Summary
Die doppelte Utero-Elektroporation ermöglicht die Ausrichtung auf Zellpopulationen, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Diese Technik ist nützlich, um Wechselwirkungen zwischen diesen Zellpopulationen mit fluoreszierenden Proteinen unter normalen Bedingungen, aber auch nach funktionellen Experimenten zu visualisieren, um Gene von Interesse zu stören.
Abstract
In der Utero-Elektroporation ist eine In-vivo-DNA-Transfertechnik, die ausgiebig zur Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen verwendet wird, die der Kortikogenese von Säugetieren zugrunde liegen. Dieses Verfahren nutzt die Hirnventrikel, um die Einführung von DNA von Interesse zu ermöglichen und verwendet ein Paar Von Elektroden, um den Eingang des genetischen Materials in die Zellen zu lenken, die die Herzkammer, die neuronalen Stammzellen auskundschaften. Diese Methode ermöglicht es Forschern, die gewünschten Zellen zu kennzeichnen und/oder die Expression von Genen zu manipulieren, die für diese Zellen von Interesse sind. Es hat mehrere Anwendungen, einschließlich Assays, die auf neuronale Migration, Linienverfolgung und axonale Pfadfindung abzielen. Ein wichtiges Merkmal dieser Methode ist ihre zeitliche und regionale Kontrolle, die die Umgehung potenzieller Probleme im Zusammenhang mit embryonaler Letalität oder dem Fehlen spezifischer CRE-Treibermäuse ermöglicht. Ein weiterer relevanter Aspekt dieser Technik ist, dass sie dazu beiträgt, die wirtschaftlichen und zeitlichen Einschränkungen, die die Erzeugung neuer Mauslinien beinhalten, erheblich zu reduzieren, die besonders wichtig für die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Zelltypen werden, die in entfernten Bereichen des Gehirns in unterschiedlichen Entwicklungszeiten entstehen. Hier beschreiben wir eine Doppelelektroporationsstrategie, die die Ausrichtung von Zellpopulationen ermöglicht, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Mit diesem Ansatz können wir verschiedene Subtypen von Zellen an verschiedenen Orten mit ausgewählten fluoreszierenden Proteinen kennzeichnen, um sie zu visualisieren, und/oder wir können Gene von Interesse manipulieren, die von diesen verschiedenen Zellen zu den entsprechenden Zeiten ausgedrückt werden. Diese Strategie erhöht das Potenzial der in utero Elektroporation und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Verhalten von zeitlich und räumlich getrennten Zellpopulationen zu untersuchen, die migrieren, um enge Kontakte zu knüpfen, sowie langfristige Interaktionen durch axonale Projektionen, wodurch zeitliche und wirtschaftliche Kosten reduziert werden.
Introduction
Die Großhirnrinde ist eine sehr komplexe und kompliziert organisierte Struktur. Um einen solchen Organisationsgrad zu erreichen, durchlaufen kortikale Projektionsneuronen komplexe Entwicklungsprozesse, die ihre zeitliche Generierung erfordern, die Migration zum endgültigen Bestimmungsort in der kortikalen Platte und die Etablierung von Kurz- und Langstreckenverbindungen1,2. Lange Zeit basierte die klassische Art, Die Kortikogenese zu studieren, auf der Verwendung von Knockout- oder Knock-in-Murine-Modellen von Genen von Interesse. Diese Strategie, insbesondere die Verwendung von bedingten Knockout-Mäusen, ist jedoch zeitaufwändig und teuer und wirft manchmal zusätzliche Probleme hinsichtlich der Existenz genetischer Redundanz oder des Fehlens spezifischer CRE-Treiber auf, unter anderem. Einer der Ansätze, die entstanden, um zu versuchen, diese Probleme anzugehen, und das wird heutzutage ausgiebig verwendet, um die kortikale Entwicklung zu studieren, ist in der Utero-Elektroporation3,4. In der Utero-Elektroporation ist eine Technik für die somatische Transgenese verwendet, die in vivo Targeting von neuronalen Stammzellen und ihre Nachkommen ermöglicht. Diese Methode kann verwendet werden, um Zellen durch die Expression von fluoreszierenden Proteinen5,6, für Genmanipulation in vivo (d.h. Gewinn oder Verlust von Funktionsassays)7,8,9, zur Isolierung elektropoierter Kortiken in vitro und Kultivierungszellen8,10. Darüber hinaus ermöglicht die In-Utero-Elektroporation eine zeitliche und regionale Kontrolle des Zielgebiets. Diese Technik hat zahlreiche Anwendungen und wurde weit verbreitet, um neuronale Migration zu studieren, Stammzellteilung, neuronale Konnektivität, und andere Themen8,9,11,12.
Das aktuelle Manuskript beschreibt die Verwendung einer in utero Elektroporation Variante, die als Doppelin der Utero-Elektroporation bezeichnet wird, um die Wechselwirkungen von Zellen in der Großhirnrinde mit unterschiedlichen zeitlichen und räumlichen Ursprüngen zu analysieren. Diese Studien sind äußerst komplex, wenn sie murine Modelle verwenden, da sie die kombinierte Verwendung mehrerer transgener Linien erfordern. Einige der Anwendungen des protokolls, das in diesem Papier beschrieben wird, umfassen die Untersuchung enger Wechselwirkungen zwischen benachbarten Zellen sowie Wechselwirkungen zwischen entfernten Zellen durch weiträumige Projektionen. Die Methode erfordert die Durchführung von zwei unabhängigen in utero Elektroporation Operationen, zeitlich und räumlich getrennt, auf den gleichen Embryonen, um verschiedene Zellpopulationen von Interesse zu zielen. Der Vorteil dieses Ansatzes ist die Möglichkeit, die Genfunktion in einer oder beiden Arten von Neuronen mit Wildtieren zu manipulieren. Darüber hinaus können diese funktionellen Experimente mit der Expression von zytoplasmatischen oder membrangetaggten fluoreszierenden Proteinen kombiniert werden, um die feine Morphologie von Zielzellen, einschließlich Dendriten und Axonen, zu visualisieren und mögliche Unterschiede in zellulären Wechselwirkungen im Vergleich zu einer Kontrolle zu analysieren (d. h. Zellen, die nur mit dem fluoreszierenden Protein gekennzeichnet sind).
