقات متعددة، بما في ذلك المقايسات التي تستهدف الهجرة العصبية، وتتبع النسب، ومحور عصبي المسار. ومن السمات الهامة لهذه الطريقة هي سيطرتها الزمنية والإقليمية، مما يسمح بالتحايل على المشاكل المحتملة المتعلقة بالفتاكة الجنينية أو عدم وجود فئران محددة من فئران سائق CRE. جانب آخر ذو صلة من هذه التقنية هو أنه يساعد على الحد إلى حد كبير من القيود الاقتصادية والزمنية التي تنطوي على توليد خطوط الماوس الجديدة ، والتي تصبح ذات أهمية خاصة في دراسة التفاعلات بين أنواع الخلايا التي تنشأ في مناطق بعيدة من الدماغ في مختلف الأعمار التنموية. هنا نحن وصف استراتيجية مزدوجة الكهربائي التي تمكن من استهداف مجموعات الخلايا التي يتم فصل مكاني وزمنيا. مع هذا النهج يمكننا تسمية أنواع فرعية مختلفة من الخلايا في مواقع مختلفة مع البروتينات الفلورية المختارة لتصور لهم، و / أو يمكننا التعامل مع الجينات من الفائدة التي تعبر عنها هذه الخلايا المختلفة في الأوقات المناسبة. هذه الاستراتيجية تعزز إمكانات في الصعق الكهربائي الرحمي وتوفر أداة قوية لدراسة سلوك مجموعات الخلايا المنفصلة زمانياً ومكانياً التي تهاجر لإقامة اتصالات وثيقة، فضلاً عن التفاعلات طويلة المدى من خلال الإسقاطات المحورية، مما يقلل من التكاليف الزمنية والاقتصادية.
Introduction
القشرة الدماغية هي بنية معقدة جدا ومنظمة بشكل معقد. لتحقيق هذه الدرجة من التنظيم، الخلايا العصبية إسقاط القشرية تمر العمليات التنموية المعقدة التي تتطلب جيلها الزمني، والهجرة إلى وجهتها النهائية في لوحة القشرية، وإنشاء اتصالات قصيرة وطويلة المدى1،,2. لفترة طويلة، كانت الطريقة الكلاسيكية لدراسة الكورتيوجينسيس على أساس استخدام نماذج الميرين بالضربة القاضية أو الروبوت في الجينات ذات الأهمية. ومع ذلك، هذه الاستراتيجية، وخاصة استخدام الفئران خروج المغلوب المشروطة، هو مضيعة للوقت ومكلفة، وأحيانا يطرح مشاكل إضافية بشأن وجود التكرار الوراثي أو عدم وجود برامج محددة CRE، من بين أمور أخرى. واحدة من النهج التي نشأت في محاولة لمعالجة تلك المشاكل ، وهذا يستخدم في الوقت الحاضر على نطاق واسع لدراسة التنمية القشرية هو في التيار الكهربائي الرحمي3،4. في الإلكتروبور الرحمي هو تقنية تستخدم في التنظير الجسدي، مما يسمح في الجسم الحي استهداف الخلايا الجذعية العصبية وذريتها. يمكن استخدام هذه الطريقة لتسمية الخلايا من خلال التعبير عن البروتينات الفلورية5،6، للتلاعب الجيني في الجسم الحي (أي كسب أو فقدان مقايسات الدالة)7،8،9، لعزل الكورتيسيسات الكهربائية في المختبر وخلايا الاستزراع8،10. وعلاوة على ذلك، يسمح الإكتروليت في الرحم بالسيطرة الزمنية والإقليمية على المنطقة المستهدفة. هذه التقنية لديها العديد من التطبيقات، وقد استخدمت على نطاق واسع لدراسة الهجرة العصبية, تقسيم الخلايا الجذعية, اتصال الخلايا العصبية, وغيرها من المواضيع8,,9,,11,,12.
تصف المخطوطة الحالية استخدام متغير كهربائي في الرحم، يُطلق عليه مضاعفة في الإلكتروبور الرحمي، لتحليل تفاعلات الخلايا في قشرة الدماغ ذات الأصول الزمانية والمكانية المختلفة. هذه الدراسات معقدة للغاية لإكمال عند استخدام نماذج المورين لأنها تتطلب الاستخدام المشترك لعدة خطوط محورة وراثيا. وتشمل بعض تطبيقات البروتوكول الموصوفة في هذه الورقة دراسة التفاعلات الوثيقة بين الخلايا المجاورة، فضلا عن التفاعلات بين الخلايا البعيدة من خلال الإسقاطات بعيدة المدى. تتطلب الطريقة إجراء اثنين مستقلين في عمليات الجراحة الكهربائية الرحمية ، مفصولة زمنيًا ومكانيًا ، على نفس الأجنة لاستهداف مجموعات الخلايا المختلفة ذات الاهتمام. وميزة هذا النهج هو إمكانية التلاعب وظيفة الجينات في واحد أو كلا النوعين من الخلايا العصبية باستخدام الحيوانات من النوع البرية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين هذه التجارب الوظيفية مع التعبير عن البروتينات الفلورية السيتوبلازمية أو الغشاء الموسومة لتصور مورفولوجيا الدقيقة للخلايا المستهدفة، بما في ذلك dendrites والمحارب، وتحليل الاختلافات المحتملة في التفاعلات الخلوية بالمقارنة مع السيطرة (أي الخلايا التي تحمل اسم البروتين الفلوري فقط).
