Summary
자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.
Abstract
자궁에서 전기화는 포유류 코르티코발생의 근본적인 분자 및 세포 메커니즘을 연구하기 위해 광범위하게 사용되는 생체 내 DNA 전달 기술이다. 이 절차는 관심있는 DNA의 도입을 허용하기 위해 뇌 심실을 활용하고 심실, 신경 줄기 세포를 안대기 세포로 유전 물질의 입구를 지시하기 위해 전극의 쌍을 사용합니다. 이 방법은 연구원이 원하는 세포를 표지하고/또는 그 세포에 있는 관심있는 유전자의 발현을 조작하는 것을 허용합니다. 그것은 여러 응용 프로그램이, 신경 마이그레이션을 대상으로 하는 애서를 포함 하 여, 혈통 추적, 그리고 축 하 경로 찾는. 이 방법의 중요한 특징은 배아 치사 또는 특정 CRE 드라이버 마우스의 부족과 관련된 잠재적 인 문제의 우회를 허용, 그것의 시간 적 및 지역 제어입니다. 이 기술의 또 다른 관련 측면은 다른 발달 나이에 두뇌의 먼 지역에서 유래하는 세포 모형 사이 상호 작용의 연구 결과에서 특히 중요하게 되는 새로운 마우스 선의 생성을 관련시키는 경제 및 측두적인 한계를 상당히 감소시키는 것을 돕습니다. 여기서우리는 공간적으로 그리고 현세적으로 분리되는 세포 집단의 타겟팅을 가능하게 하는 이중 전기화 전략을 설명합니다. 이 접근법으로 우리는 선택된 형광 단백질을 가진 다른 위치에 있는 세포의 다른 특수형을 그(것)들을 시각화하기 위하여, 및/또는 우리는 적당한 시간에 이 다른 세포에 의해 표현된 관심의 유전자를 조작할 수 있습니다. 이 전략은 자궁 전기화의 잠재력을 향상시키고 가까운 접촉을 확립하기 위해 이동하는 시간적이고 공간적으로 분리 된 세포 집단의 행동과 축축한 예측을 통한 장거리 상호 작용의 행동을 연구하여 시간적 및 경제적 비용을 줄이는 강력한 도구를 제공합니다.
Introduction
대뇌 피질은 매우 복잡하고 복잡하게 구성된 구조입니다. 이러한 정도의 조직을 달성하기 위해, 피질 프로젝션 뉴런은 측두생성을 필요로 하는 복잡한 발달 과정을 거치며, 피질 판의 최종 목적지로의 마이그레이션, 단거리 및 장거리 연결1,,2의확립을 통해 진행된다. 오랜 시간 동안, 코르티코 발생을 연구하는 고전적인 방법은 관심의 유전자의 녹아웃 또는 노크 에 뮤린 모델의 사용에 기초했다. 그러나, 이 전략, 특히 조건부 녹아웃 마우스의 사용은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며, 때로는 유전 적 중복의 존재 또는 특정 CRE 드라이버의 부족에 관한 추가 문제를 제시합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 발생 하는 접근 중 하나는 그 피 질 개발을 연구 하기 위해 요즘 광범위 하 게 사용 된다3,,4. 자궁 에서 전기 화는 신경 줄기 세포와 그들의 자손의 생체 표적을 허용, 체세포 전염에 사용되는 기술이다. 본 방법은 형광 단백질55, 6,6생체 내 유전자 조작을 위해 세포를 라벨링하는 데 사용할 수 있다 (즉, 기능 분석의 이득 또는 손실)7,,8,,9,시험관 내의 전기 폴화 코르티스를 분리하고 세포8,,10을배양하는 데 사용할 수 있다. 더욱이, 자궁 전기기화는 표적 영역의 시간적 및 지역 적 제어를 허용한다. 이 기술은 수많은 응용 프로그램을 가지고 널리 뉴런 마이그레이션을 연구하는 데 사용되어왔다, 줄기 세포 분열, 신경 연결, 및 기타 과목8,,9,,11,,12.
현재 원고는 자궁 전기 기형에서 이중이라고 불리는 자궁 전기 기형의 사용을 설명하며, 대뇌 피질에서 세포의 상호 작용을 서로 다른 측두및 공간 기원으로 분석합니다. 이러한 연구는 여러 형질 전환선의 결합 된 사용을 필요로하기 때문에 뮤린 모델을 사용할 때 완료하는 것은 매우 복잡합니다. 이 논문에 설명된 프로토콜의 응용 프로그램 중 일부는 이웃 세포 간의 긴밀한 상호 작용의 연구뿐만 아니라 장거리 투영을 통해 먼 세포 사이의 상호 작용을 포함한다. 이 방법은 관심의 다른 세포 집단을 표적으로 하기 위하여 동일한 배아에, 측면및 공간적으로 분리된 자궁 전기기 수술에서 2개의 독립적인 능력을 발휘하는 것을 요구합니다. 이 접근법의 장점은 야생 형 동물을 사용하여 뉴런의 하나 또는 둘 다 모형에서 유전자 기능을 조작의 가능성입니다. 또한, 이러한 기능적 실험은 심토플라스믹 또는 멤브레인 태그형 형광 단백질의 발현과 결합하여 물병막 및 축축을 포함한 표적 세포의 미세한 형태를 시각화하고, 대조군(즉, 형광 단백질로만 표지된 세포)과 비교하여 세포 상호 작용의 가능한 차이를 분석할 수 있다.