Das hier abgegrenzte Protokoll konzentriert sich auf die Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen innerhalb des Neocortex, aber diese Strategie könnte auch verwendet werden, um Wechselwirkungen mit extrakortikalen Bereichen zu untersuchen, die mit Hilfe der Uteroelektroporation, wie dem Subpallium oder dem Thalamus13,,14, oder Zell-Zell-Wechselwirkungen in anderen Strukturen, wie dem Kleinhirn15, gezielt betrachtet werden können. Die Ausrichtung auf verschiedene Bereiche basiert auf der Ausrichtung der Elektroden und auf dem Ventrikel, in dem die DNA injiziert wird (lateral, dritte oder vierte). Mit der hier beschriebenen Strategie können wir eine beträchtliche Anzahl von Zellen kennzeichnen, was nützlich ist, um allgemeine Veränderungen der Konnektivität/Innervation in funktionellen Experimenten zu bewerten. Dennoch, um feine Veränderungen in der Konnektivität zu untersuchen, kann man modifizierte Versionen der Utero-Elektroporation verwenden, um eine spärlichere Beschriftung zu erhalten und einzelne Zellen zu identifizieren16. Zusammenfassend ist die Doppel-Elektroporation eine vielseitige Methode, die es ermöglicht, zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzusprechen und ihre Wechselwirkungen im Detail zu untersuchen, entweder unter Kontrollbedingungen oder in Kombination mit funktionellen Experimenten, wodurch die zeitlichen und wirtschaftlichen Kosten erheblich reduziert werden.
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Protocol
Das hier beschriebene Verfahren wurde von der für Experimente zuständigen Ethikkommission, den Tierschutz der Universidad de Valencia und der Conselleria de Agricultura genehmigt. Desarrollo Rural, Emergencia Climética y Transicién Ecoléngica der Comunidad Valenciana und hält sich an die Leitlinien des Internationalen Rates für Labortierkunde (ICLAS), die im Real Decreto 53/2013 der spanischen Gesetzgebung sowie in der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates überprüft wurden.
HINWEIS: Dieses Protokoll umfasst zwei verschiedene Zwecke: 1) die erste Studie, die als "Strategie A" bezeichnet wird, ermöglicht die Analyse der Wechselwirkungen zwischen Cajal-Retzius-Zellen (CR-Zellen) und frühgeborenen kortikalen Projektionsneuronen innerhalb derselben Gehirnhälfte; 2) Die zweite Studie, "Strategie B", wird durchgeführt, um die Innervation der oberen Schicht der kalosalen Projektionsneuronen auf die kontralaterale Seite des Neokortex zu untersuchen.
1. Prächirurgie Präparation
- DNA-Vorbereitung
- Chemisch oder elektrokompetente E. coli DH5-Zellen mit den von Interesse interessierten Plasmiden transformieren, mit dem entsprechenden Antibiotikum auf LB-Agarplatten plattieren und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Alle hier verwendeten Plasmide enthalten den allgemeinen Promotor für Huhn-Actin (CAG), der die Expression eines Fluoreszenz-Reporter-Proteins (CAG-mCherry und CAG-EGFP für Strategie A und CAG-BFP und CAG-nEGFP-2A-mtdTomato für Strategie B) vorantreibt. Alle von ihnen enthalten Resistenz gegen Ampicillin (AMP). - Wählen Sie einzelne Kolonien aus jeder Plasmidtransformation und initiieren Sie eine Starterflüssigkeitskultur in 2 ml Luria-Brühe + Ampicillin (LB+AMP) in Bakterienkulturröhren während 3x4 h bei 37 °C mit kräftigem Schütteln (200 U/min). Danach eine größere Bakterienkultur in einem 500 ml ErlenmeyerKolben setzen, der 200 ml LB+AMP und 1 ml der Starterkultur hinzufügt. Über Nacht bei 37 °C im Orbital-Shaker bei 200 Umdrehungen/min inkubieren.
- Verwenden Sie ein endotoxinfreies Maxi-Prep-Kit (Materialtabelle), das den Anweisungen des Herstellers folgt, um reine und konzentrierte Plasmid-DNA aus den flüssigen Kulturen zu erhalten. Setzen Sie die DNA in einem endotoxinfreien Tris-EDTA-Puffer (TE) um 50 bis 100 L, um Konzentrationen von mindestens 5 g/l zu erhalten.
- Für jede Operation eine Lösung mit einem Endvolumen von 10 l, die 1 l schnellen grünen Farbstoff, Plasmid-DNA-Lösung von Interesse für eine Endkonzentration von 1 g / l für jedes Plasmid, und Endotoxin-freie TE-Puffer enthalten. Mischen Sie z. B. 1 l schnellen grünen Farbstoff, 2 l einer 5-g/l-Plasmid-DNA-Lösung und 7 l TE-Puffer.
- Chemisch oder elektrokompetente E. coli DH5-Zellen mit den von Interesse interessierten Plasmiden transformieren, mit dem entsprechenden Antibiotikum auf LB-Agarplatten plattieren und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Pipette ziehen
- Ziehen Sie Borosilikatglaskapillaren (1/0,58 mm Außen-/Innendurchmesser) in einen vertikalen Mikropipettenzieher, bis die Spitze eine Länge von 1 x 1,5 cm erreicht, und trimmen Sie sie mit Sezieren von Zangen in einem Winkel von ca. 30° unter einem Trennbereich.
- Einrichtung des Operationssaals
- Legen Sie alle Geräte auf den Operationstisch (d. h. Pinzette, Schere, Zange, Mikropipetten, Nadel und Nadelhalter). Schalten Sie das Heizkissen ein und bedecken Sie es mit einem sterilen chirurgischen Absorptionspad. Stellen Sie sicher, dass das Reservoir in der Maschine zur Inhalationsanästhesie mit Isofluran gefüllt ist, der Sauerstofftank genügend Sauerstoff enthält und das System ordnungsgemäß funktioniert.