ويركز البروتوكول المحدد هنا على دراسة التفاعلات الخلوية داخل القشرة الجديدة، ولكن هذه الاستراتيجية يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة التفاعلات مع المناطق الخارجة عن القشرية التي يمكن استهدافها باستخدام في الإلكتروبورات الرحمية، مثل الزبالة الفرعية أو المهاد13،,14،أو تفاعلات الخلايا في الهياكل الأخرى، مثل المخيخ15. ويستند استهداف مناطق مختلفة على اتجاه الأقطاب وعلى البطين حيث يتم حقن الحمض النووي (الجانبي، الثالث، أو الرابع). مع الاستراتيجية المذكورة هنا ، يمكننا تسمية عدد كبير من الخلايا ، وهو أمر مفيد لتقييم التغييرات العامة في الاتصال / التداخل في التجارب الوظيفية. ومع ذلك، لدراسة التغيرات الدقيقة في الاتصال، يمكن للمرء استخدام الإصدارات المعدلة من في الكهربائي الرحم للحصول على وضع العلامات sparser وتحديد خلايا واحدة16. وباختصار، فإن ضعف القدرة الكهربائية الرحمية هو طريقة متعددة الاستخدامات تسمح باستهداف مجموعات الخلايا المنفصلة زمانياً ومكانياً ودراسة تفاعلاتها بالتفصيل، إما في ظروف التحكم أو في ظروف مقترنة بتجارب وظيفية، مما يقلل إلى حد كبير من التكاليف الزمنية والاقتصادية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت على الإجراء الوارد في هذه الوثيقة من قبل اللجنة الأخلاقية المسؤولة عن التجارب، والرفاهية الحيوانية في جامعة فالنسيا و Conselleria de Agricultura، Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Transición Ecológica من Comunidad فالنسيانا، وتلتزم المبادئ التوجيهية للمجلس الدولي لعلوم الحيوان المختبرات (ICLAS) استعرضت في 53/2013 ريال Decreto من التشريعات الإسبانية وكذلك في التوجيه 2010/63/EU من البرلمان الأوروبي والمجلس.
ملاحظة: ينطوي هذا البروتوكول على غرضين مختلفين: 1) الدراسة الأولى، ويشار إليها باسم "الاستراتيجية A"، تسمح بتحليل التفاعلات بين خلايا Cajal-Retzius (خلايا CR) والخلايا العصبية الإسقاط القشرية في وقت مبكر من الولادة داخل نصف الكرة الأرضية نفس الدماغ. 2) يتم تنفيذ الدراسة الثانية ، "استراتيجية ب" ، من أجل دراسة إينتيشن الطبقة العليا من الخلايا العصبية الإسقاط الكالوسال إلى الجانب الآخر من القشرة الجديدة.
1. إعداد ما قبل الجراحة
- إعداد الحمض النووي
- تحويل كيميائيا أو الكهربائية المنافسة E. كولاي DH5α الخلايا مع plasmids من الفائدة، لوحة لهم على لوحات LB أجار مع المضادات الحيوية المناسبة، واحتضان لهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: جميع plasmids المستخدمة هنا تحتوي على المروج العام للدجاج β-actin (CAG) يقود التعبير عن بروتين مراسل الفلورسنت (CAG-mCherry وCAG-EGFP للاستراتيجية A وCAG-BFP وCAG-nEGFP-2A-mtdTomato للاستراتيجية B). تحتوي جميعها على مقاومة الأمبيسيلين (AMP). - اختيار المستعمرات الفردية من كل التحول البلازميد وبدء ثقافة سائلة بداية في 2 مل من مرق لوريا + أمبيسيلين (LB + AMP) في أنابيب الثقافة البكتيرية خلال 3−4 ح في 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي (200 دورة في الدقيقة). بعد, تعيين أكبر ثقافة بكتيرية في قارورة 500 مل Erlenmeyer إضافة 200 مل من LB + AMP و 1 مل من ثقافة بداية. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في شاكر المدارية في 200 دورة في الدقيقة.
- استخدام مجموعة ماكسي الإعدادية خالية من الانسهاي(جدول المواد)اتباع تعليمات الشركة المصنعة للحصول على الحمض النووي البلازميد النقي والمركز من الثقافات السائلة. إعادة تعليق الحمض النووي في ~ 50-100 ميكرولتر من حمض تريس EDTA (TE) خالية من الانسثة (TE) للحصول على تركيزات لا تقل عن 5 ميكروغرام/ميكرولتر.
- لكل عملية جراحية، وإعداد حل مع حجم النهائي من 10 ميكرولتر تحتوي على 1 ميكرولتر من صبغة خضراء سريعة، حل الحمض النووي plasmid من الفائدة لتركيز النهائي من 1 ميكروغرام / ميكرولتر لكل plasmid، و endotoxin خالية من TE العازلة. على سبيل المثال، مزيج 1 ميكرولتر من صبغة خضراء سريعة، 2 ميكرولتر من 5 ميكروغرام/ميكرولتر حل الحمض النووي plasmid، و 7 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE.
- تحويل كيميائيا أو الكهربائية المنافسة E. كولاي DH5α الخلايا مع plasmids من الفائدة، لوحة لهم على لوحات LB أجار مع المضادات الحيوية المناسبة، واحتضان لهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- الماصات سحب
- سحب البورسليكات الشعرية الزجاجية (1/0.58 مم الخارجي / القطر الداخلي) في بكرة ميكروبليت عمودي حتى يصل طول طرف 1-1.5 سم وتقليم باستخدام ملقط تشريح في زاوية 30 درجة تقريبا تحت نطاق تشريح.
- إعداد غرفة الجراحة
- وضع جميع المعدات على طاولة التشغيل (أي، ملاقط، مقص، ملقط، micropipettes، إبرة، وحامل إبرة). بدوره على وسادة التدفئة وتغطية مع وسادة ماصة الجراحية العقيمة. تأكد من أن الخزان في الجهاز لتخدير استنشاق مليء isoflurane، خزان الأكسجين يحتوي على ما يكفي من الأوكسجين، ويعمل النظام بشكل صحيح.
ملاحظة: يجب أن تبقى غرفة الجراحة والمواد المقاومة معقمة قدر الإمكان (أي يجب أن تكون جميع المواد ذاتية الخضوع قبل الجراحة ويجب تطهير الأسطح مع الإيثانول بنسبة 70٪). يجب تطهير الأقطاب الكهربائية البلاتينية بعناية أولاً بالصابون المسبب للجراثيم والثانية مع الإيثانول بنسبة 70٪ قبل الجراحة. - إعداد 100 مل من 0.9٪ (ث / الخامس) محلول ملحي معقمة تحتوي على البنسلين ستريبتوميسين 1:100 وملء طبق بيتري 10 سم. ضع اللوحة على قمة لوحة ساخنة لتسخين الحل.
- ملء حقنة 1 مل مع 150 ميكرولتر من محلول مسكن (على سبيل المثال، 0.1 ملغم / كجم البوبرينورفين).