여기서 묘사된 프로토콜은 신피질 내부의 세포 상호 작용연구에 초점을 맞추고 있지만, 이 전략은 또한 소반15와같은 다른 구조물에서 피판또는 시상13,,14,또는 세포 세포 상호 작용과 같은 자궁 전기포레이션에서 표적화될 수 있는 외피 영역과의 상호 작용을 검사하는 데 사용될 수 있다. 다른 영역의 표적화는 전극의 방향과 DNA가 주입되는 심실 (측면, 세 번째 또는 네 번째)에 기초한다. 여기에 설명된 전략으로, 우리는 기능 실험에서 연결 / 내면의 일반적인 변화를 평가하는 데 유용한 셀의 상당수를 레이블수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 연결의 미세한 변화를 연구하기 위해, 하나는 스파저 라벨링을 얻고 단일세포(16)를식별하기 위해 자궁 전기화에서 수정된 버전을 사용할 수 있다. 요약하자면, 자궁 전기기의 이중은 일시적이고 공간적으로 분리된 세포 집단을 표적으로 하고 통제 조건에서 또는 기능 실험과 결합하여 현세및 경제적 비용을 상당히 줄이는 다목적 방법입니다.
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Protocol
본 명세서에서 설명된 절차는 실험, 유니버시다드 드 발렌시아의 동물 복지, 컨셀러디아 드 아그리컬투라를 담당하는 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 데사롤로 농촌, 이머젠시아 클리마티카 y 트랜스시시온 에콜로기카 코무니다드 발렌시아나, 스페인 법안의 실제 Decreto 53/2013에서 검토 된 실험실 동물 과학국제위원회 (ICLAS)의 지침을 준수하고 유럽 의회의 지침 2010/63 / EU.
참고: 이 프로토콜은 두 가지 목적을 포함: 1) 첫 번째 연구, 라고 "전략 A", Cajal-Retzius 세포 사이의 상호 작용의 분석을 허용 (CR 세포) 그리고 같은 뇌 반구 내에서 초기 태어난 피질 프로젝션 뉴런; 2) 두 번째 연구, "전략 B", 네오피질의 모순측에 상층 캘러솔 프로젝션 뉴런의 내면을 검사하기 위해 수행된다.
1. 수술 전 준비
- DNA 제제
- 화학적으로 또는 전기 유능한 대장균 DH5α 세포를 관심 있는 플라스미드로 변환하고, 적절한 항생제로 LB 천막판에 판상화하고, 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
참고: 여기에 사용되는 모든 플라스미드는 형광 기자 단백질(전략 A 및 CAG-BFP 및 CAG-nEGFP-2A-mtdTomato 전략 B용 CAG-mCherry 및 CAG-EGFP)의 발현을 구동하는 닭 β-actin(CAG)에 대한 일반 프로모터를 함유하고 있다. 그들 모두는 암피실린 (AMP)에 대한 내성을 함유하고 있습니다. - 각 플라스미드 변환에서 개별 식민지를 선택하고 활발한 흔들림 (200 rpm)에서 3-4 시간 동안 세균 배양 튜브에서 루리아 국물 + 암피실린 (LB + AMP)의 2 mL에서 스타터 액체 문화를 시작합니다. 후, 500 mL Erlenmeyer 플라스크에 더 큰 세균 문화를 설정 LB +AMP의 200 mL및 스타터 문화의 1 mL을 추가. 200 rpm에서 궤도 셰이커에서 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 액체 배양으로부터 순수하고 농축된 플라스미드 DNA를 얻기 위해제조업체의지시에 따라 내독소가 없는 맥시 준비 키트(재료 표)를 사용하십시오. DNA를 ~50-100 μL의 내독소가 없는 Tris-EDTA(TE) 버퍼에서 재생하여 최소 5μg/μL의 농도를 얻습니다.
- 각 수술에 대해, 빠른 녹색 염료1 μL을 포함하는 10 μL의 최종 부피, 각 플라스미드에 대한 1 μg/μL의 최종 농도에 대한 관심있는 플라스미드 DNA 용액, 및 내독신이없는 TE 버퍼로 용액을 준비한다. 예를 들어, 빠른 녹색 염료 1 μL, 5 μg/μL 플라스미드 DNA 용액의 2 μL 및 TE 버퍼7 μL을 혼합합니다.
- 화학적으로 또는 전기 유능한 대장균 DH5α 세포를 관심 있는 플라스미드로 변환하고, 적절한 항생제로 LB 천막판에 판상화하고, 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
- 파이펫 당기
- 팁이 1-1.5cm의 길이에 도달 할 때까지 수직 마이크로 피펫 풀러에 유리 모세 혈관 (1/0.58mm 외부 / 내지름)을 당겨 해부 범위에서 약 30 ° 각도로 해부 포셉을 사용하여 손질하십시오.
- 수술실 설정
- 모든 장비를 수술대에 놓습니다(예: 핀셋, 가위, 집게, 마이크로피펫, 바늘 및 바늘 홀더). 가열 패드를 켜고 멸균 수술 흡수 패드로 덮습니다. 흡입 마취를 위한 기계에 있는 저수지가 이소플루란으로 채워지고, 산소 탱크는 충분한 산소를 포함하고, 시스템이 제대로 작동하는지 확인합니다.
참고: 수술실과 내성 물질은 가능한 한 멸균상태로 유지해야 합니다(즉, 모든 재료는 수술 전에 자동 으로 보관되어야 하며 표면은 70%의 에탄올로 소독되어야 함). 백금 전극은 수술 전에 70%의 에탄올로 먼저 생식기용 비누로 먼저, 둘째를 신중하게 소독해야 합니다. - 페니실린-연쇄상 구균 1:100을 함유한 멸균 식염수 용액 100mL를 준비하여 10cm 페트리 접시를 채웁니다. 가열 패드 위에 접시를 올려 놓고 용액을 따뜻하게 합니다.