HINWEIS: Der Operationssaal und das widerstandsfähige Material müssen so steril wie möglich gehalten werden (d. h. das gesamte Material muss vor der Operation autoklaviert und die Oberflächen müssen mit 70% Ethanol desinfiziert werden). Platinelektroden müssen zuerst sorgfältig mit keimtötender Seife und zweitens mit 70% Ethanol vor der Operation desinfiziert werden. - 100 ml 0,9% (w/v) sterile, mit Penicillin-Streptomycin 1:100 enthaltende sterile Salinelösung zubereiten und eine 10 cm Petrischale füllen. Legen Sie die Platte auf das beheizte Pad, um die Lösung aufzuwärmen.
- Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit 150 l einer schmerzstillenden Lösung (z. B. 0,1 mg/kg Buprenorphin).
- Beladen Sie die gezogene Pipette mit 5 l der endgültigen Plasmid-DNA-Lösung, die in Schritt 1.1.4 hergestellt wurde. Schließen Sie die Kapillare an ein mundgesteuertes Aspiratorrohr an.
- Legen Sie alle Geräte auf den Operationstisch (d. h. Pinzette, Schere, Zange, Mikropipetten, Nadel und Nadelhalter). Schalten Sie das Heizkissen ein und bedecken Sie es mit einem sterilen chirurgischen Absorptionspad. Stellen Sie sicher, dass das Reservoir in der Maschine zur Inhalationsanästhesie mit Isofluran gefüllt ist, der Sauerstofftank genügend Sauerstoff enthält und das System ordnungsgemäß funktioniert.
2. Zuerst in der Utero-Elektroporation-Chirurgie
- Legen Sie eine E11.5 (Strategie A) oder E13.5 (Strategie B) C57BL/6 schwangere Maus in eine geschlossene Induktionskammer mit 2,5% (v/v) Isofluran bei 0,8 L/min und warten Sie, bis sie anästhesiert ist. Übertragen Sie die Maus auf das Heizkissen und legen Sie seine Nase in eine Maske für die konstante Lieferung von Isofluran. Prüfen Sie, ob kein Pedalreflex als Indikator für eine richtige Anästhesie angezeigt wird.
HINWEIS: Dase-mbryonic-Alter wird basierend auf dem Tag bestimmt, an dem der Vaginalstecker beobachtet wird (E0.5). - Injizieren Sie das schwangere Weibchen mit der analgetischen Lösung (0,1 mg/kg Buprenorphin) subkutan. Um zu verhindern, dass die Augen während des Eingriffs trocknen, tragen Sie einen Tropfen Augensalbe in jedem Auge mit einem Wattestäbchen auf.
- Rasieren Sie den Bauchbereich der Maus mit einem elektrischen Rasiermesser und waschen Sie ihn 2x mit 70% (v/v) Ethanoltüchern, einmal mit Jodtüchern und ein letztes Mal mit einem Ethanol-Wischtuch.
- Verwenden Sie eine Schere, um einen 30 mm langen Schnitt durch die Haut in der rechten Seite des Tieres zu machen und trennen Sie vorsichtig die angrenzende Haut vom Muskel mit einem stumpfen Spachtel. Danach einen zweiten Schnitt in der Bauchwand machen.
- Bedecken Sie den Bauch mit einem Stück gefaltetem Tissuepapier, das zuvor mit 70 % Ethanol desinfiziert wurde und einen 40 mm langen Schlitz in der Mitte enthält. Ziehen Sie die Gebärmutter vorsichtig mit Ringzangen aus der Bauchhöhle.
HINWEIS: Die Gebärmutter muss mit der warmen Herz-Saline-Lösung, die in Schritt 1.3.2 während des gesamten Verfahrens zubereitet wird, nass gehalten werden. - Vorbeladung der gezogenen Pipetten mit der in Schritt 1.1.4 hergestellten DNA-Lösung. Injizieren Sie mit dem mundgesteuerten Aspiratorrohr 0,5 L der DNA-Lösung pro Embryo in den seitlichen Ventrikel der ausgewählten Hemisphäre, bis der schnelle grüne Farbstoff im Ventrikel spürbar ist.
- Platzieren Sie Zangen-Typ Platinelektroden seitlich um den Kopf des injizierten Embryos (siehe Abbildung 1A und Abbildung 2A). Richten Sie die Elektroden so aus, dass sie auf die gewünschte Hirnregion abzielen. Richten Sie den positiven Pol zur medialen Wand, um den kortikalen Saum (Strategie A) zu elektroporatieren, oder auf den seitlichen Kortex (Strategie B), um die in diesem Bereich erzeugten Zellen zu kennzeichnen.
HINWEIS: In allen Fällen müssen Herz und Plazenta vermieden werden, um das überleben zu gewährleisten. - Wenden Sie die spezifische Abfolge elektrischer Impulse mit einem quadratischen Wellenelektroporator nach den in Tabelle 1 dargestellten Indikationen an (Strategie A E11.5 Embryonen: vier Impulse von 25 V und 40 ms, getrennt durch 950 ms Intervalle; Strategie B E13.5 Embryonen: fünf Impulse von 35 V und 60 ms, mit 950 ms Intervallen).
- Legen Sie die Gebärmutter vorsichtig mit Zangen wieder in die Bauchhöhle, füllen Sie sie mit warmer Herzlösung und schließen Sie die Bauchwand mit einer Nadel 6-0 Naht. Verbinden Sie die beiden Seiten des anfänglichen Schnitts in der Haut entweder mit einer Nadel 6-0 Naht oder Naht-Clips.
- Halten Sie das Tier auf dem Heizkissen und überwachen Sie es bis zu seiner Genesung von der Anästhesie. Geben Sie eine zusätzliche Dosis Analgesie (150 l) in einer Hydrogellösung in ihrem Hauskäfig an.
- 24 Stunden nach der Operation eine zusätzliche Dosis Analgesie (150 l) verabreichen. Setzen Sie die tägliche Überwachung durch visuelle Inspektion auf mögliche Schmerzen und Beschwerden fort. Beobachten Sie das Verhalten des Tieres, testen Sie seine normalen Hinterbeinenreflexe und inspizieren Sie die Naht auf mögliche Anzeichen von Schäden durch Lecken oder Kratzen der Wunde.
3. Zweite in der Utero-Elektroporation
- Wiederholen Sie zwei Tage nach der ersten Operation die Schritte 2.1-2.3. Obwohl die Genesung von schwangeren Frauen nach der Operation sehr gut ist, überprüfen Sie, ob sie normales Verhalten zeigen und keine Anzeichen von Schmerzen oder Not zeigen, bevor Sie die zweite Operation durchführen (E13.5 Embryonen für Strategie A und E15.5 für Strategie B).
