Summary
Dubbel in utero elektroporation tillåter inriktning cell populationer som är rumsligt och tidsmässigt separerade. Denna teknik är användbar för att visualisera interaktioner mellan dessa cellpopulationer med fluorescerande proteiner under normala förhållanden, men också efter funktionella experiment för att störa gener av intresse.
Abstract
In utero elektroporation är en in vivo DNA-överföring teknik som används i stor utsträckning för att studera de molekylära och cellulära mekanismer som ligger till grund för däggdjur kortikogenes. Detta förfarande drar nytta av hjärnans ventriklar för att möjliggöra införandet av DNA av intresse och använder ett par elektroder för att styra ingången av det genetiska materialet i cellerna som kantar ventrikeln, de neurala stamcellerna. Denna metod gör det möjligt för forskare att märka de önskade cellerna och/eller manipulera uttrycket av gener av intresse för dessa celler. Den har flera program, inklusive analyser som riktar sig till neuronal migration, härstamning spårning, och axonal pathfinding. Ett viktigt inslag i denna metod är dess tidsmässiga och regionala kontroll, vilket möjliggör kringgående av potentiella problem relaterade med embryonal dödlighet eller bristen på specifika CRE-drivrutinsmöss. En annan relevant aspekt av denna teknik är att det bidrar till att avsevärt minska de ekonomiska och tidsmässiga begränsningar som involverar utvecklingen av nya muslinjer, som blir särskilt viktigt i studiet av interaktioner mellan celltyper som har sitt ursprung i avlägsna områden i hjärnan vid olika utvecklingsåldrar. Här beskriver vi en dubbel elektroporation strategi som möjliggör inriktning av cell populationer som är rumsligt och tidsmässigt separerade. Med detta tillvägagångssätt kan vi märka olika subtyper av celler på olika platser med utvalda fluorescerande proteiner för att visualisera dem, och/ eller vi kan manipulera gener av intresse som uttrycks av dessa olika celler vid lämpliga tidpunkter. Denna strategi ökar potentialen hos in utero elektroporation och ger ett kraftfullt verktyg för att studera beteendet hos tidsmässigt och rumsligt separerade cellpopulationer som migrerar för att upprätta nära kontakter, samt långväga interaktioner genom axonal projektioner, minska tidsmässiga och ekonomiska kostnader.
Introduction
Hjärnbarken är en mycket komplex och invecklat organiserad struktur. För att uppnå en sådan grad av organisation, när projektion nervceller gå igenom komplexa utvecklingsprocesser som kräver deras tidsmässiga generation, migration till slutdestinationen i kortikal plattan, och inrättandet av kort-och långväga anslutningar1,2. Under lång tid var det klassiska sättet att studera kortikogenes baserat på användning av knockout eller knock-in murine modeller av gener av intresse. Denna strategi, och särskilt användningen av villkorliga knockout-möss, är dock tidskrävande och dyr, och innebär ibland ytterligare problem när det gäller förekomsten av genetisk redundans eller bristen på specifika CRE-drivrutiner, bland andra frågor. En av de metoder som uppstod för att försöka ta itu med dessa problem och som numera används i stor utsträckning för att studera när utveckling är in utero elektroporation3,4. In utero elektroporation är en teknik som används för somatisk transgenes, möjliggör in vivo inriktning av neurala stamceller och deras avkomma. Denna metod kan användas för att märka celler med uttryck av fluorescerande proteiner5,6, för genmanipulation in vivo (dvs. vinst eller förlust av funktionsanalyser)7,,8,9, för att isolera elektroporerade kortiker in vitro- och odlingsceller8,10. Dessutom tillåter in utero elektroporation tidsmässig och regional kontroll av det riktade området. Denna teknik har många tillämpningar och har använts i stor utsträckning för att studera neuronal migration, stamceller division, neuronal anslutning, och andra ämnen8,9,11,12.
Det aktuella manuskriptet beskriver användningen av en in utero elektroporation variant, kallas dubbel in utero elektroporation, att analysera interaktioner av celler i hjärnbarken med olika tidsmässiga och rumsliga ursprung. Dessa studier är extremt komplexa att slutföra när man använder murine modeller eftersom de kräver kombinerad användning av flera transgena linjer. Några av de tillämpningar av protokollet som beskrivs i detta dokument inkluderar studiet av nära interaktioner mellan angränsande celler, samt interaktioner mellan avlägsna celler genom långväga prognoser. Metoden kräver att utföra två oberoende in utero elektroporation operationer, separerade tidsmässigt och rumsligt, på samma embryon för att rikta olika cell populationer av intresse. Fördelen med detta tillvägagångssätt är möjligheten att manipulera genfunktion i en eller båda typerna av nervceller med vilda typer av djur av vild typ. Dessutom kan dessa funktionella experiment kombineras med uttrycket av cytoplasmatiska eller membranmärkta fluorescerande proteiner för att visualisera den fina morfologin hos riktade celler, inklusive dendriter och axoner, och analysera möjliga skillnader i cellulära interaktioner i jämförelse med en kontroll (dvs. celler som endast är märkta med fluorescerande protein).