- 진통제 용액의 150 μL (예 : 0.1 mg / kg buprenorphine)로 1 mL 주사기를 채웁니다.
- 당겨진 파이펫을 1.1.4 단계로 제조한 최종 플라스미드 DNA 용액의 5μL로 적재한다. 모세관을 입으로 조절하는 흡인관 튜브에 연결합니다.
- 모든 장비를 수술대에 놓습니다(예: 핀셋, 가위, 집게, 마이크로피펫, 바늘 및 바늘 홀더). 가열 패드를 켜고 멸균 수술 흡수 패드로 덮습니다. 흡입 마취를 위한 기계에 있는 저수지가 이소플루란으로 채워지고, 산소 탱크는 충분한 산소를 포함하고, 시스템이 제대로 작동하는지 확인합니다.
2. 자궁 전기 기공 수술에서 첫 번째
- E11.5(전략 A) 또는 E13.5(전략 B) C57BL/6 임신 마우스를 폐쇄 유도 챔버 내부에 2.5% (v/v) 이소플루란을 0.8 L/min에 배치하고 마취될 때까지 기다린다. 가열 패드에 마우스를 전송하고 이소플루란의 지속적인 배달을 위해 마스크에 코를 넣어. 적절한 마취의 지표로 페달 반사의 부재를 확인합니다.
참고: Embryonic 나이는 질 플러그가 관찰되는 날에 따라 결정됩니다(E0.5). - 진통제 용액 (0.1 mg / kg buprenorphine)을 피하로 임신 한 여성을 주입하십시오. 시술 중에 눈이 건조되는 것을 방지하기 위해 면 봉면을 사용하여 각 눈에 눈 연고 한 방울을 바르십시오.
- 전기 면도기로 마우스 복부 부위를 면도하고 70 % (v / v) 에탄올 물티슈로 2배, 요오드 물티슈로 한 번, 마지막으로 에탄올 와이프로 세척합니다.
- 가위를 사용하여 동물의 오른쪽 피부를 통해 30mm 길이의 절개를 하고 인접한 피부를 무딘 주걱으로 근육과 조심스럽게 분리합니다. 그 후, 복 벽에 두 번째 절개를합니다.
- 이전에 그 중심에 40mm 긴 슬릿을 포함하는 70% 에탄올에 소독된 접힌 티슈 페이퍼 조각으로 복부를 덮습니다. 조심스럽게 반지 집게와 복강에서 자궁을 당깁니다.
참고: 자궁은 전체 절차 동안 1.3.2 단계에서 준비된 따뜻한 식염수 용액으로 젖게 유지되어야 합니다. - 1.1.4 단계에서 준비된 DNA 용액으로 끌어당겨진 파이펫을 미리 로드합니다. 빠른 녹색 염료가 심실 내부에서 눈에 띄는 때까지 입 제어 흡인관 튜브를 사용하여 선택된 반구의 측면 심실에 배아 당 DNA 용액의 ~0.5 μL을 주입한다.
- 주입된 배아의 머리 주위에 집게형 백금 전극을 측면으로 놓습니다(도 1A 및 도 2A에도시된 바와 같이). 원하는 뇌 영역을 대상으로 전극을 지향한다. 양극을 내측 벽쪽으로 지시하여 피질 옷자락(strategy A)을 전극화하거나 측면 피질(strategy B)을 향해 해당 영역에서 생성된 세포에 라벨을 부착합니다.
참고: 모든 경우에, 심혼및 태반은 배아 생존을 지키기 위하여 피해야 합니다. - 표 1에 표시된 표시에 따라 제곱파 전기포레이터로 전기 펄스의 특정 순서를 적용합니다 (전략 A E11.5 배아: 25 V와 40 ms의 4 개의 펄스, 950 ms 간격으로 분리; 전략 B E13.5 배아: 35 V와 60 ms의 5 펄스, 950 ms 간격).
- 조심스럽게 자궁을 집게로 다시 복강으로 놓고 따뜻한 식염수 용액으로 채우고 바늘 6-0 봉합사로 복벽을 닫습니다. 바늘 6-0 봉합사 또는 봉합사 클립을 사용하여 피부에 만든 초기 절개의 양면에 가입하십시오.
- 가열 패드에 동물을 유지하고 마취에서 회복 될 때까지 모니터링합니다. 홈 케이지에 배치된 하이드로겔 용액에 추가 용량의 진통(150 μL)을 제공합니다.
- 수술 후 24시간, 진통증(150 μL)의 추가 투여를 한다. 가능한 고통과 고통을 위해 육안 검사를 통해 매일 모니터링을 계속하십시오. 동물의 행동을 관찰하고, 정상적인 뒷다리 반사 신경을 테스트하고, 상처를 핥거나 긁는 것으로 인한 손상의 가능한 징후를 검사하십시오.
3. 자궁 전기 기화에서 두 번째
- 초기 수술 이틀 후, 2.1-2.3 단계를 반복합니다. 수술 후 임신 한 여성의 회복은 매우 좋지만, 두 번째 수술을 수행하기 전에 정상적인 행동을 보이고 통증이나 고통의 징후가 없는지 확인하십시오 (전략 A용 배아 및 전략 B용 E15.5).