- Machen Sie einen 30 mm langen Schnitt durch die Haut wie in Schritt 2.4 und einen zweiten Schnitt an der Bauchwand, diesmal in der linken Seite des Tieres. Bedecken Sie die Gebärmutter vorsichtig auf einem desinfizierten Gewebe, wie in Schritt 2.5 beschrieben.
HINWEIS: Achten Sie darauf, den zuvor auf der anderen Seite gemachten Schnitt nicht zu stören. - Injizieren Sie etwa 0,5 l pro Embryo der DNA-Lösung in den seitlichen Hirnventrikel der Hemisphäre, die zuvor im Falle von Strategie A und in den lateralen Hirnventrikel der kontralateralen Hemisphäre für Strategie B elektropoiert wurde.
HINWEIS: Verwenden Sie nur Embryonen, die eine normale Entwicklung zeigen und keine Anzeichen einer Reabsorption zeigen. - Legen Sie die Elektroden um den Kopf des Embryos um, wie in Schritt 2.7 beschrieben, richten Sie die positive Elektrode auf den lateralen Kortex und wenden Sie die entsprechenden Impulse nach den in Tabelle 1 gezeigten Indikationen an (Strategie A E13.5 Embryonen: fünf Impulse von 35 V und 60 ms getrennt durch 950 ms Intervalle; Strategie B E15.5 Embryonen: fünf Impulse von 50 V und 80 ms getrennt durch 950 ms Intervalle).
- Fahren Sie fort und beenden Sie die Operation, wie in den Schritten 2.8-2.10 beschrieben.
4. Gewebeernte und -schnitt
- Strategie A
- Vier Tage nach der zweiten Elektroporation (E17.5) führen Sie eine zervikale Dislokation des schwangeren Weibchens durch und legen Sie sie in eine Supine-Position.
- Mit einer Schere, machen Sie einen ventralen Schnitt, um die Gebärmutterhörner zu extrahieren und mit Zangen legen Sie sie in einer Petrischale gefüllt mit 1x Phosphat-gepufferte Saline (PBS) auf Eis gelegt.
HINWEIS: Die niedrige Temperatur macht die Anästhesisierung der Embryonen möglich. - Mit einer Pinzette die Embryonen aus dem Fruchtwassersack extrahieren und mit Zangen in eine neue PBS-gefüllte Petrischale unter einem sezierenden Bereich übertragen. Halten Sie vorsichtig den Kopf der Embryonen mit Zangen und führen Sie Hirnsektion mit Pinzette, um zuerst die Haut über den Kopf und dann den Schädel zu entfernen. Verwenden Sie einen Spachtel, um die exponierten Gehirne herauszuziehen.
- Sammeln Sie die Gehirne mit einem Löffel und legen Sie sie in einer 48-Well-Platte mit der fixativen Lösung gefüllt (4% [w/v] Paraformaldehyd [PFA] in 1x PBS). Testen Sie sofort auf das erfolgreiche Ergebnis beider Elektroporationen, indem Sie beispielsweise die Gehirne mit einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop untersuchen.
- Fixieren Sie die embryonalen Gehirne über Nacht bei 4 °C in einem Orbital-Shaker. Waschen Sie mit 1x PBS, um Spuren von PFA zu beseitigen. Dann auf PBS mit Antimykotika (1x PBS-0.05% (w/v) Natriumazid) übertragen.
VORSICHT: PFA und Natriumazid sind zytotoxische Verbindungen, die während ihrer Verwendung besondere Vorsichtsmaßnahmen erfordern. - Die fixierten Gehirne in 4% (w/v) niedriger Schmelzpunkt Agarose in 1x PBS einbetten und 10 min warten, bis es sich erstarrt. Kleben Sie sie auf den Vibram-Gewebehalter mit Cyanoacrylatkleber mit den olfaktorischen Glühbirnen nach oben zeigen, um koronale Abschnitte zu erhalten.
- Initiieren Sie das Vibratome und wählen Sie die gewünschten Parameter aus: 100 m Breite, 0,60 m/s Geschwindigkeit und 0,60 mm Amplitude.
- Sichern Sie das Gehirn im Vibram-Behälter, füllen Sie es mit 1x PBS-Lösung, und beginnen Sie, koronare serielle Abschnitte mit Hilfe einer Bürste in einer 48-Well-Platte zu sammeln, die mit 1x PBS-0,05% (w/v) Natriumazid gefüllt ist, um eine vollständige Darstellung des Gehirns zu erhalten (z. B. etwa sieben Abschnitte pro Brunnen und sechs Brunnen pro Embryo).
- Montieren Sie die gewünschten Abschnitte in Mikroskopglasschlitten mit einer feinen Bürste. Bedecken Sie sie mit Glasabdeckungen. Für die langfristige Lagerung hinzufügen Montagemedium, das Photobleichungen und Photooxidation verhindert. Beobachten Sie die Dias unter einem aufrechten Epifluoreszenzmikroskop, um die Wirksamkeit der Elektroporation zu bewerten.
- Strategie B
- Lassen Sie die Welpen, die zuvor mit E13.5 und E15.5 elektropoiert wurden, geboren werden und warten Sie bis P15, um die transkardiale Perfusion mit der gleichen fixativen Lösung durchzuführen, die in Schritt 4.1.4 verwendet wird.
- Kurz vor der Perfusion eine Dosis von 75/1 mg/kg Ketamin/Medetomidin intraperitoneal zu verabreichen. Wenn der Pedalreflex verloren geht, sichern Sie die Maus in einer Supine-Position und machen Sie einen ventralen Schnitt nach der Mittellinie mit einer Schere, um sowohl den Rippenkäfig als auch die Membran freizulegen.
- Schneiden Sie die Membran und öffnen Sie den Rippenkäfig, um Zugang zum Herzen zu erhalten. Halten Sie den Rippenkäfig mit einem Hämostat und machen Sie einen Schnitt in den rechten Vorhof mit feiner Schere.