Protokollet beskrivs här är inriktad på studier av cellulära interaktioner inuti neocortex, men denna strategi kan också användas för att undersöka interaktioner med extrakortikala områden som kan riktas med hjälp av utero elektroporation, som subpallium eller thalamus13,14, eller cell-cell interaktioner i andra strukturer, som lillhjärnan15. Inriktning av olika områden baseras på elektrodernas orientering och på ventrikeln där DNA injiceras (lateralt, tredje eller fjärde). Med den strategi som beskrivs här kan vi märka ett stort antal celler, vilket är användbart för att utvärdera allmänna förändringar i anslutning /innervation i funktionella experiment. Ändå, för att studera fina förändringar i anslutning, kan man använda modifierade versioner av in utero elektroporation för att få sparser märkning och identifiera enskilda celler16. Sammanfattningsvis är dubbel in utero elektroporation en mångsidig metod som gör det möjligt att rikta tidsmässigt och rumsligt åtskilda cellpopulationer och studera deras interaktioner i detalj, antingen i kontrollförhållanden eller i kombination med funktionella experiment, avsevärt minska tidsmässiga och ekonomiska kostnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det förfarande som beskrivs här har godkänts av den etiska kommitté med ansvar för försök, djurens välbefinnande vid Universidad de Valencia och Conselleria de Agricultura. Desarrollo Rural, Emergencya Climática y Transición Ecológica från Comunidad Valenciana, och följer riktlinjerna från Internationella rådet för laboratoriedjurvetenskap (ICLAS) som granskades i den spanska lagstiftningens verkliga decreto 53/2013 samt i Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU.
OBS: Detta protokoll omfattar två olika syften: 1) den första studien, kallad "strategi A", möjliggör analys av interaktioner mellan Cajal-Retzius celler (CR-celler) och tidigfödd när projektion nervceller inom samma hjärnhalva; 2) den andra studien, "strategi B", utförs för att undersöka innervation av det övre lagret callosal projektion nervceller till kontralateral sidan av neocortex.
1. Förberedelse inför förberedelser
- DNA-beredning
- Omvandla kemiskt eller elektrokompetenta E. coli DH5α-celler med plasmider av intresse, platta dem på LB agar plattor med lämpligt antibiotikum, och ruva dem över natten vid 37 °C.
OBS: Alla plasmider som används här innehåller den allmänna promotorn för kyckling β-aktin (CAG) som driver uttrycket av ett fluorescerande-reporterprotein (CAG-mCherry och CAG-EGFP för strategi A och CAG-BFP och CAG-nEGFP-2A-mtdTomato för strategi B). Alla innehåller resistens mot ampicillin (AMP). - Plocka enskilda kolonier från varje plasmidomvandling och initiera en förrättsflytande kultur i 2 ml Luria buljong + ampicillin (LB+AMP) i bakterieodlingsrör under 3−4 h vid 37 °C med kraftig skakning (200 rpm). Efter, ställ in en större bakteriekultur i en 500 ml Erlenmeyer kolv tillsätt 200 ml LB + AMP och 1 ml av startkulturen. Inkubera över natten vid 37 °C i omloppsbanor shaker vid 200 rpm.
- Använd en endotoxinfri maxi-prep kit (Table of Materials) enligt tillverkarens anvisningar för att få rent och koncentrerat plasmid-DNA från flytande kulturer. Resuspend DNA i ~50−100 μL endotoxin-fri Tris-EDTA (TE) buffert för att erhålla koncentrationer på minst 5 μg/μL.
- För varje operation bereder du en lösning med en slutlig volym på 10 μL som innehåller 1 μl snabbt grönt färgämne, plasmid-DNA-lösning av intresse för en slutlig koncentration av 1 μg/μL för varje plasmid och endotoxinfri TE-buffert. Blanda till exempel 1 μL snabbt grönt färgämne, 2 μL av en μg/μL plasmid-DNA-lösning och 7 μL TE-buffert.
- Omvandla kemiskt eller elektrokompetenta E. coli DH5α-celler med plasmider av intresse, platta dem på LB agar plattor med lämpligt antibiotikum, och ruva dem över natten vid 37 °C.
- Pipett dra
- Dra borosilikatglaskapillärer (1/0,58 mm ytter/innerdiameter) i en vertikal mikropipettedragare tills spetsen når en längd av 1−1,5 cm och trimma den med dissekerande pincett i en vinkel på cirka 30° under dissekera omfattning.
- Inställning av operationsrum
- Lägg all utrustning på manöverbordet (t.ex. pincett, sax, pincett, mikropipetter, nål och nålhållare). Slå på värmedynan och täck den med en steril kirurgisk absorberande pad. Se till att behållaren i maskinen för inandningsanestesi är fylld med isofluran, syrgastanken innehåller tillräckligt med syre och att systemet fungerar korrekt.