- قم بتحميل الماصات المسحوبة بـ 5 ميكرولتر من محلول DNA plasmid النهائي الذي تم إعداده في الخطوة 1.1.4. قم بتوصيل الشعيرات الدموية بأنبوب اسبيرات يتم التحكم فيه بالفم.
- وضع جميع المعدات على طاولة التشغيل (أي، ملاقط، مقص، ملقط، micropipettes، إبرة، وحامل إبرة). بدوره على وسادة التدفئة وتغطية مع وسادة ماصة الجراحية العقيمة. تأكد من أن الخزان في الجهاز لتخدير استنشاق مليء isoflurane، خزان الأكسجين يحتوي على ما يكفي من الأوكسجين، ويعمل النظام بشكل صحيح.
2. الأولى في جراحة كهربائي الرحم
- وضع E11.5 (الاستراتيجية أ) أو E13.5 (استراتيجية B) C57BL/ 6 الماوس الحوامل داخل غرفة التعريفي مغلقة مع 2.5٪ (الخامس / الخامس) isoflurane في 0.8 لتر / دقيقة والانتظار حتى يتم تخديره. نقل الماوس إلى وسادة التدفئة ووضع أنفه في قناع للتسليم المستمر من ايزوفلوران. تحقق من عدم وجود رد فعل دواسة كمؤشر للتخدير السليم.
ملاحظة:يتم تحديد عمر المبيرونيك E بناءً على اليوم الذي يتم فيه ملاحظة المكونات المهبلية (E0.5). - حقن الأنثى الحامل مع المحلل مسكن (0.1 ملغ / كغ البوبرينورفين) تحت الجلد. لمنع العينين من الجفاف أثناء الإجراء، ضعي قطرة واحدة من مرهم العين في كل عين باستخدام مسحة قطنية.
- حلق منطقة البطن الماوس مع شفرة حلاقة كهربائية وغسلها 2x مع 70٪ (الخامس / الخامس) مناديل الإيثانول، مرة واحدة مع مناديل اليود، ومرة أخيرة مع مسح الإيثانول.
- استخدم المقص لعمل شق بطول 30 مم من خلال الجلد في الجانب الأيمن من الحيوان وفصل الجلد المجاور بعناية عن العضلات مع ملعقة حادة. بعد ذلك، قم بعمل شقّ ثانٍ في جدار البطن.
- غطي البطن بقطعة من ورق الأنسجة المطوية التي تم تطهيرها سابقًا مع الإيثانول بنسبة 70٪ تحتوي على فتحة طولها 40 مم في مركزها. سحب بعناية الرحم من تجويف البطن مع ملقط حلقة.
ملاحظة: يجب أن يبقى الرحم رطبًا بالمحلول الملحي الدافئ المعد في الخطوة 1.3.2 أثناء الإجراء بأكمله. - تحميل مسبقة الماصات المسحوبة مع حل الحمض النووي المعدة في الخطوة 1.1.4. تحقن ~ 0.5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي لكل جنين في البطين الجانبي لنصف الكرة الغربي المحدد باستخدام أنبوب التعرق الذي يتم التحكم فيه بالفم حتى تصبح الصبغة الخضراء السريعة ملحوظة داخل البطين.
- ضع أقطاب بلاتينية من نوع الكتب بشكلٍ ثنائِي حول رأس الجنين المحقون (كما هو موضح في الشكل 1A والشكل 2A). توجيه الأقطاب لاستهداف منطقة الدماغ المطلوب. توجيه القطب الموجب نحو الجدار الوسيط لكهرباء الهزيم القشري (الاستراتيجية A) أو نحو القشرة الجانبي (الاستراتيجية ب) لتسمية الخلايا المتولدة في هذا المجال.
ملاحظة: في جميع الحالات، يجب تجنب القلب والمشيمة لضمان البقاء على قيد الحياة الجنينية. - تطبيق التسلسل المحدد للنبضات الكهربائية مع كهربائي موجة مربعة بعد المؤشرات المبينة في الجدول 1 (الاستراتيجية A E11.5 أجنة: أربعة نبضات من 25 V و 40 مللي ثانية، مفصولة بفواصل 950 مللي ثانية؛ الاستراتيجية B E13.5 أجنة: خمس نبضات من 35 V و 60 مللي ثانية، مع فواصل زمنية 950 مللي ثانية).
- ضع الرحم بعناية مرة أخرى في تجويف البطن مع ملقط، وملء مع محلول ملحي دافئ، وإغلاق جدار البطن مع خياطة إبرة 6-0. الانضمام إلى جانبي الشق الأولي المحرز في الجلد إما باستخدام إبرة 6-0 خياطة أو مقاطع خياطة.
- الحفاظ على الحيوان على وسادة التدفئة ومراقبتها حتى استعادتها من التخدير. توفير جرعة إضافية من المسكن (150 ميكرولتر) في محلول هيدروجيل وضعت في قفصها المنزل.
- بعد 24 ساعة من الجراحة ، وإدارة جرعة إضافية من المسكن (150 ميكرولتر). مواصلة الرصد اليومي عن طريق الفحص البصري للألم والضيق المحتمل. مراقبة سلوك الحيوان، واختبار ردود الفعل الطبيعية لها الطرف الخلفي، وتفقد خياطة لعلامات الضرر المحتملة بسبب لعق أو خدش الجرح.
3. الثانية في كهربائي الرحم
- بعد يومين من الجراحة الأولية، كرر الخطوات 2.1−2.3. على الرغم من أن شفاء الإناث الحوامل بعد الجراحة جيد جدا، تأكد من أنها تظهر السلوك الطبيعي وتقديم أي علامات على الألم أو الضيق قبل إجراء الجراحة الثانية (E13.5 أجنة لاستراتيجية A و E15.5 للاستراتيجية B).
- إجراء شق 30 مم طويلة من خلال الجلد كما هو الحال في الخطوة 2.4 وشق ثان في جدار البطن, هذه المرة في الجانب الأيسر من الحيوان. كشف بعناية الرحم على رأس الأنسجة المطهرة كما هو موضح في الخطوة 2.5.