- Durchdringen Sie den linken Ventrikel mit einer Nadel, die mit einem flexiblen Rohr mit einer peristaltischen Perfusionspumpe verbunden ist. Beginnen Sie die transkardiale Perfusion und liefern Sie mindestens 25 ml 4% PFA bei einem konstanten Fluss von 5,5 ml/min (Gesamtzeit von 5 min).
- Sezieren Sie das Gehirn von durchfundierten Tieren. Zuerst entfernen Sie die Haut über dem Kopf mit Schere und Zange. Beginnen Sie, den Schädel mit einer Schere zu schneiden und ziehen Sie sorgfältig Teile der Schädelknochen ab, bis sie vollständig entfernt sind. Schließlich extrahieren Sie das Gehirn mit Hilfe eines Spachtels.
- Übertragen Sie die Gehirne auf eine 24-Well-Platte und fixieren Sie sie mit 4% PFA über Nacht bei 4 °C auf einem Orbital-Shaker. Beenden Sie die Fixierung, indem Sie PFA durch 0,05% (w/v) Natriumazid in PBS ersetzen.
HINWEIS: Wie in Schritt 4.1.5 angegeben, ist es ratsam, eine Zwischenwäsche mit 1x PBS durchzuführen. - Wiederholen Sie die Schritte 4.1.6-4.1.9, indem Sie die Vibramme-Parameter für postnatale Gehirne ändern (40 m Breite, 1,20 m/s Geschwindigkeit und 0,5 mm Amplitude).
HINWEIS: Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz kann durchgeführt werden, um bestimmte Zellmarker zu erkennen oder das Signal von fluoreszierenden Proteinen, die in der Elektroporation verwendet werden, zu verbessern.
5. Konfokale Fluoreszenz-Bildgebung und -analyse
- Schalten Sie das konfokale Mikroskop ein, legen Sie die Mikroskopschlitten mit den montierten Hirnabschnitten auf den Mikroskop-Diahalter und wählen Sie die Kanäle aus, an denen Fluoreszenzbilder aufgenommen werden sollen (d. h. 420 x 460 nm für BFP, 490-540 nm für GFP und 570-620 nm für mCherry und tdTomato).
- Führen Sie Beispielscans durch, um Kartenbilder jedes Gehirnabschnitts mit zwei verschiedenen Wellenlängen für eine allgemeine Ansicht des doppelten Elektroporationsausgangs zu erhalten. Nach der Fertigstellung wählen Sie das 10-fache Objektiv und den Multi-Area-Z-Stack-Zeitraffer-Beobachtungsmodus aus. Dies ermöglicht die programmierung der automatischen Erfassung von Fluoreszenzbildern bei verschiedenen XYZ-Lokalisierungen innerhalb von Gehirnabschnitten.
- Legen Sie in jedem der ausgewählten Regionen (XY) die richtigen Bildparameter (d. h. Laserintensität, Photomultiplierempfindlichkeit und eine Mindestauflösung von 1.024 x 1.024) sowie die Tiefe des Scannens (Z) entsprechend den Ebenen der Probe fest, in denen die Fluoreszenz sichtbar ist.
- Erhalten Sie Bilder mit geringer Vergrößerung (10x) aller ausgewählten Regionen und exportieren Sie sie mit der Mikroskop-Viewer-Software vom OIF in das TIFF-Format.
- Wechseln Sie zur 60-fachen Linse, wiederholen Sie Schritt 5.3 und erfassen Sie Bilder mit hoher Vergrößerung, um die Zell-Zell-Wechselwirkungen detaillierter zu beobachten. Exportieren Sie sie wie in Schritt 5.4 angegeben.
- Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder mit jeder Bildverarbeitungssoftware (z. B. Fidschi) zur weiteren Analyse.
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Representative Results
Wechselwirkungen zwischen benachbarten Zellen entstanden an distalen Orten und zu verschiedenen Zeiten: Cajal-Retzius-Zellen (CR-Zellen) und früh wandernde kortikale Projektionsneuronen (Strategie A)
Die Wechselwirkung von CR-Zellen und frühen kortikalen Projektionsneuronen wurde zuvor als notwendig beschrieben, um die somale Translokation über Nectin- und Cadherinadhäsionsmoleküle mit einer Doppelelektroporationsstrategie zu regulieren8. CR-Zellen stammen aus dem Neuroepithel an den Rändern des Palliums und wandern tangential, um den oberflächlichsten Teil des Kortex, die Randzone17,18,19, zu bevölkern, während kortikale Projektionsneuronen in der proliferativen Zone der Großhirnrinde erzeugt werden und radial in die entstehende kortikale Platte20wandern. Es gibt einen zeitlichen Unterschied in der Generierung beider Zelltypen. CR-Zellen werden in sehr frühen embryonalen Stadien aus E10.521,22 erzeugt und kortikale Projektionsneuronen, die durch somale Translokation migrieren, werden aus E12.5–E13.523geboren. Mit doppelter In-Utero-Elektroporation ermöglicht der zeitliche Spalt zwischen den Operationen CR-Zellen, die auf E11.5 an einem seiner Ursprungsorte (dem kortikalen Saum) ausgerichtet sind, die Grenzzone des lateralen Neocortex einschließlich des somatosensorischen Bereichs rechtzeitig zu erreichen, um Kontakte mit kortikalen Projektionsneuronen zu knüpfen, die mit E13.5 beschriftet sind (Abbildung 1A,B). Die führenden Prozesse von Projektionsneuronen, die verbessertes GFP (EGFP) exprimieren, verankern sich in der Randzone des Kortex reichlich und vermischen sich mit den Prozessen von CR-Zellen, die mCherry ausdrücken (Abbildung 1C). Funktionelle Experimente haben gezeigt, dass die Störung von Zell-Zell-Adhäsionsmolekülen, die durch Projektionsneuronen oder CR-Zellen exprimiert werden, die Arborisierung ihrer Prozesse als Folge veränderter Kontakte zwischen beidenZelltypen8 beeinflusst.