OBS: Operationsrummet och det resistenta materialet måste hållas så sterila som möjligt (dvs. allt material måste autoklaveras före operationen och ytorna måste saneras med 70 % etanol). Platina elektroder måste noggrant desinficeras först med bakteriedypa och andra med 70% etanol före operationen. - Förbered 100 ml 0,9 % (w/v) steril saltlösning som innehåller penicillin-streptomycin 1:100 och fyll en 10 cm petriskål. Placera plattan ovanpå den uppvärmda dynan för att värma upp lösningen.
- Fyll en 1 ml-spruta med 150 μL av en smärtstillande lösning (t.ex. 0,1 mg/kg buprenorfin).
- Ladda den dragna pipetten med 5 μL av den slutliga plasmid-DNA-lösningen som bereds i steg 1.1.4. Anslut kapillären till ett munstyrt aspiratorrör.
- Lägg all utrustning på manöverbordet (t.ex. pincett, sax, pincett, mikropipetter, nål och nålhållare). Slå på värmedynan och täck den med en steril kirurgisk absorberande pad. Se till att behållaren i maskinen för inandningsanestesi är fylld med isofluran, syrgastanken innehåller tillräckligt med syre och att systemet fungerar korrekt.
2. Först i livmoderns elektroporation kirurgi
- Placera en 11,5 -5 (strategi A) eller E13.5 (strategi B) C57BL/6 gravid mus i en sluten induktionskammare med 2,5 % (v/v) isofluran vid 0,8 L/min och vänta tills den är sövd. Överför musen till värmedynan och lägg näsan i en mask för konstant leverans av isofluran. Kontrollera att det inte finns någon pedalreflex som en indikator på korrekt anestesi.
OBS: Embryonic ålder bestäms baserat på den dag då vaginalpluggen observeras (E0.5). - Injicera den gravida honan med den smärtstillande lösningen (0,1 mg/kg buprenorfin) subkutant. För att förhindra att ögonen torkar under proceduren, applicera en droppe ögonsalva i varje öga med hjälp av en bomullspinne.
- Raka mus buken med en elektrisk rakhyvel och tvätta den 2x med 70% (v / v) etanol våtservetter, en gång med jod våtservetter, och en sista gång med en etanol torka.
- Använd sax för att göra ett 30 mm långt snitt genom huden på djurets högra sida och separera försiktigt den intilliggande huden från muskeln med en trubbig spatel. Efteråt, gör ett andra snitt i bukväggen.
- Täck buken med en bit vikta mjukpapper som tidigare desinficerats med 70% etanol som innehåller en 40 mm lång slits i mitten. Dra försiktigt ut livmodern ur bukhålan med ringtång.
OBS: Livmodern måste hållas våt med den varma saltlösningen som bereds i steg 1.3.2 under hela proceduren. - Förladda de dragna pipetterna med DNA-lösningen förberedd i steg 1.1.4. Injicera ~0,5 μL av DNA-lösningen per embryo i den laterala ventrikeln på det valda halvklotet med hjälp av det munstyrda aspiratorröret tills det snabba gröna färgämnet är märkbart inuti ventrikeln.
- Placera elektroderna av tång av platina i sidled runt det injicerade embryots huvud (enligt figur 1A och figur 2A). Orientera elektroderna för att rikta in dig på önskad hjärnregion. Rikta den positiva polen mot den mediala väggen för att elektroporera den när fåll (strategi A) eller mot den laterala cortex (strategi B) för att märka celler som genereras i det området.
OBS: I samtliga fall måste hjärtat och moderkakan undvikas för att säkerställa embryonal överlevnad. - Applicera den specifika sekvensen av elektriska pulser med en elektroporator med fyrkantiga vågor enligt de indikationer som anges i tabell 1 (strategi A E11.5 embryon: fyra pulser på 25 V och 40 ms, åtskilda av 950 ms intervall; strategi B E13.5 embryon: fem pulser på 35 V och 60 ms, med 950 ms intervaller).
- Placera försiktigt livmodern tillbaka in i bukhålan med pincett, fyll den med varm saltlösning och stäng bukväggen med en nål 6-0 sutur. Gå med i de två sidorna av det första snittet som gjorts i huden antingen med hjälp av en nål 6-0 sutur eller suturklämmor.
- Håll djuret på värmeplattan och övervaka det tills dess återhämtning från anestesi. Ge en extra dos analgesi (150 μL) i en hydrogellösning placerad i sin hembur.
- 24 timmar efter operationen, administrera en extra dos analgesi (150 μL). Fortsätt daglig övervakning genom visuell inspektion för eventuell smärta och ångest. Observera djurets beteende, testa dess normala bakbensreflexer och inspektera suturen för eventuella tecken på skada på grund av slicka eller repor av såret.