ملاحظة: يجب الحرص على عدم التدخل في شق التي أجريت سابقا في الجانب الآخر. - حقن حوالي 0.5 ميكرولتر لكل جنين من محلول الحمض النووي في بطين الدماغ الجانبي لنصف الكرة الأرضية الذي تم تحويله إلى كهرباء في حالة الاستراتيجية A وفي بطين الدماغ الجانبي لنصف الكرة الأرضية المقابل للاستراتيجية B.
ملاحظة: استخدم الأجنة التي تظهر التطور الطبيعي فقط ولا تظهر علامات على إعادة الامتصاص. - ضع الأقطاب الكهربائية حول رأس الجنين كما هو موضح في الخطوة 2.7، توجيه القطب الموجب نحو القشرة الجانبية وتطبيق النبضات المناسبة بعد المؤشرات الموضحة في الجدول 1 (الاستراتيجية A E13.5 أجنة: خمس نبضات من 35 V و 60 مللي ثانية تفصل بينها 950 مللي ثانية؛ الاستراتيجية B E15.5 أجنة: خمس نبضات من 50 V و 80 مللي ثانية تفصل بينها فواصل 950 مللي ثانية).
- متابعة والانتهاء من الجراحة كما هو موضح في الخطوات 2.8−2.10.
4- حصاد الأنسجة والقطع
- الاستراتيجية ألف
- بعد أربعة أيام من الكهربة الثانية (E17.5) ، قم بإجراء خلع عنق الرحم للأنثى الحامل ووضعه في وضعية الوبين.
- باستخدام مقص، وجعل شق البطن لاستخراج قرون الرحم ومع ملقط وضعها في طبق بيتري مليئة المالحة 1x الفوسفات المخزن (PBS) وضعت على الجليد.
ملاحظة: درجة الحرارة المنخفضة تجعل تخدير الأجنة ممكناً. - باستخدام ملاقط، استخراج الأجنة من الكيس السلوي ونقلها مع ملقط إلى طبق بيتري جديد مملوءة PBS تحت نطاق تشريح. أمسك بعناية رأس الأجنة باستخدام ملقط وقم بتشريح الدماغ باستخدام الملاقط لإزالة الجلد فوق الرأس أولاً ثم الجمجمة. استخدم ملعقة لسحب العقول المكشوفة.
- جمع العقول مع ملعقة وإيداعها في لوحة 48 جيدا مليئة الحل المثبت (4٪ [ث / الخامس] paraformaldehyde [PFA] في 1X PBS). اختبار على الفور للنتائج الناجحة لكلا الكهربائيات عن طريق فحص العقول باستخدام مجهر epifluorescence مقلوب، على سبيل المثال.
- ثبّت الدماغ جنينيّة بين ليلة وضحاها في 4 [ك] في شاكرة مداريّة. غسل مع 1X برنامج تلفزيوني للقضاء على آثار PFA. ثم نقلها إلى برنامج تلفزيوني مع المواد الحافظة المضادة للفطريات (1x PBS-0.05٪ (ث / الخامس) أزيد الصوديوم).
تنبيه: PFA وأزيد الصوديوم هي مركبات السامة للخلايا التي تتطلب احتياطات خاصة أثناء استخدامها. - تضمين العقول في التركيز 4٪ (ث / الخامس) انخفاض ذوبان نقطة agarose في 1X PBS وانتظر ~ 10 دقيقة حتى يقوي. التمسك بها إلى حامل الأنسجة هزاز باستخدام الغراء سيانواكريلات مع المصابيح الشم التي تواجه صعودا للحصول على أقسام الإكل.
- بدء الاهتزاز وتحديد المعلمات المطلوبة: 100 μm العرض، 0.60 μm / s السرعة، و 0.60 مم من السعة.
- تأمين الدماغ داخل حاوية هزاز، وملء مع 1x برنامج تلفزيوني الحل، والبدء في جمع أقسام تسلسلية الإكلال مع مساعدة من فرشاة في لوحة 48 جيدا مليئة 1x PBS-0.05٪ (ث / الخامس) أزيد الصوديوم أن يكون تصوير كامل للدماغ (على سبيل المثال، حوالي سبعة أقسام في البئر وستة آبار لكل جنين).
- جبل المقاطع المطلوبة في شرائح الزجاج المجهر باستخدام فرشاة غرامة. غطّيهم بأغطية زجاجية. للتخزين على المدى الطويل إضافة المتوسطة تصاعد، مما يمنع photobleaching والتأكسد الضوئي. مراقبة الشرائح تحت مجهر epifluorescence تستقيم لتقييم فعالية الكهربائي.
- الاستراتيجية باء
- السماح الجراء سابقا الكهربائية في E13.5 و E15.5 أن يولد والانتظار حتى P15 لأداء ضخ عبر القلب باستخدام نفس الحل المثبت المستخدمة في الخطوة 4.1.4.
- قبل التسريب، تدار داخل الصفاق جرعة من 75/1 ملغ/كغ من الكيتامين/ميدتومويدين. عندما يتم فقدان رد الفعل دواسة، وتأمين الماوس في موقف سوبين وجعل شق البطني بعد خط الوسط باستخدام مقص لفضح كل من القفص الصدري والحجاب الحاجز.
- قطع الحجاب الحاجز وفتح القفص الصدري للوصول إلى القلب. عقد القفص الصدري باستخدام الهيموستات وجعل شق في الأذين الأيمن مع مقص غرامة.
- اختراق البطين الأيسر مع إبرة متصلة مع أنبوب مرن إلى مضخة النفخ ال peristaltic. بدء ضخ عبر القلب، وتقديم ما لا يقل عن 25 مل من 4٪ PFA في تدفق مستمر من 5.5 مل/ دقيقة (الوقت الإجمالي ~ 5 دقيقة).
- تشريح دماغ الحيوانات المُقَدّمة. أولاً، إزالة الجلد فوق الرأس مع مقص والملقط. بدء قطع الجمجمة باستخدام مقص وسحب بعناية قبالة أجزاء من عظام الجمجمة حتى يتم إزالتها تماما. وأخيراً، استخرج الدماغ بمساعدة ملعقة.