Langfristige Wechselwirkungen zwischen distalen Zellen, die zu unterschiedlichen Zeiten erzeugt werden: Innervation von kalosalen Projektionsneuronen der oberen Schicht zur kontralateralen Seite des Neokortex (Strategie B)
Kalosale kortikale Projektionneuronen sind in der gesamten Großhirnrinde vorhanden, häufiger in den oberen Schichten24. Diese Neuronen projizieren ihre Axone durch den Corpus callosum und kontaktieren ihre Zielzellen, Projektionsneuronen, die sich über die verschiedenen Schichten des kontralateralen Kortex 25,26,27befinden. Obere Schicht Projektion Neuronen sind evolutionär neuer als niedrigere Schicht Neuronen und wurden stark erweitert bei Primaten28. Diese Zellen sind entscheidend für komplexes Denken und höhere assoziative Aufgaben, und Dysfunktionen in Gruppen von Genen speziell durch diese Population von Zellen exprimiert wurden vor kurzem mit Autismus29in Verbindung gebracht.
Um die Wechselwirkungen der Subpopulation von kalosalen Projektionsneuronen, die sich in den oberen Schichten befinden, mit ihren Zielzellen, die über die kontralaterale Hemisphäre verteilt sind, gezielt zu untersuchen, haben wir ein doppeltes in utero Elektroporationsprotokoll entwickelt. Um die Zielzellen der kalosalen Projektionsneuronen der oberen Schicht zu kennzeichnen, führten wir eine Utero-Elektroporation bei E13.5 mit einem BFP-Exzid-Exzid durch (Abbildung 2A-C). Dieses Alter wurde strategisch gewählt, weil es nicht nur die Ausrichtung auf eine breite kortikale Projektionneuronenpopulation mit vielen Schicht-V-Neuronen ermöglicht, sondern auch eine beträchtliche Anzahl von Neuronen, die sich in den oberen Schichten befinden (Abbildung 2C), im Grunde alle Zielbereiche von kalosalen Projektionsneuronen aus der kontralateralen Hemisphäre abdeckt. Eine zweite Elektroporation in der kontralateralen Seite bei E15.5 zielte auf die subpopulation der oberen Schicht der kalosalen Projektionsneuronen (ausdrückend nEGFP und mtdTomato) (Abbildung 2A,B,D), aber nicht auf die in früheren Jahren geborenen Neuronen der unteren Schicht. Die Notwendigkeit einer heterochronischen Doppelelektroporation war daher aufgrund der unterschiedlichen Zeiten bei der Erzeugung der projizierten Zellen von Interesse und der von ihnen innervierten Zellen gerechtfertigt. Diese gezielten Neuronen der oberen Schicht schicken ihre Axone auf die kontralaterale Hemisphäre mit einem charakteristischen Arborisierungsmuster (Abbildung 2C). Unterschiede in diesem typischen axonalen Arborisierungsmuster könnten bei Gewinn oder Verlust von Funktionsexperimenten in Zielzellen mit diesem Doppelelektroporationsprotokoll bewertet werden. Die Analyse der hohen Vergrößerung zeigt im Detail die kalosalen Axone, die gezielte Projektionsneuronen in der kontralateralen Hemisphäre innervierend sind (Abbildung 2E).
Abbildung 1: Strategie A. Doppel in der Utero-Elektroporation-Strategie, um enge Wechselwirkungen zwischen Zellen mit unterschiedlichem räumlichen und zeitlichen Ursprung zu untersuchen. (A) Schemata des Protokolls, das verwendet wird, um CR-Zellen zu zielen, die mCherry und kortikale Projektionsneuronen exezieren, die EGFP exdrücken. (B) Repräsentatives Bild eines koronalen Schnitts eines Gehirns nach doppelter Elektroporation im kortikalen Saum und im lateralen Kortex. Zellen, die im kortikalen Saum (rot) angegriffen werden, wandern tangential und bevölkern die Randzone des Neocortex. Beschriftete Zellen in der ventrikulären Zone des Kortex erzeugen kortikale Projektionsneuronen (grün), die radial in die entstehende kortikale Platte wandern. Skala bar = 200 m. (C) Vergrößerung des in Panel B geboxten Bereichs, der den lateralen Kortex und die beiden nach dem Doppelelektroporationsprotokoll beschrifteten Zelltypen anzeigt. Gestrichelte Linien umrahmen die Randzone und die Kortikalplatte. Skala bar = 100 m. Hohe Vergrößerung auf der rechten Seite zeigt ein Detail der Grenzzone, die die arborisierten führenden Prozesse der Projektionsneuronen enthält, die mit CR-Zellenkörpern und -Prozessen vermischt sind. Skala bar = 10 m. Ctx = Kortex; Saum = kortikaler Saum; MZ = Randzone; CP = kortikale Platte; IZ = Zwischenzone. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Strategie B. Doppelelektroporationsstrategie zur Untersuchung von Langzeitinteraktionen zwischen Zellen mit unterschiedlichem räumlichen und zeitlichen Ursprung. (A) Schema, das die Strategie zeigt, verschiedene Populationen kortikaler Projektionsneuronen im lateralen Neocortex einschließlich des somatosensorischen Bereichs in verschiedenen Hemisphären durch doppelte Utero-Elektroporation ins Visier zu nehmen. Projektionneuronen im somatosensorischen Kortex der rechten Hemisphäre, die auf E13.5 exprimiertes BFP ausgerichtet sind. Gezielte Projektionsneuronen auf der kontralateralen Seite, die auf E15.5 exprimierte semitische EGFP (nEGFP) und membrangezielte tdTomato (mtdTomato) ausgerichtet sind. (B) Repräsentatives Bild eines koronalen Abschnitts eines Gehirns, der sich einer doppelten Elektroporationsoperation mit den genannten Plasmiden in Panel Aunterzogen hat. Beachten Sie die unterschiedlichen Verteilungen der zellen, die durch BFP oder nEGFP beschriftet sind, und die intensive Beschriftung der Axone der kalosalen Projektionsneuronen der oberen Schicht (mtdTomato), die mit E15.5 beschriftet sind. Skala bar = 500 m. (C) Bild des somatosensorischen Kortex in der rechten Hemisphäre in einem doppelelektropolierten Gehirn. Beachten Sie