3. Andra in utero elektroporation
- Två dagar efter den första operationen, upprepa steg 2.1−2.3. Även om återhämtningen av gravida kvinnor efter operationen är mycket bra, kontrollera att de visar normalt beteende och presentera inga tecken på smärta eller ångest innan du utför den andra operationen (E13.5 embryon för strategi A och E15.5 för strategi B).
- Gör ett 30 mm långt snitt genom huden som i steg 2.4 och ett andra snitt vid bukväggen, denna gång på djurets vänstra sida. Exponera försiktigt livmodern ovanpå en desinficerad vävnad enligt beskrivningen i steg 2.5.
OBS: Var försiktig så att du inte stör snittet som tidigare gjorts på andra sidan. - Injicera runt 0,5 μL per embryo av DNA-lösningen i den laterala hjärnan ventrikeln på halvklotet tidigare elektroporerade i fråga om strategi A och i den laterala hjärnan ventrikeln i kontralaterala halvklotet för strategi B.
OBS: Använd endast embryon som uppvisar normal utveckling och inga tecken på reabsorption. - Placera elektroderna runt embryots huvud enligt beskrivningen i steg 2.7, rikta den positiva elektroden mot sidobarken och tillämpa lämpliga pulser enligt de indikationer som anges i tabell 1 (strategi A E13.5 embryon: fem pulser på 35 V och 60 ms åtskilda av 950 ms intervall; strategi B E15.5 embryon: fem pulser på 50 V och 80 ms åtskilda av 950 ms intervaller).
- Fortsätt och avsluta operationen enligt beskrivningen i steg 2.8−2.10.
4. Vävnadsskörd och snittning
- Strategi A
- Fyra dagar efter den andra elektroporationen (E17.5), utför cervikal förskjutning av den gravida honan och placera den i ryggläge.
- Använd sax, gör ett ventralt snitt för att extrahera livmoderhornen och med pincett placera dem i en petriskål fylld med 1x fosfatbuffertad saltlösning (PBS) placerad på is.
OBS: Den låga temperaturen gör anesthetization av embryona möjligt. - Med hjälp av pincett, extrahera embryon ur fostersäcken och överföra dem med pincett till en ny PBS-fylld petriskål under en dissekering omfattning. Håll försiktigt huvudet av embryona med pincett och genomföra hjärndissektion med pincett för att först ta bort huden över huvudet och sedan skallen. Använd en spatel för att dra ut de exponerade hjärnorna.
- Samla hjärnorna med en sked och deponera dem i en 48 väl platta fylld med fixativ lösning (4% [w / v] paraformaldehyd [PFA] i 1x PBS). Testa omedelbart för det framgångsrika resultatet av båda elektroporationerna genom att undersöka hjärnan med hjälp av ett inverterat epifluorescensmikroskop, till exempel.
- Fixera embryonala hjärnor över natten vid 4 °C i en orbital shaker. Tvätta med 1x PBS för att eliminera spår av PFA. Överför dem sedan till PBS med svampdödande konserveringsmedel (1x PBS-0,05% (w /v) natriumazid).
VARNING: PFA och natriumazid är cytotoxiska föreningar som kräver särskild försiktighet under deras användning. - Bädda in fixerade hjärnor i 4% (w / v) låg smältpunkt agaros i 1x PBS och vänta ~ 10 min tills den stelnar. Håll dem till vibratom vävnadshållaren med cyanoakrylatlim med luktlampor uppåt för att få koronala sektioner.
- Initiera vibratomen och välj önskade parametrar: 100 μm bredd, 0,60 μm/s hastighet och 0,60 mm amplitud.
- Säkra hjärnan inuti vibratombehållaren, fyll den med 1x PBS-lösning och börja samla koronala seriesektioner med hjälp av en borste i en 48-brunnsplatta fylld med 1x PBS-0,05% (w/v) natriumazid för att få en fullständig skildring av hjärnan (t.ex. cirka sju sektioner per brunn och sex brunnar per embryo).
- Montera önskade sektioner i mikroskopglasglas med en fin borste. Täck dem med glasöverdrag. För långsiktig förvaring lägg monteringsmedium, vilket förhindrar fotobleg och fotooxidation. Observera bilderna under ett upprätt epifluorescensmikroskop för att bedöma elektroporationseffekten.
- Strategi B
- Låt ungarna tidigare elektroporeras vid E13.5 och E15.5 födas och vänta tills P15 för att utföra transcardial perfusion med samma fixativa lösning som används i steg 4.1.4.
- Strax före perfusion, itraperitoneally administrera en dos av 75/1 mg/kg ketamin/medetomidine. När pedalreflexen är förlorad, säkra musen i en ryggläge och gör ett ventralt snitt efter mittlinjen med sax för att exponera både bröstkorgen och membranet.
- Skär membranet och öppna bröstkorgen för att få tillgång till hjärtat. Håll bröstkorgen med hjälp av en hemostat och gör ett snitt i höger atrium med fin sax.