- نقل العقول إلى لوحة 24 جيدا وإصلاحها مع 4٪ PFA بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على شاكر المدارية. وقف التثبيت عن طريق استبدال PFA مع 0.05٪ (ث / الخامس) أزيد الصوديوم في برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: كما هو مبين في الخطوة 4.1.5، فإنه من المستحسن تنفيذ غسل وسيطة مع 1X PBS. - كرر الخطوات 4.1.6−4.1.9، وتغيير معلمات الاهتزاز لأدمغة ما بعد الولادة (عرض 40 ميكرومتر، وسرعة 1.20 ميكرومتر/س، و0.5 مم من السعة).
ملاحظة: يمكن إجراء الكيمياء المناعية أو الفلوروسين المناعية للكشف عن علامات خلايا محددة أو تعزيز إشارة البروتينات الفلورية المستخدمة في الكهربة.
5- التصوير والتحليل الفلوري النافوكال
- قم بتشغيل المجهر confocal، ضع شرائح المجهر التي تحتوي على أقسام الدماغ المثبتة على حامل شرائح المجهر وحدد القنوات التي سيتم التقاط صور الفلوريسنس (أي 420-460 نانومتر لBFP، 490−540 نانومتر لـ GFP، و570−620 نانومتر لـ MCherry و tdTomato).
- قم بإجراء مسح عينة للحصول على صور خريطة لكل قسم في الدماغ في أطوال موجية مختلفة للحصول على عرض عام لإخراج الإلكتروبور المزدوج. بمجرد الانتهاء، حدد عدسة 10x ووضع المراقبة متعددة المناطق-Z-المكدس-timelapse. وهذا سيسمح برمجة اقتناء التلقائي للصور الفلورية في تعريب XYZ مختلفة داخل أقسام الدماغ.
- في كل منطقة من المناطق المختارة (XY) ، قم بتعيين معلمات التصوير المناسبة (أي كثافة الليزر ، وحساسية الMulinglier الضوئية ، والحد الأدنى للدقة 1024 × 1024) ، وكذلك عمق المسح (Z) وفقًا لـ طائرات العينة التي يكون فيها الفلوريسين مرئيًا.
- الحصول على التكبير المنخفض (10x) الصور من جميع المناطق المختارة وتصديرها من تنسيق المنظمة الدولية للIF إلى TIFF باستخدام برنامج عارض المجهر.
- تغيير إلى عدسة 60x، كرر الخطوة 5.3 والتقاط صور التكبير عالية لمراقبة التفاعلات الخلية الخلية بطريقة أكثر تفصيلا. تصديرها كما هو مبين في الخطوة 5.4.
- افتح الصور التي تم الحصول عليها مع أي برنامج تصوير (مثل فيجي) لمزيد من التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نشأت التفاعلات بين الخلايا المجاورة في أماكن وفي أوقات مختلفة: خلايا Cajal-Retzius (خلايا CR) والخلايا العصبية الإسقاط القشرية المهاجرة المبكرة (الاستراتيجية أ)
وقد سبق وصف التفاعل بين الخلايا CR-cells والخلايا العصبية الإسقاط القشرية المبكرة بأنها ضرورية لتنظيم نقل سومال عبر جزيئات التصاق النكتين والكادهرين باستخدام استراتيجية مزدوجة electroporation8. تُنشأ خلايا CR من neuroepithelium على حواف اللاميوم وتهاجر بشكل عرضي لتملأ الجزء الأكثر سطحية من القشرة، المنطقة الهامشية17،18،19، في حين يتم توليد الخلايا العصبية الإسقاط القشرية في المنطقة التكاثرية للقشرة الدماغية والهجرة بشكل شعاعي إلى اللوحة القشرية الوليدة20. هناك اختلاف زمني في توليد كلا النوعين من الخلايا. يتم إنشاء الخلايا CR-الخلايا في مراحل الجنينية في وقت مبكر جدا من E10.521,22 والخلايا العصبية إسقاط القشرية التي تهاجر عن طريق نقل سومال ولدت من E12.5-E13.523. باستخدام الضعف في الكهربائي الرحمي، والفجوة الزمنية بين العمليات الجراحية يسمح CR-الخلايا، التي تستهدف في E11.5 في أحد أماكن المنشأ (هيم القشرية)، للوصول إلى المنطقة الهامشية من القشرة الجديدة الجانبي بما في ذلك منطقة somatosensory في الوقت المناسب لإقامة اتصالات مع الخلايا العصبية الإسقاط القشرية المسمى في E13.5(الشكل 1A،B). العمليات الرائدة في الخلايا العصبية الإسقاط التعبير عن تعزيز GFP (EGFP) بغزارة في المنطقة الهامشية من القشرة والاختلاط مع عمليات الخلايا CR التي تعبر عن mCherry(الشكل 1C). وقد أظهرت التجارب الوظيفية أن الاجتياج الخلايا الخلية التصاق جزيئات التي أعرب عنها إسقاط الخلايا العصبية أو CR الخلايا يؤثر على الارستور من عملياتها نتيجة لجهات الاتصال المتغيرة بين كلا النوعين الخلية8.
التفاعلات طويلة المدى بين الخلايا البعيدة التي تم إنشاؤها في أوقات مختلفة: تجزؤ الخلايا العصبية الإسقاط الكالوسي الطبقة العليا إلى الجانب المقابل من القشرة الجديدة (الاستراتيجية B)
الخلايا العصبية إسقاط القشرية كالوسال موجودة في جميع أنحاء قشرة الدماغ, يجري أكثر وفرة في الطبقات العليا24. هذه الخلايا العصبية مشروع محاورها من خلال الكسوم الجسم والاتصال الخلايا المستهدفة, الخلايا العصبية الإسقاط الموجودة عبر طبقات مختلفة من القشرة اللاتينية 25,26,27. الطبقة العليا إسقاط الخلايا العصبية هي أحدث تطوريا من الخلايا العصبية طبقة أقل وتوسعت إلى حد كبير في الرئيسيات28. هذه الخلايا هي حاسمة للفكر المعقدة والمهام الجمعياتية أعلى, والاختلالات في مجموعات من الجينات التي أعرب عنها خصيصا من قبل هذه مجموعة من الخلايا قد ارتبطت مؤخرا مع التوحد29.