die breite Verteilung der Projektionsneuronen (blau) über Schichten und die üppige Arborisierung der kalosalen Axone (rot), die von Projektionsneuronen stammen, die in der kontralateralen Hemisphäre anvisiert sind. Skala bar = 100 m. (D) Bild des somatosensorischen Kortex in der linken Hemisphäre eines doppelt elektropolierten Gehirns. Beachten Sie die diskrete Lokalisierung der gezielten Projektionsneuronen im oberen Teil der kortikalen Platte, wie durch die Expression von nEGFP (grün) gezeigt wird, sowie die üppige rote Beschriftung umgibter Zellkörper und alle neuronalen Projektionen (rot). Skala bar = 100 m. (E) Hohe Vergrößerungsbilder des somatosensorischen Kortex in der rechten Hemisphäre, die Details der Arborisierung der kalosalen Axone um gezielte Projektionsneuronen zeigen. Maßstabsleiste = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Strategie | Reihenfolge der Elektroporation | Zielzellen | Zielregion | Ventricle injiziert | Lage der Elektroden | Spannung und Impulse | Verwendete Plasmide | Alter der Analyse |
| Eine | Ersten | CR-Zelle bei E11.5 | Cortical Saum | Links | Positiv in der linken Hemisphäre (zur Medialwand gerichtet) | 25 V, 40 ms, 4p | CAG-mCherry | E17.5 |
| Zweite | Kortikale Projektionneuronen bei E13.5 | Somatosensorischer Cortex | Links | Positiv in der linken Hemisphäre | 35 V, 60 ms, 5p | CAG-EGFP | ||
| (in Richtung Kortex gerichtet) | ||||||||
| B | Ersten | Kortikale Projektionneuronen bei E13.5 | Somatosensorischer Cortex | Rechts | Positiv in der rechten Hemisphäre | 35 V, 60 ms, 5p | CAG-BFP | P15 |
| (in Richtung Kortex gerichtet) | ||||||||
| Zweite | Kortikale Projektionneuronen bei E15.5 | Somatosensorischer Cortex | Links | Positiv in der linken Hemisphäre | 50 V, 80 ms, 5p | CAG-nEGFP-2A-mTdTomato | ||
| (in Richtung Kortex gerichtet) |
Tabelle 1: Zusammenfassung der in den verschiedenen Experimenten verwendeten Elektroporationsbedingungen.
| Überleben von Embryonen nach doppelter Utero-Elektroporation in Strategie A | |||||||||
| Anzahl der Würfe | Anfängliche Anzahl von Embryonen | Anzahl der Embryonen, die das erste EP überlebt haben | Anzahl der embryonen, die das zweite EP überlebt haben | % des Überlebens nach dem ersten EP | % des Überlebens nach dem zweiten EP* | % der globalen Überlebensrate | |||
| 9 | Gesamtzahl | (Avg. Wurf bei SD) | Gesamtzahl | (Avg. Wurf bei SD) | Gesamtzahl | (Avg. Wurf bei SD) | 75% | 83.33% | 62.50% |
| 64 | 7,11 x 2,08 | 48 | 5,33 € 1,22 | 40 | 4,44 x 1,01 | ||||
| Anzahl der abgetriebenen Embryonen nach dem ersten EP | Anzahl der abgetriebenen Embryonen nach dem zweiten EP | Gesamtzahl der abgetriebenen Embryonen | % der Abtreibung nach dem ersten EP | % der Abtreibung nach dem zweiten EP* | % der weltweiten Abtreibungsrate | ||||
| Gesamtzahl | (Avg. Wurf bei SD) | Gesamtzahl | (Avg. Wurf bei SD) | Gesamtzahl | (Avg. Wurf bei SD) | 25% | 16.66% | 37.50% | |
| 16 | 1,8 x 1,09 | 8 | 0,88 bei 0,78 | 24 | 2,67 € 1,32 | ||||
| *Überleben und Abtreibung berechnet unter Berücksichtigung der Embryonen, die erste Elektroporation überlebt | |||||||||
Tabelle 2: Überleben von Embryonen nach doppelter In-Utero-Elektroporation in Strategie A.
| Überleben von Embryonen und Welpen nach Strategie B (doppelte EP E13.5 und E15.5) | |||||||||||
| Anzahl der Würfe | Anfängliche Anzahl von Embryonen | Anzahl der Embryonen, die das erste EP überlebt haben | Anzahl der welpen geboren nach Doppel EP | Anzahl der in P15 überlebenden Embryonen | % des Überlebens nach dem ersten EP | % des Überlebens nach dem zweiten EP | % des Überlebens bei P15 | ||||
| 8 | Gesamtzahl | (Avg. Wurf bei SD) | Gesamtzahl | (Avg. Wurf bei SD) | Gesamtzahl | (Avg. Wurf bei SD) | Gesamtzahl | (Avg. Wurf bei SD) | 88.46% | 82.69% | 55.77% |
| 52 | 6,5 x 2 | 46 | 5,75 € 2,05 | 43 | 5,38 € 1,77 | 29 | 3,63 € 1,6 | ||||
| Überleben von Embryonen und Welpen nach singlem EP bei E13.5 | ||||||||
| Anzahl der Würfe | Anfängliche Anzahl von Embryonen | Anzahl der nach EP geborenen Welpen | Anzahl der in P15 überlebenden Embryonen | % des Überlebens nach EP | % des Überlebens bei P15 | |||
| 11 | Gesamtzahl | (Avg. Wurf bei SD) | Gesamtzahl | (Avg. Wurf bei SD) | Gesamtzahl | (Avg. Wurf bei SD) | 89.74% | 57.69% |
| 78 | 7,1 bis 1,64 | 70 | 6,36 bis 1,7 | 45 | 4,09 € 2,07 | |||
Tabelle 3: Überleben von Welpen nach doppelter In-Utero-Elektroporation in Strategie B im Vergleich zur einfachen Elektroporation.
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Discussion
Die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen in vivo in Regionen mit hoher Zelldichte wie der Großhirnrinde ist eine komplexe Aufgabe. Herkömmliche Ansätze, einschließlich der Verwendung von Antikörpern zur Kennzeichnung von Neuriten, sind nicht geeignet, da es an spezifischen Markern für verschiedene Zellpopulationen fehlt. Die Verwendung von transgenen murinen Modellen, bei denen ein bestimmter Zelltyp ein fluoreszierendes Protein ausdrückt, ist nützlich, um die neuronalen Prozesse zu visualisieren, aber dies hängt von der Verfügbarkeit solcher Modelle ab. Diese Aufgabe ist noch komplizierter, wenn man versucht, mögliche Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen zwei bestimmten Zelltypen bei Störung der genenvon Interesse zu visualisieren, da es sich um die Verwendung anderer Tiermodelle, wie Knockout-Mäuse, handelt. All diese Fragen machten diese Studien in der Vergangenheit aufgrund wirtschaftlicher und zeitlicher Kosten kompliziert.