- Penetrera den vänstra ventrikeln med en nål ansluten med ett flexibelt rör till en peristaltisk perfusion pump. Starta transcardial perfusion, leverera minst 25 ml 4% PFA vid ett konstant flöde på 5,5 ml /min (total tid ~ 5 min).
- Dissekera hjärnan hos perfunderade djur. Ta först bort huden över huvudet med sax och pincett. Börja skära skallen med sax och försiktigt dra bort delar av skallbenen tills de är helt bort. Slutligen extrahera hjärnan med hjälp av en spatel.
- Överför hjärnorna till en 24-brunnsplatta och fixa dem med 4% PFA över natten vid 4 °C på en orbital shaker. Stoppa fixering genom att ersätta PFA med 0,05% (w/v) natriumazid i PBS.
OBS: Som anges i steg 4.1.5 är det lämpligt att utföra en mellanliggande tvätt med 1x PBS. - Upprepa steg 4.1.6−4.1.9, ändra vibratomeparametrarna för postnatala hjärnor (40 μm bredd, 1,20 μm/s hastighet och 0,5 mm amplitud).
OBS: Immunohistokemi eller immunofluorescens kan utföras för att upptäcka specifika cellmarkörer eller förstärka signalen av fluorescerande proteiner som används vid elektroporation.
5. Konfikt fluorescensavbildning och analys
- Slå på konfokalmikroskopet, placera mikroskoprutschbanorna som innehåller de monterade hjärnsektionerna på mikroskoprutschbanan och välj de kanaler där fluorescensbilder ska tas (dvs. 420−460 nm för BFP, 490−540 nm för GFP och 570−620 nm för mCherry och tdTomato).
- Utför provskanning för att få kartbilder av varje hjärnsektion vid två olika våglängder för en allmän bild av den dubbla elektroporationsutgången. När du är klar väljer du 10x-objektivet och observationsläget för multi-area-Z-stack-timelapse. Detta gör det möjligt att programmera automatisk förvärv av fluorescensbilder vid olika XYZ-lokaliseringar inom hjärnsektioner.
- I var och en av de valda regionerna (XY) ställer du in lämpliga bildparametrar (dvs. laserintensitet, fotomultiplikatorkänslighet och en minsta upplösning på 1 024 x 1 024), samt skanningsdjupet (Z) enligt de plan i provet där fluorescensen är synlig.
- Hämta bilder med låg förstoring (10x) av alla valda regioner och exportera dem från OIF till TIFF-format med hjälp av mikroskopvisningsprogrammet.
- Byt till 60x objektivet, upprepa steg 5.3 och ta höga förstoringsbilder för att observera cellcellinteraktionerna på ett mer detaljerat sätt. Exportera dem enligt steg 5.4.
- Öppna de förvärvade bilderna med alla bildprogram (t.ex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Interaktioner mellan angränsande celler har sitt ursprung i distala platser och vid olika tidpunkter: Cajal-Retzius celler (CR-celler) och tidiga migrerande närprojektion nervceller (strategi A)
Interaktionen mellan CR-celler och tidiga närprojektionsneuron beskrevs tidigare som nödvändig för att reglera somal flyttning via nekrotin- och cadherinadhesionmolekyler med hjälp av en dubbel elektroporationsstrategi8. CR-celler härstammar från neuroepithelium vid kanterna av pallium och migrera tangentiellt att befolka den mest ytliga delen av cortex, marginalzonen17,18,19, medan när projektion nervceller genereras i proliferative zonen i hjärnbarken och migrera radiellt in i begynnande när plattan20. Det finns en tidsmässig skillnad i genereringen av båda typerna av celler. CR-celler genereras i mycket tidiga embryonala stadier från E10.521,,22 och när projektion nervceller som migrerar genom somal flyttning föds från E12.5-E13.523. Med hjälp av dubbel in utero elektroporation, den tidsmässiga klyftan mellan operationer tillåter CR-celler, riktade mot E11.5 i en av dess ursprungsorter (den när fållen), för att nå marginalzonen i den laterala neocortex inklusive somatosensory området i tid för att upprätta kontakter med när projektion nervceller märkta på E13.5 (Figur 1A,B). De ledande processerna för projektionsneuroner som uttrycker förbättrad GFP (EGFP) ymnigt bersar i marginella zonen i cortex och blandas med processerna av CR-celler som uttrycker mCherry (Figur 1C). Funktionella experiment har visat att störning av cell-cell adhesion molekyler uttryckt av projektion nervceller eller CR-celler påverkar arborization av deras processer som en följd av förändrade kontakter mellan båda celltyperna8.
Långväga interaktioner mellan distala celler som genereras vid olika tidpunkter: innervation av övre lagret callosal projektion nervceller till kontralateral sidan av neocortex (strategi B)
Callosal när projektion nervceller finns i hela hjärnbarken, är mer riklig i övre lager24. Dessa nervceller projekt sina axoner genom corpus callosum och kontakta sina målceller, projektion nervceller som ligger över de olika skikten av kontralaterala cortex 25,26,27. Övre lager projektion nervceller är evolutionärt nyare än lägre lager nervceller och har kraftigt expanderat i primater28. Dessa celler är avgörande för komplexa tankar och högre associativa uppgifter, och dysfunktioner i grupper av gener som särskilt uttrycks av denna population av celler har nyligen relaterade med autism29.