- 2.4 단계와 복벽에서의 두 번째 절개와 같이 피부를 통해 30mm 길이의 절개를 하십시오. 2.5 단계에서 설명된 바와 같이 소독된 조직의 위에 자궁을 조심스럽게 노출시합니다.
참고: 이전에 다른 쪽에서 절개를 방해하지 않도록 주의하십시오. - 전략 A의 경우 이전에 전포된 반구의 측면 뇌 심실로 DNA 용액의 배아당 약 0.5 μL을 주입하고 전략 B를 위한 반구의 측면 뇌 심실에서.
참고: 정상적인 발달과 재흡수 의 징후가 없는 배아만 사용하십시오. - 2.7단계에서 설명된 바와 같이 배아의 머리 주위에 전극을 놓고, 측면 피질을 향해 양극을 지시하고 표 1에 표시된 표시에 따라 적절한 펄스를 적용합니다(전략 A E13.5 배아: 35V의 5펄스 및 60ms 의 5개의 펄스는 950ms 간격으로 분리됨; 전략 B E15.5 배아: 50 ms 간격의 5개의 펄스: 50ms 의 5개의 펄스)
- 단계 2.8-2.10에 설명 된 대로 수술을 계속하고 완료하십시오.
4. 조직 수확 및 단면
- 전략 A
- 제2 전기기(E17.5) 4일 후, 임산부의 자궁경부 탈구를 수행하고 척추 위치에 놓는다.
- 가위를 사용하여, 자궁 뿔을 추출하는 복부 절개를하고 집게와 함께 얼음에 배치 1x 인산 완충 식염수 (PBS)로 채워진 페트리 접시에 배치합니다.
참고: 저온으로 인해 배아의 마취가 가능합니다. - 핀셋을 사용하여 양수 낭에서 배아를 추출하고 모독으로 담금질범위 하에서 새로운 PBS가 채워진 페트리 접시로 옮습니다. 조심스럽게 집게를 사용하여 배아의 머리를 잡고 먼저 머리와 두개골을 통해 피부를 제거하기 위해 핀셋과 뇌 해부를 실시합니다. 주걱을 사용하여 노출된 뇌를 꺼냅니다.
- 숟가락으로 뇌를 수집하고 고정 용액으로 채워진 48 개의 우물 접시에 보관하십시오 (4 % [w / v] 파라 포름알데히드 [PFA] 1 x PBS). 예를 들어 반전된 피성 성현미경을 사용하여 뇌를 검사하여 두 전기기의 성공적인 결과를 즉시 테스트합니다.
- 궤도 셰이커에서 4°C에서 하룻밤 사이에 배아 뇌를 고정시하십시오. PFA의 흔적을 제거하기 위해 1 배 PBS로 세척하십시오. 그런 다음 항진균 방부제 (1 x PBS-0.05 % (w / v) 나트륨 아지드로 PBS로 전송합니다.
주의: PFA와 아지드 나트륨은 사용률 동안 특별한 예방 조치를 필요로 하는 세포 독성 화합물입니다. - 고정된 뇌를 4% (w/v) 낮은 융점 아가로즈를 1x PBS에 포함하고 고화될 때까지 ~10분 기다립니다. 관상 섹션을 얻기 위해 위쪽으로 향하는 후각 전구와 시아노아크라일트 접착제를 사용하여 진동 조직 홀더에 붙입니다.
- 진동을 시작하고 원하는 매개 변수를 선택하십시오: 100 μm 폭, 0.60 μm/s 속도, 진폭 0.60mm.
- 진동 용기 내부의 뇌를 확보하고, 1배 PBS 용액으로 채우고, 1x PBS-0.05%(w/v) 나트륨 아지드로 채워진 48개의 웰 플레이트에서 브러시의 도움으로 관상 연쇄 섹션을 수집하여 뇌의 완전한 묘사(예: 잘 섹션 당 약 7개, 배아당 6개)를 수집합니다.
- 미세 브러시를 사용하여 현미경 유리 슬라이드에 원하는 섹션을 마운트합니다. 유리 커버립으로 덮습니다. 장기 보관을 위해 광표백 및 광광산화를 방지하는 마운팅 매체를 추가합니다. 수직 성피 형광 현미경의 밑에 슬라이드를 관찰하여 전기 기화 효능을 평가합니다.
- 전략 B
- 이전에 E13.5 및 E15.5에서 전기포게 된 새끼를 태어나P15까지 기다려 4.1.4 단계에서 사용되는 동일한 고정 용액을 사용하여 경전 관류를 수행하십시오.
- 관류 직전에, 인트라피톤으로 75/1 mg/kg 케타민/메데토미딘의 복용량을 투여합니다. 페달 반사가 손실되면 마우스를 supine 위치에 고정하고 가위를 사용하여 중간 선에 따라 복부 절개를 하여 갈비뼈 케이지와 다이어프램을 모두 노출시합니다.
- 다이어프램을 자르고 흉곽을 열어 심장에 접근할 수 있습니다. 헤스타트(hemostat)를 사용하여 흉곽을 잡고 오른쪽 아트리움에 미세한 가위로 절개를 합니다.
- 유연한 튜브와 연동 성 관펌프에 바늘로 왼쪽 심실을 관통한다. 5.5mL/min(총 시간 ~5분)의 일정한 플럭스에서 4% PFA의 최소 25mL를 전달하여 경질 관류를 시작합니다.
- 인퓨전된 동물의 뇌를 해부한다. 먼저 가위와 집게로 머리 위로 피부를 제거합니다. 가위를 사용하여 두개골을 자르기 시작하고 두개골 뼈가 완전히 제거 될 때까지 조심스럽게 두개골 뼈의 부분을 제거하십시오. 마지막으로, 주걱의 도움으로 뇌를 추출합니다.