من أجل دراسة على وجه التحديد تفاعلات السكان الفرعية من الخلايا العصبية الإسقاط callosal الموجودة في الطبقات العليا مع الخلايا المستهدفة الموزعة في جميع أنحاء نصف الكرة الأرضية contralateral، وضعنا مزدوجة في بروتوكول كهربائي الرحم. لتسمية الخلايا المستهدفة من الطبقة العليا الخلايا العصبية الإسقاط الكالوسال قمنا به في الكهربائي الرحم في E13.5 باستخدام BFP التعبير عن plasmid(الشكل 2A-C). تم اختيار هذا العمر استراتيجيا لأنه لا يسمح فقط استهداف واسعة النطاق إسقاط القشرية العصبية السكانية بما في ذلك العديد من الخلايا العصبية طبقة-V, ولكن أيضا عدد كبير من الخلايا العصبية الموجودة في الطبقات العليا(الشكل 2C),تغطي أساسا جميع المناطق المستهدفة من الخلايا العصبية الإسقاط كالوسال من نصف الكرة الأرضية المضادة للثاليين. واستهدفت كهربائي الثانية في الجانب اللاتينية في E15.5 الطبقة العليا الطبقة الفرعية الإسقاط الخلايا العصبية (التعبير عن nEGFP وmtdTomato) (الشكل 2A،B،D)ولكن ليس الطبقة السفلى إسقاط الخلايا العصبية ولدت في سن مبكرة. ولذلك كان هناك ما يبرر الحاجة إلى كهرباء مزدوجة heterochronic بسبب الأوقات المختلفة في توليد الخلايا المتوقعة من الفائدة والخلايا التي تُخلّد بها. تلك الطبقة العليا الخلايا العصبية المستهدفة إرسال محاورها إلى نصف الكرة الأرضية contralateral مع نمط التاربوردية مميزة (الشكل 2C). ويمكن تقييم الاختلافات في هذا النمط النموذجي لخرش الانبعاثات المحوري عند اكتساب أو فقدان تجارب الوظائف في الخلايا المستهدفة باستخدام بروتوكول الكهربة المزدوج هذا. تحليل التكبير عالية يظهر بالتفصيل محاور الوسوال إينفاتينغ الخلايا العصبية الإسقاط المستهدفة في نصف الكرة الأرضية contralateral(الشكل 2E).
الشكل 1: الاستراتيجية ألف- مضاعفة في استراتيجية الكهربة الرحمية لدراسة التفاعلات الوثيقة بين الخلايا ذات الأصل المكاني والزماني المختلف. (أ) تخطيطات للبروتوكول المستخدم لاستهداف خلايا CR التي تعبر عن mCherry والخلايا العصبية الإسقاط القشرية التعبير EGFP. (B) صورة تمثيلية لقسم الإكليلية من الدماغ بعد مضاعفة الكهربائي في القشرية القشرية والقشرة الجانبي. الخلايا المستهدفة في الهات القشرية (الحمراء) تهاجر بشكل عرضي، وتملأ المنطقة الهامشية من القشرة الجديدة. الخلايا المسماة في منطقة البطين من القشرة توليد الخلايا العصبية إسقاط القشرية (الأخضر) التي تهاجر شعاعيا لدخول لوحة القشرية الوليدة. شريط مقياس = 200 ميكرومتر (C) تكبير المنطقة المُصنّعة في اللوحة B التي تعرض القشرة الجانبيّة و نوعي الخلايا التي تحمل اسم بروتوكول الإلكتروبور المزدوج. خطوط متقطعة إطار المنطقة الهامشية وطبقة القشرية. شريط مقياس = 100 μm. التكبير عالية على اليمين يظهر تفاصيل المنطقة الهامشية التي تحتوي على العمليات الرائدة ممبورة من الخلايا العصبية الإسقاط اختلطت مع الهيئات وCR خلايا العمليات. شريط مقياس = 10 μm. Ctx = القشرة; هيم = هيم القشرية؛ MZ = منطقة هامشية؛ CP = لوحة القشرية; IZ = منطقة وسيطة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الاستراتيجية ب- استراتيجية مزدوجة للكهربة لدراسة التفاعلات بعيدة المدى بين الخلايا ذات الأصل المكاني والزماني المختلف. (أ) مخطط عرض استراتيجية لاستهداف مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية إسقاط القشرية في القشرة الجديدة الجانبي بما في ذلك منطقة somatosensory في نصفي الكرة الأرضية المختلفة من قبل ضعف في كهربائي الرحم. الخلايا العصبية الإسقاط في القشرة somatosensory من نصف الكرة الأيمن المستهدفة في E13.5 أعرب BFP. الخلايا العصبية الإسقاط المستهدفة في الجانب contralateral المستهدفة في E15.5 أعرب EGFP النووية (nEGFP) والغشاء المستهدفة tdTomato (mtdTomato). (B) صورة تمثيلية لقسم الإكليلية من الدماغ الذي خضع لجراحة كهربية مزدوجة مع البلازميدات المذكورة في لوحة A. لاحظ توزيعات مختلفة من الخلايا التي تحمل علامة BFP أو nEGFP ووسمات مكثفة من محاور عصبية الطبقة العليا إسقاط كالوسال (mtdTomato) المسمى في E15.5. شريط مقياس = 500 ميكرومتر (C) صورة القشرة الومورية الموجودة في نصف الكرة الأيمن في الدماغ الكهربائي المزدوج. لاحظ التوزيع الواسع للخلايا العصبية الإسقاط (الأزرق) عبر الطبقات والإخماد الغزير للمحور المحوري كالوسال (الأحمر) القادمة من الخلايا العصبية الإسقاط المستهدفة في نصف الكرة الأرضية المقابلة. شريط مقياس = 100 ميكرومتر (D)صورة القشرة الومورية في نصف الكرة الأيسر من الدماغ الكهربائي المزدوج. لاحظ التعريب المنفصل للخلايا العصبية الإسقاط المستهدفة في الجزء العلوي من لوحة القشرية كما هو موضح في التعبير عن nEGFP (الأخضر)، فضلا عن وضع علامات حمراء غزيرة الهيئات المحيطة الخلية وجميع الإسقاطات العصبية (أحمر). شريط مقياس = 100 ميكرومتر (E) صور التكبير العالية للقشرة somatosensory في نصف الكرة الأيمن تظهر تفاصيل عن الارترومتر من المحاور كالوسال حول الخلايا العصبية الإسقاط المستهدفة. شريط مقياس = 10 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| استراتيجيه | ترتيب الكهرباء | الخلايا الهدف | المنطقة المستهدفة | حقن البطين | موقع الأقطاب الكهربائية | الجهد والبقول | Plasmids المستخدمة | عمر التحليل |
| ألف | الاولي | CR-خلية في E11.5 | كورتيكال هيم | اليسار | إيجابية في نصف الكرة الأيسر (موجهة نحو الجدار الوسيط) | 25 V، 40 مللي ثانية، 4p | CAG-mCherry | E17.5 |
| الثانيه | الخلايا العصبية الإسقاط القشرية في E13.5 | Somatosensory القشرة | اليسار | إيجابية في نصف الكرة الأيسر | 35 V، 60 مللي ثانية، 5p | CAG-EGFP | ||
| (موجهة نحو القشرة) | ||||||||
| ب | الاولي | الخلايا العصبية الإسقاط القشرية في E13.5 | Somatosensory القشرة | الحق | موجب في نصف الكرة الأيمن | 35 V، 60 مللي ثانية، 5p | CAG-BFP | P15 |
| (موجهة نحو القشرة) | ||||||||
| الثانيه | الخلايا العصبية الإسقاط القشرية في E15.5 | Somatosensory القشرة | اليسار | إيجابية في نصف الكرة الأيسر | 50 V، 80 مللي ثانية، 5p | CAG-nEGFP-2A-mTdTomato | ||
| (موجهة نحو القشرة) |
الجدول 1: موجز لظروف الكهربة المستخدمة في التجارب المختلفة.