För att specifikt studera samspelet mellan subpopulationen av callosal projektion nervceller som finns i de övre skikten med sina målceller distribueras över hela kontralateral halvklotet, utvecklade vi en dubbel in utero elektroporation protokoll. För att märka målcellerna i övre lagret callosal projektion nervceller vi utfört i utero elektroporation vid E13.5 med hjälp av en BFP uttrycker plasmid (Figur 2A−C). Denna ålder valdes strategiskt eftersom det tillåter inte bara inriktning av en bred när projektion neuron population inklusive många lager-V nervceller, men också ett stort antal nervceller som ligger i övre lager (Figur 2C), i princip täcker alla målområden av callosal projektion nervceller från kontralateral halvklotet. En andra elektroporation i kontralateral sida vid E15.5 riktade det övre lagret callosal projektion neuron subpopulation (uttrycker nEGFP och mtdTomato) (Figur 2A,B,D) men inte det nedre lagret projektion nervceller födda i tidigare åldrar. Behovet av heterochronic dubbel elektroporation var därför motiverat på grund av de olika tiderna i utvecklingen av de utskjutande cellerna av intresse och de celler som innervated av dem. De övre lagret riktade nervceller skicka sina axoner till kontralaterala halvklotet med en karakteristisk arborization mönster (Figur 2C). Skillnader i denna typiska axonal arborization mönster kan utvärderas vid vinst eller förlust av funktion experiment i målceller med hjälp av denna dubbla elektroporation protokoll. Hög förstoring analys visar i detalj callosal axons innervating riktade projektion nervceller i kontralateral halvklotet (Figur 2E).
Figur 1: Strategi A. Dubbel in utero elektroporation strategi för att studera nära interaktioner mellan celler med olika rumsliga och tidsmässiga ursprung. (A)Scheman för det protokoll som används för att rikta CR-celler som uttrycker mCherry och när projektion nervceller uttrycker EGFP. (B)Representativ bild av en koronal del av en hjärna efter dubbel elektroporation i kortikala fållen och den laterala cortex. Celler riktade i kortikala fåll (röd) migrera tangentiellt, fylla marginella zonen i neocortex. Märkta celler i ventrikulära zonen i cortex generera när projektion nervceller (grön) som migrerar radiellt för att komma in i begynnande när plattan. Skalstång = 200 μm. (C) Förstoring av området förpackat i panel B som visar den laterala cortex och de två typerna av celler märkta efter dubbel elektroporation protokollet. Streckade linjer ramar in marginalzonen och kortikalplattan. Skala bar = 100 μm. Hög förstoring till höger visar en detalj av marginalzonen som innehåller arborized ledande processer av projektion nervceller blandas med CR-celler organ och processer. Skalbar = 10 μm. Ctx = cortex; Hem = kortikal fåll; MZ = marginalzon. CP = kortikal platta; IZ = mellanliggande zon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Strategi B. Dubbel elektroporationsstrategi för att studera långväga interaktioner mellan celler med olika rumsligt och tidsmässigt ursprung. (A)Schema som visar strategin att rikta olika populationer av närprojektion nervceller i den laterala neocortex inklusive somatosensory området i olika halvklot med dubbel in utero elektroporation. Projektion nervceller i somatosensory cortex av rätt halvklotet riktade mot E13.5 uttryckt BFP. Riktade projektion nervceller i kontralateral sida som riktar sig till E15.5 uttryckt nukleära EGFP (nEGFP) och membran-riktade tdTomato (mtdTomato). ( B)Representativ bild av en koronal del av en hjärna som genomgick dubbel elektroporation kirurgi med de nämnda plasmider i panel A. Notera de olika fördelningarna av de celler som är märkta med BFP eller nEGFP och den intensiva märkningen av axonerna hos de övre lagerläkarvärdena (mtdTomato) märkta vid E15.5. Skalbar = 500 μm. (C) Bild av den somatosensoriska cortex som ligger på höger halvklot i en dubbel elektroporerad hjärna. Notera den breda fördelningen av projektionen nervceller (blå) över lager och ymnig arborization av callosal axoner (röd) som kommer från projektion nervceller riktade i kontralateral halvklotet. Skalbar = 100 μm. (D) Bild av den somatosensoriska cortex på vänster halvklot av en dubbel elektroporerad hjärna. Notera den diskreta lokaliseringen av de riktade projektionsneuronerna i den övre delen av den när plattan som visas av uttrycket av nEGFP (grön), liksom den ymniga röda märkningen kring cellkroppar och alla neuronala projektioner (röda). Skala bar = 100 μm. (E) Hög förstoring bilder av somatosensory cortex på höger halvklotet visar detaljer om arborization av callosal axoner runt riktade projektion nervceller. Skalbar = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Strategi | Ordning av elektroporation | Målceller | Målregion | Ventrikeln injiceras | Elektrodernas placering | Spänning och pulser | Plasmider används | Analysålder |
| A | Första | CR-cell på E11.5 | Kortikal hem | Vänster | Positivt på vänster halvklot (riktad mot den mediala väggen) | 25 V, 40 ms, 4p | CAG-mCherry | E17.5 |
| Andra | Kortikal projektion nervceller på E13.5 | Somatosensory Cortex | Vänster | Positivt på vänster halvklot | 35 V, 60 ms, 5p | CAG-EGFP | ||
| (riktad mot hjärnbarken) | ||||||||
| B | Första | Kortikal projektion nervceller på E13.5 | Somatosensory Cortex | Rätt | Positivt på höger halvklot | 35 V, 60 ms, 5p | CAG-BFP | P15 (på andra sätt) |
| (riktad mot hjärnbarken) | ||||||||
| Andra | Kortikal projektion nervceller på E15.5 | Somatosensory Cortex | Vänster | Positivt på vänster halvklot | 50 V, 80 ms, 5p | CAG-nEGFP-2A-mTdTomato | ||
| (riktad mot hjärnbarken) |
Tabell 1: Sammanfattning av de elektroporationsförhållanden som används i de olika experimenten.