- 뇌를 24개의 웰 플레이트로 옮기고 궤도 셰이커에서 4°C에서 하룻밤 사이에 4% PFA로 고정합니다. PBS에서 PFA를 0.05%(w/v) 나트륨 아지드로 교체하여 고정을 중지합니다.
참고: 4.1.5 단계에서 표시된 바와 같이, 1배 PBS로 중간 세척을 수행하는 것이 좋습니다. - 반복 단계 4.1.6-4.1.9, 산후 뇌에 대한 진동 파라미터를 변경 (40 μm 폭, 1.20 μm / s 속도, 진폭0.5 mm).
참고: 면역히스토케 또는 면역형광은 특정 세포 마커를 검출하거나 전기기화에 사용되는 형광 단백질의 신호를 향상시키기 위해 수행될 수 있다.
5. 공초점 형광 이미징 및 분석
- 공초점 현미경을 켜고, 장착 된 뇌 섹션을 포함하는 현미경 슬라이드를 현미경 슬라이드 홀더에 배치하고 형광 이미지가 촬영될 채널을 선택하십시오 (즉, BFP의 경우 420-460 nm, GFP용 490-540 nm, GFP용 490-620 nm 및 570-620 nm).
- 샘플 스캐닝을 수행하여 두 개의 서로 다른 파장에서 각 뇌 섹션의 맵 이미지를 얻어 이중 전기기 출력의 일반적인 뷰를 확인합니다. 완료되면 10x 렌즈와 다중 영역-Z 스택-타임랩스 관찰 모드를 선택합니다. 이를 통해 뇌 섹션 내의 다양한 XYZ 국소화에서 형광 이미지의 자동 획득을 할 수 있습니다.
- 선택된 각 영역(XY)에서 적절한 이미징 파라미터(즉, 레이저 강도, 광증 감도 및 최소 해상도 1,024 x 1,024)를 설정하고 형광이 보이는 샘플의 평면에 따라 스캐닝(Z)의 깊이를 설정한다.
- 선택한 모든 영역의 낮은 배율(10배) 이미지를 얻고 현미경 뷰어 소프트웨어를 사용하여 OIF에서 TIFF 형식으로 내보냅니다.
- 60x 렌즈로 변경하고, 5.3단계를 반복하고, 높은 배율 영상을 캡처하여 세포-세포 상호 작용을 보다 상세한 방식으로 관찰한다. 5.4 단계에서 표시된 대로 내보냅니다.
- 추가 분석을 위해 모든 이미징 소프트웨어(예: 피지)로 획득한 이미지를 엽니다.
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Representative Results
인접한 세포 간의 상호 작용은 탈구 장소와 다른 시간에 유래: 카잘-레치우스 세포 (CR 세포) 및 초기 마이그레이션 피질 프로젝션 뉴런 (전략 A)
CR 세포와 초기 피질 프로젝션 뉴런의 상호 작용은 이전에 이중 전기 기화 전략8을사용하여 nectin 및 cadherin 접착 분자를 통해 소피 전이를 조절하는 데 필요한 것으로 설명되었다. CR 세포는 칼륨의 가장자리에서 신경 피상에서 유래하고 피질의 가장 피상적 인 부분을 채우기 위해 접선으로 이동, 한계 영역17,,18,,19,피질 프로젝션 뉴런은 대뇌 피질의 증식 영역에서 생성되고 비천성20으로라디로 이동. 두 가지 유형의 세포의 생성에는 현세적인 차이가 있습니다. CR 세포는 E10.521,,22 및 소피 전좌에 의해 이동하는 피질 프로젝션 뉴런으로부터 매우 초기 배아 단계에서 생성되며 E12.5-E13.523에서태어납니다. 자궁 전기기분기에서 이중을 사용하여 수술 사이의 측두엽간격은 E13.5(그림1A)에표지된 피질 프로젝션 뉴런과 접촉하기 위해 소마토 감각 영역을 포함한 측면 신피질의 한계 영역에 도달하기 위해 기원(피질 옷자임)B중 하나에서 E11.5를 대상으로 하는 CR 세포를 허용합니다. 향상된 GFP(EGFP)를 발현하는 프로젝션 뉴런의 주요 과정은 피질의 한계 영역에서 교묘하게 식소하고 mCherry(도1C)를표현하는 CR 세포의 과정과 혼합한다. 기능실험은 프로젝션 뉴런 또는 CR 세포에 의해 발현된 세포 세포 접착 분자의 교란이 두 세포 유형8사이의 변경된 접촉의 결과로 그들의 프로세스의 식소에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다.
다른 시간에 생성된 말단 세포 사이의 장거리 상호 작용: 네오피질의 모순된 면에 상층 캘러솔 프로젝션 뉴런의 내적 (전략 B)
캘로살 피질 프로젝션 뉴런은 대뇌 피질 전체에 존재하며,상층(24)에서더 풍부하다. 이러한 뉴런은 코퍼스 캘로섬을 통해 축삭을 투사하고 대상 세포에 접촉하여, 콘트라탈 피질(25,26,27)의상이한 층에 걸쳐 위치한 프로젝션 뉴런을 접촉한다.,, 상층 프로젝션 뉴런은 하층 뉴런보다 진화적으로 최신이며영장류(28)에서크게 확장되었다. 이 세포는 복잡한 생각및 더 높은 연관 업무를 위해 중요하고, 세포의 이 인구에 의해 구체적으로 표현된 유전자의 단에 있는 역기능은 최근에 자폐증과 관련되었습니다29.