| بقاء الأجنة بعد ضعف في الإلكتروبور الرحمي في الاستراتيجية A | |||||||||
| عدد القمامة | العدد الأولي للأجنة | عدد الأجنة التي تبقى على قيد الحياة في أول EP | عدد الأجنة الباقية على قيد الحياة في الثانية EP | النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة بعد الجيش الشعبي الأول | النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة بعد المرحلة الثانية من الحياة | النسبة المئوية لمعدل البقاء على قيد الحياة على الصعيد العالمي | |||
| 9 | العدد الإجمالي | (متوسط. القمامة ± SD) | العدد الإجمالي | (متوسط. القمامة ± SD) | العدد الإجمالي | (متوسط. القمامة ± SD) | 75% | 83.33% | 62.50% |
| 64 | 7.11 ± 2.08 | 48 | 5.33 ± 1.22 | 40 | 4.44 ± 1.01 | ||||
| عدد الأجنة المجهضة بعد EP الأول | عدد الأجنة المجهضة بعد EP الثانية | العدد الإجمالي للأجنة المجهضة | النسبة المئوية للإجهاض بعد أول EP | النسبة المئوية للإجهاض بعد المرحلة الثانية من الإجهاض* | النسبة المئوية لمعدل الإجهاض العالمي | ||||
| العدد الإجمالي | (متوسط. القمامة ± SD) | العدد الإجمالي | (متوسط. القمامة ± SD) | العدد الإجمالي | (متوسط. القمامة ± SD) | 25% | 16.66% | 37.50% | |
| 16 | 1.8 ± 1.09 | 8 | 0.88 ± 0.78 | 24 | 2.67 ± 1.32 | ||||
| * البقاء على قيد الحياة والإجهاض تحسب بالنظر إلى الأجنة التي نجت من أول كهرباء | |||||||||
الجدول 2: بقاء الأجنة بعد ضعف في الكهربة الرحمية في الاستراتيجية ألف.
| بقاء الأجنة والجراء على قيد الحياة باتباع الاستراتيجية باء (ضعف EP E13.5 و E15.5) | |||||||||||
| عدد القمامة | العدد الأولي للأجنة | عدد الأجنة التي تبقى على قيد الحياة في أول EP | عدد الجراء التي ولدت بعد ضعف الجيش الشعبي | عدد الأجنة التي تبقى على قيد الحياة عند P15 | النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة بعد الجيش الشعبي الأول | النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة بعد الجيش الشعبي الثاني | النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة عند P15 | ||||
| 8 | العدد الإجمالي | (متوسط. القمامة ± SD) | العدد الإجمالي | (متوسط. القمامة ± SD) | العدد الإجمالي | (متوسط. القمامة ± SD) | العدد الإجمالي | (متوسط. القمامة ± SD) | 88.46% | 82.69% | 55.77% |
| 52 | 6.5 ± 2 | 46 | 5.75 ± 2.05 | 43 | 5.38 ± 1.77 | 29 | 3.63 ± 1.6 | ||||
| بقاء الأجنة والجراء بعد EP واحد في E13.5 | ||||||||
| عدد القمامة | العدد الأولي للأجنة | عدد الجراء التي ولدت بعد الجيش الشعبي | عدد الأجنة التي تبقى على قيد الحياة عند P15 | النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة بعد EP | النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة عند P15 | |||
| 11 | العدد الإجمالي | (متوسط. القمامة ± SD) | العدد الإجمالي | (متوسط. القمامة ± SD) | العدد الإجمالي | (متوسط. القمامة ± SD) | 89.74% | 57.69% |
| 78 | 7.1 ± 1.64 | 70 | 6.36 ± 1.7 | 45 | 4.09 ± 2.07 | |||
الجدول 3: بقاء الجراء بعد ضعف في الإكتروليت الرحمي في الاستراتيجية باء مقارنة مع الكهربائي البسيط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
دراسة التفاعلات الخلية الخلية في الجسم الحي في المناطق ذات الكثافة الخلوية العالية مثل قشرة الدماغ مهمة معقدة. النهج التقليدية بما في ذلك استخدام الأجسام المضادة لتسمية نيوريت ليست مناسبة بسبب عدم وجود علامات محددة للسكان الخلايا المختلفة. استخدام نماذج مورين المعدلة وراثيا، حيث نوع معين من الخلايا يعبر عن بروتين الفلورسنت، مفيد لتصور العمليات العصبية، ولكن هذا يعتمد على توافر مثل هذه النماذج. هذه المهمة أكثر تعقيدا عند محاولة تصور الاختلافات المحتملة في التفاعلات بين نوعين من الخلايا معينة على الانزعاج من الجينات ذات الاهتمام، لأنه ينطوي على استخدام نماذج حيوانية أخرى، مثل الفئران خروج المغلوب. كل هذه القضايا جعلت هذه الدراسات معقدة في الماضي بسبب التكاليف الاقتصادية والزمنية.