| Embryons överlevnad efter dubbel in uteroelektroporation i strategi A | |||||||||
| Antal kullar | Initialt antal embryon | Antal embryon som överlever första EP | Antal embryon som överlever andra EP | % av överlevnaden efter första EP | % av överlevnaden efter andra EP* | % av den globala överlevnaden | |||
| 9 | Totalt antal | (Genomsnittligt strö ± SD) | Totalt antal | (Genomsnittligt strö ± SD) | Totalt antal | (Genomsnittligt strö ± SD) | 75% | 83.33% | 62.50% |
| 64 | 7.11 ± 2,08 | 48 | 5,33 ± 1,22 | 40 | 4,44 ± 1,01 | ||||
| Antal aborterade embryon efter första EP | Antal avbrutna embryon efter andra EP | Totalt antal avbrutna embryon | % av abort efter första EP | % av aborten efter andra Europaparlamentet* | % av den globala abortfrekvensen | ||||
| Totalt antal | (Genomsnittligt strö ± SD) | Totalt antal | (Genomsnittligt strö ± SD) | Totalt antal | (Genomsnittligt strö ± SD) | 25% | 16.66% | 37.50% | |
| 16 | 1,8 ± 1,09 | 8 | 0,88 ± 0,78 | 24 | 2,67 ± 1,32 | ||||
| * Överlevnad och abort beräknas med tanke på de embryon som överlevde första elektroporation | |||||||||
Tabell 2: Embryonas överlevnad efter dubbel in uteroelektroporation i strategi A.
| Överlevnad för embryon och ungar efter strategi B (dubbel EP E13.5 och E15.5) | |||||||||||
| Antal kullar | Initialt antal embryon | Antal embryon som överlever första EP | Antal ungar födda efter dubbel EP | Antal embryon som överlever vid P15 | % av överlevnaden efter första EP | % av överlevnaden efter andra EP | % av överlevnaden vid P15 | ||||
| 8 | Totalt antal | (Genomsnittligt strö ± SD) | Totalt antal | (Genomsnittligt strö ± SD) | Totalt antal | (Genomsnittligt strö ± SD) | Totalt antal | (Genomsnittligt strö ± SD) | 88.46% | 82.69% | 55.77% |
| 52 | 6,5 ± 2 | 46 | 5,75 ± 2,05 | 43 | 5,38 ± 1,77 | 29 | 3,63 ± 1,6 | ||||
| Överlevnad av embryon och ungar efter enstaka EP vid E13.5 | ||||||||
| Antal kullar | Initialt antal embryon | Antal ungar födda efter EP | Antal embryon som överlever vid P15 | % av överlevnaden efter Ep | % av överlevnaden vid P15 | |||
| 11 | Totalt antal | (Genomsnittligt strö ± SD) | Totalt antal | (Genomsnittligt strö ± SD) | Totalt antal | (Genomsnittligt strö ± SD) | 89.74% | 57.69% |
| 78 | 7,1 ± 1,64 | 70 | 6,36 ± 1,7 | 45 | 4,09 ± 2,07 | |||
Tabell 3: Överlevnad för ungar efter dubbel in utero elektroporation i strategi B jämfört med enkel elektroporation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studiet av cell-cell interaktioner in vivo i regioner med hög cellulär densitet som hjärnbarken är en komplex uppgift. Traditionella metoder, inklusive användning av antikroppar för att märka neuriter är inte lämpliga på grund av bristen på specifika markörer för olika cellpopulationer. Användningen av transgena murinmodeller, där en viss celltyp uttrycker ett fluorescerande protein, är användbart för att visualisera de neuronala processerna, men detta beror på tillgången på sådana modeller. Denna uppgift är ännu mer komplicerat när man försöker visualisera eventuella skillnader i interaktioner mellan två särskilda celltyper vid störning av de gener av intresse, eftersom det innebär användning av andra djurmodeller, som knockout möss. Alla dessa frågor gjorde dessa studier komplicerade i det förflutna på grund av ekonomiska och tidsmässiga kostnader.