특히 상층부에 위치한 캘러솔프로젝션 뉴런의 하위집단의 상호작용을 연구하기 위해, 우리는 대문자 반구전체에 분포된 표적 세포와 함께 상층에서, 자궁 전기기화 프로토콜에서 이중을 개발하였다. 상층 캘러솔프로젝션 뉴런의 표적 세포를 라벨화하기 위해 우리는 플라스미드를 발현하는 BFP를 사용하여 E13.5에서 자궁 전기포화에서 수행하였다(도2A-C). 이 나이는 많은 층-V 뉴런을 포함하여 광범위한 피질 프로젝션 뉴런 집단의 타겟팅뿐만 아니라 상층(도2C)에위치한 상당한 수의 뉴런을 대상으로 할 수 있기 때문에 전략적으로 선택되었으며, 기본적으로 상반구에서 칼약 프로젝션 뉴런의 모든 표적 영역을 포괄한다. E15.5에서 의 반자 측에서 제2 전기기화는 상층 캘러솔프로젝션 뉴런 하위집단(nEGFP 및 mtdTomato을 표현)(도2A,B,D)을표적으로 했지만, 이전 연령대에서 태어난 하층 프로젝션 뉴런은 아니었다. 이기종 이중 전기화의 필요성은 따라서 관심의 투영 세포와 그(것)들에 의해 내면화된 세포의 생성에 있는 다른 시간 때문에 정당화되었습니다. 그 상부 층 표적 뉴런은 특징적인 수복 패턴(도 2C)를가진 반대반구로 그들의 축삭을 보냅니다. 이 전형적인 축소 절기 패턴의 차이는 이 이중 전기 포기 프로토콜을 사용하여 표적 세포에서 함수 실험의 이득 또는 손실에 따라 평가될 수 있었다. 높은 배율 분석은 칼약 축삭이 콘트라탈반구에서 표적 프로젝션 뉴런을 내면으로 부디(그림2E)를자세히 나타낸다.
그림 1: 전략 A. 다른 공간 및 측두색 기원을 가진 세포 간의 긴밀한 상호 작용을 연구하는 자궁 전기 기화 전략에서 이중. (A)EGFP를 발현하는 mCherry 및 피질 프로젝션 뉴런을 발현하는 CR 세포를 표적으로 하는 데 사용되는 프로토콜의 회로도. (B)피질 옷자단과 측면 피질에서 이중 전기화 후 뇌의 관상 부란부분의 대표적인 이미지. 피질 옷자다 (빨간색)를 대상으로 한 세포는 신피질의 한계 영역을 채우고 접선으로 이동합니다. 피질의 심실 영역에 표지된 세포는 초기 피질 판에 들어가기 위해 방사형으로 이동하는 피질 프로젝션 뉴런(green)을 생성한다. 스케일 바 = 200 μm.(C)패널 B에 박스형 영역의 배율은 이중 전기포기 프로토콜 이후에 표기된 측면 피질 과 두 가지 유형의 세포를 표시한다. 대시 선은 한계 영역과 피질 플레이트를 프레임. 스케일 바 = 100 μm. 오른쪽의 높은 배율은 CR 세포 체및 공정과 혼합된 프로젝션 뉴런의 돌출된 선행 공정을 포함하는 한계 영역의 세부 사항을 나타낸다. 스케일 바 = 10 μm. Ctx = 피질; 헴 = 피질 단자; MZ = 한계 영역; CP = 피질 플레이트; IZ = 중간 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 전략 B. 이중 전기 기공 전략 은 다른 공간 및 측두색 기원을 가진 세포 간의 장거리 상호 작용을 연구합니다. (A)자궁에서 이중으로 상반구의 소마토 감각 영역을 포함하는 측면 신피질에서 피질 프로젝션 뉴런의 상이한 집단을 표적으로 하는 전략을 표시하는 방식이다. E13.5를 표적으로 한 오른쪽 반구의 소마토 감각 피질에 있는 프로젝션 뉴런은 BFP를 발현했다. E15.5 발현 핵 EGFP (nEGFP) 및 멤브레인 표적 tdTomato (mtdTomato)를 대상으로 한 콘트라탈 측의 표적 프로젝션 뉴런. (B)패널 A에서언급 된 플라스미드와 이중 전기 화 수술을 받은 뇌의 관상 섹션의 대표적인 이미지 . BFP 또는 nEGFP에 의해 표지된 세포의 상이한 분포및 E15.5에 표지된 상층 캘러솔 프로젝션 뉴런(mtdTomato)의 축축의 강렬한 라벨을 참고한다. 스케일 바 = 500 μm.(C)이중 전극 된 뇌에서 오른쪽 반구에 위치한 소마토 감각 피질의 이미지. 상반구를 대상으로 한 프로젝션 뉴런(blue)의 광범위한 분포와 캘러솔 축삭(빨간색)의 절제된 식소에 유의하십시오. 스케일 바 = 100 μm.(D)이중 전극 뇌의 왼쪽 반구에서 의 색소 감각 피질의 이미지. nEGFP(green)의 발현에 의해 도시된 바와 같이 피질 판의 상부에서 표적 프로젝션 뉴런의 분리된 국소화뿐만 아니라 주변 세포 체 및 모든 뉴런 프로젝션(red)을 적색 라벨링하는 유술적 색라벨을 주목한다. 스케일 바 = 100 μm.(E)표적 프로젝션 뉴런 주위의 칼로살 축삭의 식소의 세부 사항을 보여주는 오른쪽 반구의 소마토 감각 피질의 높은 배율 사진. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 전략 | 전기 기공 의 순서 | 대상 셀 | 대상 지역 | 심실 주입 | 전극의 위치 | 전압 및 펄스 | 사용되는 플라스미드 | 분석 의 시대 |
| A | 첫 번째 | E11.5의 CR 셀 | 피질 헴 | 왼쪽 | 왼쪽 반구에서 양수(내측 벽을 향) | 25 V, 40 ms, 4p | CAG-mCherry | E17.5 |
| 두 번째 | E13.5에서 피질 프로젝션 뉴런 | 소마토 감각 피질 | 왼쪽 | 왼쪽 반구에서 양수 | 35 V, 60 ms, 5p | CAG-EGFP | ||
| (피질을 향하여) | ||||||||
| B | 첫 번째 | E13.5에서 피질 프로젝션 뉴런 | 소마토 감각 피질 | 오른쪽 | 오른쪽 반구에서 긍정적 | 35 V, 60 ms, 5p | CAG-BFP | P15 |
| (피질을 향하여) | ||||||||
| 두 번째 | E15.5에서 피질 프로젝션 뉴런 | 소마토 감각 피질 | 왼쪽 | 왼쪽 반구에서 양수 | 50 V, 80 ms, 5p | CAG-nEGFP-2A-mTd토마토 | ||
| (피질을 향하여) |
표 1: 다른 실험에 사용되는 전기 기화 조건의 요약.