Das Aufkommen neuer Techniken, die die somatische Transgenese in vivo ermöglichen, wie z. B. in der Utero-Elektroporation, bietet die Möglichkeit, Strategien wie die in diesem Protokoll beschriebene zu entwerfen, die die Verwendung oder Erzeugung kombinierter Reporter- und Knockout-Tiere umgehen, wodurch diese Art von Experimenten realisierbarer wird. Die in dieser Veröffentlichung und den zuvor veröffentlichten Studien8 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass dieses Protokoll 1) die Ausrichtung von Zellpopulationen mit unterschiedlichem zeitlichen und räumlichen Ursprung erfolgreich ermöglicht; 2) ermöglicht die Visualisierung von Zell-Zell-Kontakten mit hoher Auflösung; und 3) ist nützlich, um Unterschiede in Zellkontakten nach funktionellen Experimenten zu erkennen.
Trotz des breiten Einsatzes in der Utero-Elektroporation erfordert diese Technik eine beträchtliche Ausbildung, um die Operation sicher durchzuführen, die Embryonen zu manipulieren, ohne sie zu beschädigen, und die richtige Ausrichtung auf die gewünschte Region zu gewährleisten. Nach dieser Ausbildung ist das Überleben von schwangeren Frauen jedoch ausgezeichnet (ca. 100% in unseren Händen) und wir haben keine Unterschiede zwischen Einzel- und Doppel-Elektroporation gefunden. Einzelne und doppelt elektroporated schwangere Frauen erholen sich sehr schnell von der Operation. In den allermeisten Fällen scheint ihr Verhalten am Tag nach der Einzel- oder Doppeloperation normal und diese schwangeren Weibchen essen, trinken, gehen und klettern sogar ohne Schwierigkeiten ohne offensichtliche Anzeichen von Schmerz und Not.
Das Überleben der Embryonen nach dem ersten und zweiten Elektroporation ist auch insgesamt gut, und die Rate der Abtreibung nimmt mit zunehmendem Alter der Embryonen ab (Tabelle 2 und Tabelle 3). Die Hauptschwierigkeit ist das erfolgreiche Targeting in beiden Elektroporationen. Bei älteren Embryonen ab E13.5 ist der Erfolgsgrad sehr hoch. Frühe Altersgruppen wie E11.5 sind schwieriger, weil die geringe Größe der Embryonen die Handhabung und Injektion erschwert, was sich darüber hinaus auf ihr Überleben auswirkt. Embryonen, die die erste E11.5-Elektroporation überlebt haben, zeigen jedoch sehr gute Überlebensraten nach der zweiten Elektroporation bei E13.5 (Tabelle 2). Um die Befähigung mit dieser Technik zu verbessern, empfehlen wir dringend, Operationen bei Welpen bei E14.5 zu praktizieren und nach und nach Operationen in jüngeren Jahren zu versuchen.
Eine weitere Herausforderung ist das postnatale Überleben, da Mütter, die sich einer Operation unterziehen, nicht immer alle ihre Welpen pflegen, obwohl schwangere Frauen allein oder doppelt elektropoiert die Welpen ohne Probleme liefern (Tabelle 3) und ihr Verhalten und Fitnessstatus normal aussehen. In unseren Händen und mit dem hier beschriebenen Timing finden wir keine wichtigen Unterschiede im postnatalen Überleben nach einfacher und doppelter Elektroporation (Tabelle 3), aber um mögliche Überlebensprobleme zu umgehen, können Welpen bei der Geburt auf Pflegemütter übertragen werden, wenn echte Mütter ein schlechtes mütterliches Verhalten bei der Geburt zeigen. Die Bereitstellung von zusätzlichem Nistmaterial und reichhaltiger Nahrung für schwangere Weibchen vor dem Geburtsdatum kann auch dazu beitragen, die Überlebensraten der Welpen zu erhöhen.
Einer der Hauptvorteile dieser Strategie ist die Verwendung von Wildtypmäusen für funktionelle Studien, aber sie kann auch angewendet werden, zum Beispiel auf CRE-Reportermäuse oder Flox-Mäuse für Gene von Interesse, sofern verfügbar. Bei diesen Mäusen ermöglicht die Elektroporation von CRE-Rekombinatoa-exemitten Plasmiden die permanente Expression des Reportergens bzw. die Inaktivierung des gewünschten Gens in den Zielzellen. Für funktionelle Experimente können wir die Expression des Konstrukts auch nur im Zelltyp des Interesses steuern. Zum Beispiel kann ein neuronaler Promotor verwendet werden, um ein Kandidatengen nur in Neuronen und nicht in neuronalen Stammzellen zu manipulieren, wodurch unerwünschte Effekte auf Vorläuferebene verhindert werden. All diese Überlegungen, zusammen mit der Kontrolle der Zeit und der Zielregion, machen die Doppel-In-Utero-Elektroporation zu einer sehr vielseitigen Technik, um Zell-Zell-Wechselwirkungen nicht nur innerhalb des Kortex, sondern auch in anderen Strukturen zu untersuchen, die mit dieser Technologie gezielt eingesetzt werden können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Cristina Andrés Carbonell und Mitgliedern der Tierpflegeeinrichtung der Universidad de Valencia für die technische Unterstützung. Wir möchten uns auch bei Isabel Fari'as und Sacramento R. Ferron für die Reagenzien und die gemeinsame Nutzung ihrer Ausrüstung mit uns bedanken. I.M.W wird durch einen Vertrag von der Conselleria de Educacion de Valencia (GJIDI/2018/A/221) finanziert, D.dA.D wird vom Ministerio de Ciencia, Innovacién y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150) finanziert. C.Gil-Sanz hält einen Ramen y Cajal Grant (RYC-2015-19058) vom spanischen Ministerio de Ciencia, Innovacién y Universidades (MICINN). Diese Arbeit wurde RYC-2015-19058 und SAF2017-82880-R (MICINN) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
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