Framväxten av nya tekniker som möjliggör somatisk transgenes in vivo, såsom in utero elektroporation, erbjuder möjligheten att utforma strategier som den som beskrivs i detta protokoll, som kringgår användning eller generation av kombinerade reporter och knockout djur, vilket gör denna typ av experiment mer genomförbart. Resultaten som visas i denna publikation och tidigare publicerade studier8 visar att detta protokoll 1) framgångsrikt tillåter inriktning av cellpopulationer med olika tidsmässiga och rumsliga ursprung; 2) gör det möjligt visualisering av cell-cell kontakter med hög upplösning; och 3) är användbart för att upptäcka skillnader i cellkontakter efter funktionella experiment.
Trots den breda användningen av in utero elektroporation, denna teknik kräver betydande utbildning för att säkert utföra operationen, manipulera embryon utan att skada dem, och säkerställa en korrekt inriktning av den önskade regionen. Men efter denna utbildning, överlevnad av gravida kvinnor är utmärkt (ca 100% i våra händer) och vi har funnit några skillnader mellan enkel och dubbel in utero elektroporation. Enkel och dubbel elektroporerad gravida kvinnor återhämta sig mycket snabbt från operationen. I de allra flesta fall, deras beteende dagen efter enkel eller dubbel kirurgi verkar normalt och dessa gravida kvinnor äter, dricker, går, och även klättra utan svårigheter utan uppenbara tecken på smärta och ångest.
Embryonas överlevnad efter den första och den andra elektroporationen är också god totalt sett, och abortfrekvensen minskar i takt med att embryonas ålder ökar (tabell 2 och tabell 3). Den största svårigheten är framgångsrik inriktning på båda elektroporationerna. Med äldre embryon från E13.5 och framåt är graden av framgång mycket hög. Tidiga åldrar som E11.5 är mer utmanande eftersom den lilla storleken på embryona gör hantering och injektion svårare, vilket dessutom påverkar deras överlevnad. Embryon som överlever den första E11.5-elektroporationen uppvisar dock mycket goda överlevnadshastigheter efter den andra elektroporationen vid E13.5 (tabell 2). För att förbättra kompetensen med denna teknik rekommenderar vi starkt att öva operationer hos valpar på ~E14.5 och successivt försöker operationer i yngre åldrar.
En annan utmaning är postnatal överlevnad, emalt över mödrarna som genomgår kirurgi inte alltid ta hand om all av deras pups, fastän gravid kvinno- enkel eller dubbel electroporated leverera den pups utan problemen (Bord 3)och deras beteende och konditionen status utseende normal. I våra händer, och med den timing som beskrivs här, finner vi inga viktiga skillnader i postnatal överlevnad efter enkel och dubbel elektroporation (Tabell 3), men för att kringgå eventuella överlevnadsproblem valpar kan överföras till fostermödrar vid leverans när riktiga mödrar visar dåligt moderns beteende vid födseln. Skaffande extra häckande material och rik mat till gravid kvinno- föregående till leveransen datum kanna också hjälp till öka överlevnaden om ungarna.
En av de främsta fördelarna med denna strategi är användningen av vilda möss för funktionella studier, men det kan också tillämpas, till exempel på CRE reporter möss eller floxed möss för gener av intresse, när de är tillgängliga. Hos dessa möss kommer elektroporation av CRE-rekombination som uttrycker plasmider att tillåta det permanenta uttrycket av reportergenen eller inaktiveringen av den önskade genen, respektive i de riktade cellerna. För funktionella experiment kan vi också styra konstruerans uttryck endast i celltypen av intresse. Till exempel, en neuronal promotor kan användas för att manipulera en kandidat gen endast i nervceller och inte i neurala stamceller, vilket förhindrar oönskade effekter på progenitor nivå. Alla dessa överväganden, tillsammans med kontroll av tiden och den riktade regionen, gör dubbel in utero elektroporation en mycket mångsidig teknik för att studera cell-cell interaktioner inte bara inne i cortex utan även i andra strukturer som kan riktas med hjälp av denna teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Cristina Andrés Carbonell och medlemmar av Animal Care anläggningen i Universidad de Valencia för tekniskt stöd. Vi vill också tacka Isabel Fariñas och Sacramento R. Ferrón för reagenser och dela sin utrustning med oss. I.M.W finansieras genom ett Garantía Juvenil-kontrakt från Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D finansieras av Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz innehar ett Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) från den spanska ministernio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Detta arbete finansierades RYC-2015-19058 och SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