| 전략 A에서 자궁 전기 포기에서 이중 다음 배아의 생존 | |||||||||
| 쓰레기 수 | 배아의 초기 수 | 첫 번째 EP에서 살아남은 배아의 수 | 두 번째 EP에서 살아남은 배아 수 | 첫 번째 EP 후 생존의 % | 두 번째 EP 후 생존의 % * | 글로벌 생존율의 % | |||
| 9 | 총 수 | (평균 쓰레기 ± SD) | 총 수 | (평균 쓰레기 ± SD) | 총 수 | (평균 쓰레기 ± SD) | 75% | 83.33% | 62.50% |
| 64 | 7.11 ± 2.08 | 48 | 5.33 ± 1.22 | 40 | 4.44 ± 1.01 | ||||
| 첫 번째 EP 후 중단 된 배아의 수 | 두 번째 EP 이후 중단된 배아의 수 | 낙태된 배아의 총 수 | 첫 번째 EP 이후 낙태의 % | 두 번째 EP 후 낙태의 % * | 세계 낙태율의 % | ||||
| 총 수 | (평균 쓰레기 ± SD) | 총 수 | (평균 쓰레기 ± SD) | 총 수 | (평균 쓰레기 ± SD) | 25% | 16.66% | 37.50% | |
| 16 | 1.8 ± 1.09 | 8 | 0.88 ± 0.78 | 24 | 2.67 ± 1.32 | ||||
| *생존과 낙태는 첫 번째 전기 화에서 살아남은 배아를 고려하여 계산되었습니다. | |||||||||
표 2: 전략 A에서 자궁 전기포이션에서 이중으로 다음 배아의 생존.
| 전략 B (더블 EP E13.5 및 E15.5) 다음 배아와 새끼의 생존 | |||||||||||
| 쓰레기 수 | 배아의 초기 수 | 첫 번째 EP에서 살아남은 배아의 수 | 더블 EP 이후 태어난 새끼의 수 | P15에서 살아남은 배아의 수 | 첫 번째 EP 후 생존의 % | 두 번째 EP 후 생존의 % | P15에서 생존의 % | ||||
| 8 | 총 수 | (평균 쓰레기 ± SD) | 총 수 | (평균 쓰레기 ± SD) | 총 수 | (평균 쓰레기 ± SD) | 총 수 | (평균 쓰레기 ± SD) | 88.46% | 82.69% | 55.77% |
| 52 | 6.5 ±2] | 46 | 5.75 ± 2.05 | 43 | 5.38 ± 1.77 | 29 | 3.63 ± 1.6 | ||||
| E13.5에서 단일 EP 에 이어 배아와 새끼의 생존 | ||||||||
| 쓰레기 수 | 배아의 초기 수 | EP 이후 태어난 새끼 의 수 | P15에서 살아남은 배아의 수 | EP 후 생존의 % | P15에서 생존의 % | |||
| 11 | 총 수 | (평균 쓰레기 ± SD) | 총 수 | (평균 쓰레기 ± SD) | 총 수 | (평균 쓰레기 ± SD) | 89.74% | 57.69% |
| 78 | 7.1 ± 1.64 | 70 | 6.36 ± 1.7 | 45 | 4.09 ± 2.07 | |||
표 3: 간단한 전기기화에 비해 전략 B에서 자궁 전기 기화에서 이중 다음 새끼의 생존.
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Discussion
대뇌 피질 같이 높은 세포 밀도를 가진 지구에 있는 세포 세포 상호 작용의 연구 결과는 복잡한 작업입니다. 중성염을 표지하기 위해 항체의 사용을 포함하는 전통적인 접근은 다른 세포 집단을 위한 특정 마커의 부족 때문에 적합하지 않습니다. 특정 세포 유형이 형광성 단백질을 표현하는 형질 전환 기 의 뮤린 모델의 사용은 뉴런 프로세스를 시각화하는 데 유용하지만, 이것은 그러한 모델의 가용성에 달려 있습니다. 이 작업은 관심있는 유전자의 교란시 두 특정 세포 유형 사이의 상호 작용에 가능한 차이를 시각화하려고 할 때 더욱 복잡합니다. 이러한 모든 문제는 경제적 및 현세적 비용으로 인해 과거에 이러한 연구를 복잡하게 만들었습니다.