ظهور تقنيات جديدة تسمح التغاير الجسدي في الجسم الحي، كما هو الحال في الكهربائي الرحم، يوفر إمكانية لتصميم استراتيجيات مثل تلك الموصوفة في هذا البروتوكول، والتي تتحايل على استخدام أو جيل من مراسل مجتمعة والحيوانات خروج المغلوب، مما يجعل هذا النوع من التجارب أكثر جدوى. وتبين النتائج التي تظهر في هذا المنشور والدراسات المنشورة سابقا8 أن هذا البروتوكول 1) يسمح بنجاح باستهداف مجموعات الخلايا ذات الأصل الزماني والمكاني المختلف؛ 2) يجعل من الممكن التصور من الاتصالات خلية الخلية مع دقة عالية؛ و 3) هو مفيد للكشف عن الاختلافات في اتصالات الخلية بعد التجارب الوظيفية.
على الرغم من الاستخدام الواسع للكهربية الرحمية ، تتطلب هذه التقنية تدريبًا كبيرًا من أجل إجراء الجراحة بأمان ، والتلاعب بالأجنة دون إتلافها ، وضمان الاستهداف الصحيح للمنطقة المطلوبة. ومع ذلك، بعد هذا التدريب، البقاء على قيد الحياة من الإناث الحوامل ممتازة (حوالي 100٪ في أيدينا) ونحن لم نجد أي اختلافات بين واحد ومزدوجة في الكهربائي الرحم. وحيد ومزدوجة الكهربائية الإناث الحوامل يتعافى بسرعة كبيرة من الجراحة. في الغالبية العظمى من الحالات ، وسلوكهم في اليوم التالي لعملية جراحية واحدة أو مزدوجة تبدو طبيعية وهذه الإناث الحوامل يأكلون ، ويشربون ، ويمشون ، وحتى يصعدون دون صعوبات دون علامات واضحة على الألم والضيق.
بقاء الأجنة بعد الأول والثاني الكهربائي هو أيضا جيد عموما، ومعدل الإجهاض ينخفض مع زيادة عمر الأجنة(الجدول 2 والجدول 3). الصعوبة الرئيسية هي الاستهداف الناجح في كل من الإلكتروبوريشنات. مع الأجنة الأكبر سنا من E13.5 فصاعدا درجة النجاح عالية جدا. الأعمار المبكرة مثل E11.5 هي أكثر تحديا لأن صغر حجم الأجنة يجعل التعامل بالحقن أكثر صعوبة، والتي بالإضافة إلى ذلك تؤثر على بقائها. ومع ذلك، الأجنة التي تبقى على قيد الحياة أول E11.5 الكهربائي تمثل معدلات جيدة جدا من البقاء على قيد الحياة بعد الكهربا الثانية في E13.5(الجدول 2). لتحسين الكفاءة مع هذه التقنية، نوصي بشدة ممارسة العمليات الجراحية في الجراء في ~ E14.5 وجرب تدريجيا العمليات الجراحية في سن أصغر.
وثمة تحد آخر هو البقاء على قيد الحياة بعد الولادة، لأن الأمهات اللواتي يخضعن لعملية جراحية لا يعتنين دائما بجميع الجراء، على الرغم من أن الإناث الحوامل وحيدات أو مزدوجات الصعق الكهربائي يسلمن الجراء دون مشاكل(الجدول 3)وسلوكهن وحالة اللياقة البدنية تبدو طبيعية. في أيدينا، ومع التوقيت الموصوف هنا، لا نجد أي اختلافات مهمة في البقاء على قيد الحياة بعد الولادة بعد الكهربة البسيطة ومزدوجة(الجدول 3)،ولكن للتحايل على مشاكل البقاء المحتملة يمكن نقل الجراء لرعاية الأمهات عند الولادة عندما تظهر الأمهات الحقيقيات سوء سلوك الأمهات عند الولادة. كما أن توفير مواد تعشيش إضافية وغذاء غني للإناث الحوامل قبل تاريخ الولادة يمكن أن يساعد أيضاً في زيادة معدلات البقاء على قيد الحياة للجراء.
واحدة من المزايا الرئيسية لهذه الاستراتيجية هو استخدام الفئران من النوع البري للدراسات الوظيفية، ولكن يمكن أيضا أن تطبق، على سبيل المثال، على الفئران مراسل CRE أو الفئران مفجّرة للجينات ذات الأهمية، عندما تكون متاحة. في هذه الفئران، فإن كهربية CRE-recombinase التعبير عن البلازميدات سيسمح التعبير الدائم للجين مراسل أو تعطيل الجين المطلوب، على التوالي، في الخلايا المستهدفة. للتجارب الوظيفية يمكننا أيضا السيطرة على التعبير عن بناء فقط في نوع الخلية من الفائدة. على سبيل المثال، يمكن استخدام مروج الخلايا العصبية للتلاعب بجين مرشح فقط في الخلايا العصبية وليس في الخلايا الجذعية العصبية، وبالتالي منع الآثار غير المرغوب فيها على مستوى السلف. كل هذه الاعتبارات، جنبا إلى جنب مع السيطرة على الوقت والمنطقة المستهدفة، وجعل مزدوجة في الكهربائي الرحم تقنية متعددة جدا لدراسة التفاعلات الخلية الخلية ليس فقط داخل القشرة ولكن أيضا في الهياكل الأخرى التي يمكن استهدافها باستخدام هذه التكنولوجيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفان كريستينا أندريس كاربونيل وأعضاء مرفق العناية بالحيوانات التابع جامعة فالنسيا على المساعدة التقنية. كما نود أن نشكر إيزابيل فارينايس وساكرامنتو ر. فيرون على الكواشف وتبادل معداتها معنا. يتم تمويل I.M.W من خلال عقد Garantía Juvenil من Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221) ، يتم تمويل D.dA.D من قبل وزير دي سيسيليا ، Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz حاصل على منحة رامون إي كاجل (RYC-2015-19058) من وزير الإسبانية دي سينسيا، Innovación y Universidades (MICINN). تم تمويل هذا العمل RYC-2015-19058 و SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