자궁 전기 기화와 같은 생체 내 체세포 전이를 허용하는 새로운 기술의 출현은 결합 된 기자와 녹아웃 동물의 사용 또는 생성을 우회하는이 프로토콜에 설명 된 것과 같은 전략을 설계 할 수있는 가능성을 제공하여 이러한 유형의 실험을 보다 실현 가능하게 만듭니다. 이 간행물과 이전에 간행된 연구결과 8이 프로토콜 1)이 성공적으로 다른 시간및 공간 기원을 가진 세포 집단의 표적화를 허용한다는 것을 보여줍니다; 2) 고해상도로 세포 세포 접촉의 시각화를 가능하게 한다; 및 3) 기능적 실험 후 세포 접촉의 차이를 검출하는 데 유용하다.
자궁 전기기화의 광범위한 사용에도 불구하고,이 기술은 안전하게 수술을 수행하고, 그들을 손상시키지 않고 배아를 조작하고, 원하는 영역의 올바른 표적을 보장하기 위해 상당한 훈련이 필요합니다. 그러나, 이 훈련 후에, 임신한 여성의 생존은 우수합니다 (우리의 손에 약 100%) 그리고 우리는 자궁 전기화에 있는 단 하나 및 이중 사이 아무 다름을 발견하지 않았습니다. 단일 및 이중 전극 임산부는 수술에서 매우 빠르게 회복됩니다. 대부분의 경우, 단일 또는 이중 수술 다음날 그들의 행동은 정상으로 보이며 이 임신 한 여성은 통증과 고통의 명백한 징후없이 어려움없이 먹고, 마시고, 걷고, 심지어 등반합니다.
제1 및 제2 전기포이션 후 배아의 생존도 전반적으로 양호하며, 배아의 나이가 증가함에 따라 낙태율이 감소한다(표2 및 표 3). 주요 난이도는 두 전기 기화에서 성공적인 타겟팅입니다. E13.5의 오래된 배아를 사용하면 성공 정도가 매우 높습니다. E11.5와 같은 초기 연령은 배아의 작은 크기로 인해 처리 및 주사가 더 어려워지므로 생존에 영향을 미칩니다. 그러나, 제1 E11.5 전기기화에서 살아남은 배아는 E13.5(표2)에서제2 전기기화 후 생존율이 매우 양호하다. 이 기술로 숙련도를 향상시키기 위해 ~ E14.5에서 새끼에 수술을 연습하고 젊은 나이에 점진적으로 수술을 시도하는 것이 좋습니다.
또 다른 과제는 수술을 받은 산모가 항상 새끼를 모두 돌보는 것은 아니기 때문에 출생 후 생존입니다.Table 3 우리의 손에, 그리고 여기에 설명 된 타이밍으로, 우리는 간단하고 이중 전기 화 후 산후 생존에 중요한 차이를 찾을 수 없습니다(표 3),하지만 가능한 생존 문제를 회피하기 위해 새끼는 출생시 가난한 모성 행동을 표시 할 때 출산 시 어머니를 양육하기 위해 전달 될 수있다. 출산 일자 이전에 임신 한 여성에게 여분의 중첩 재료와 풍부한 음식을 제공하는 것도 새끼의 생존율을 높이는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 전략의 주요 장점 중 하나는 기능적 연구를 위한 야생형 마우스의 사용이지만, 예를 들어, 관심 유전자에 대한 CRE 기자 마우스 또는 플로크스 마우스에 적용될 수 있다. 이들 마우스에서, PLAsmids를 발현하는 CRE-재조합의 전기포기는 표적 세포에서 각각 원하는 유전자의 리포터 유전자 또는 불활성화의 영구적인 발현을 허용할 것이다. 기능적 실험의 경우, 우리는 또한 관심의 셀 유형에서만 구조의 발현을 제어할 수 있습니다. 예를 들어, 신경 발기인은 신경 줄기 세포가 아닌 뉴런에서만 후보 유전자를 조작하는 데 사용할 수 있으므로 전조기 수준에서 원치 않는 효과를 방지할 수 있습니다. 이러한 모든 고려 사항은 시간 및 표적 영역의 제어와 함께 자궁 전기기에서 이중으로 피질 내부뿐만 아니라 이 기술을 사용하여 표적으로 할 수있는 다른 구조에서 세포 세포 상호 작용을 연구하는 매우 다재 다능한 기술입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 크리스티나 안드레스 카보넬과 유니버시다드 드 발렌시아의 동물 관리 시설 회원들에게 기술 지원을 해 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 시약과 우리와 함께 장비를 공유 이사벨 파리냐스와 새크라멘토 R. 페론에 감사드립니다. I.M.W는 콘셀러티아 드 에두카시온 드 발렌시아 (GJIDI/2018/A/221)의 가란시아 주베닐 계약에 의해 지원되며, D.dA.D는 장관 드 시엔시아, 이유니베르시다데스(MICINN) (FPI-PRE2018-08)의 자금을 지원받습니다. C.Gil-Sanz는 스페인 장관 인 이엔시아, 이노바시온 y 유니버시다데스 (MICINN)에서 라몬 y 카잘 그랜트 (RYC-2015-19058)를 보유하고 있습니다. 이 작품은 RYC-2015-19058 및 SAF2017-82880-R (MICINN)에 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
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