Summary
Dubbel in utero elektroporatie maakt het richten van celpopulaties die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden. Deze techniek is nuttig om interacties tussen die celpopulaties te visualiseren met behulp van fluorescerende eiwitten in normale omstandigheden, maar ook na functionele experimenten om genen van belang te verstoren.
Abstract
In utero elektroporatie is een in vivo DNA-overdracht techniek op grote schaal gebruikt om de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan zoogdier corticogenese te bestuderen. Deze procedure maakt gebruik van de hersenventrikels om de introductie van DNA van belang mogelijk te maken en maakt gebruik van een paar elektroden om de ingang van het genetisch materiaal in de cellen langs de ventrikel, de neurale stamcellen, te leiden. Deze methode stelt onderzoekers in staat om de gewenste cellen te labelen en/of de expressie van genen van belang in die cellen te manipuleren. Het heeft meerdere toepassingen, waaronder tests gericht op neuronale migratie, lineage tracing, en axonale pathfinding. Een belangrijk kenmerk van deze methode is de temporele en regionale controle, waardoor het omzeilen van mogelijke problemen in verband met embryonale dodelijkheid of het ontbreken van specifieke CRE-bestuurdersmuizen mogelijk is. Een ander relevant aspect van deze techniek is dat het helpt om de economische en temporele beperkingen die het genereren van nieuwe muislijnen te betrekken aanzienlijk verminderen, die bijzonder belangrijk worden in de studie van interacties tussen celtypen die afkomstig zijn uit verre gebieden van de hersenen op verschillende ontwikkelingsleeftijden. Hier beschrijven we een dubbele elektroporatiestrategie die het mogelijk maakt om celpopulaties te targeten die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden zijn. Met deze aanpak kunnen we verschillende subtypes van cellen op verschillende locaties labelen met geselecteerde fluorescerende eiwitten om ze te visualiseren, en/of we kunnen genen van belang manipuleren die door deze verschillende cellen op de juiste tijdstippen worden uitgedrukt. Deze strategie verbetert het potentieel van in utero elektroporatie en biedt een krachtig hulpmiddel om het gedrag van tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te bestuderen die migreren om nauwe contacten te leggen, evenals lange-afstandsinteracties door middel van axonale projecties, waardoor de temporele en economische kosten worden verminderd.
Introduction
De hersenschors is een zeer complexe en ingewikkeld georganiseerde structuur. Om een dergelijke mate van organisatie te bereiken, corticale projectie neuronen gaan door middel van complexe ontwikkelingsprocessen die hun temporele generatie vereisen, migratie naar hun eindbestemming in de corticale plaat, en de oprichting van korte- en lange afstand verbindingen1,2. Lange tijd was de klassieke manier om corticogenese te bestuderen gebaseerd op het gebruik van knock-out- of knock-in murinemodellen van genen van belang. Deze strategie, en met name het gebruik van voorwaardelijke knock-outmuizen, is echter tijdrovend en duur en levert soms extra problemen op met betrekking tot het bestaan van genetische redundantie of het ontbreken van specifieke CRE-drivers, onder andere kwesties. Een van de benaderingen die ontstond om te proberen deze problemen aan te pakken en die tegenwoordig op grote schaal wordt gebruikt om corticale ontwikkeling te bestuderen is in utero elektroporatie3,4. In utero elektroporatie is een techniek die wordt gebruikt voor somatische transgenese, waardoor in vivo targeting van neurale stamcellen en hun nakomelingen. Deze methode kan worden gebruikt om cellen te labelen door de expressie van fluorescerende eiwitten5,6, voor genmanipulatie in vivo (d.w.z. winst of verlies van functietesten)7,8,9, voor het isoleren van elektrogevormde cortices in vitro en culturing cellen8,10. Bovendien, in utero elektroporatie maakt tijdelijke en regionale controle van het beoogde gebied. Deze techniek heeft tal van toepassingen en is op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van neuronale migratie, stamceldeling, neuronale connectiviteit, en andere onderwerpen8,9,11,12.
Het huidige manuscript beschrijft het gebruik van een in utero elektroporatie variant, dubbel genoemd in utero elektroporatie, om de interacties van cellen in de hersenschors met verschillende temporele en ruimtelijke oorsprong te analyseren. Deze studies zijn uiterst complex om te voltooien bij het gebruik van murine modellen, omdat ze het gecombineerde gebruik van verschillende transgene lijnen vereisen. Enkele van de toepassingen van het protocol beschreven in dit document omvatten de studie van nauwe interacties tussen naburige cellen, evenals interacties tussen verre cellen door middel van lange afstand projecties. De methode vereist het uitvoeren van twee onafhankelijke in utero elektroporatie operaties, tijdelijk gescheiden en ruimtelijk, op dezelfde embryo's om verschillende cel populaties van belang te richten. Het voordeel van deze aanpak is de mogelijkheid van het manipuleren van de genfunctie in een of beide soorten neuronen met behulp van wilde type dieren. Bovendien kunnen deze functionele experimenten worden gecombineerd met de expressie van cytoplasmatische of membraangelabelde fluorescerende eiwitten om de fijne morfologie van gerichte cellen, inclusief dendrieten en axonen, te visualiseren en mogelijke verschillen in cellulaire interacties te analyseren in vergelijking met een controle (d.w.z. cellen die alleen zijn gelabeld met het fluorescerende eiwit).
Het hier afgebakende protocol is gericht op de studie van cellulaire interacties binnen de neocortex, maar deze strategie kan ook worden gebruikt om interacties met extracortical gebieden te onderzoeken die kunnen worden gericht met behulp van utero-elektroporatie, zoals het subpallium of de thalamus13,14, of celcelinteracties in andere structuren, zoals het cerebellum15. Targeting van verschillende gebieden is gebaseerd op de oriëntatie van de elektroden en op de ventrikel waar het DNA wordt geïnjecteerd (laterale, derde of vierde). Met de hier beschreven strategie kunnen we een aanzienlijk aantal cellen labelen, wat handig is om algemene veranderingen in connectiviteit/innervatie in functionele experimenten te evalueren. Niettemin, om fijne veranderingen in connectiviteit te bestuderen, kan men gewijzigde versies van in utero elektroporatie gebruiken om sparser het etiketteren te krijgen en enige cellen16te identificeren. Samengevat, dubbel in utero elektroporatie is een veelzijdige methode die het mogelijk maakt gericht tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties en het bestuderen van hun interacties in detail, hetzij in controleomstandigheden of in combinatie met functionele experimenten, aanzienlijk verminderen van tijdelijke en economische kosten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hierin beschreven procedure is goedgekeurd door de ethische commissie belast met experimenten, het dierenwelzijn van de Universidad de Valencia en de Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Transición Ecológica of the Comunidad Valenciana, and adheres to the guidelines of the International Council for Laboratory Animal Science (ICLAS) reviewed in the Real Decreto 53/2013 of the Spanish legislation as in the Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council.
OPMERKING: Dit protocol omvat twee verschillende doeleinden: 1) de eerste studie, aangeduid als "strategie A", maakt de analyse van de interacties tussen Cajal-Retzius cellen (CR-cellen) en early-born corticale projectie neuronen binnen dezelfde hersenhald; 2) de tweede studie, "strategie B", wordt uitgevoerd om de innervatie van de bovenste laag callosale projectieneuronen aan de contralaterale kant van de neocortex te onderzoeken.
1. Voorbereiding van de prechirurgie
- DNA-voorbereiding
- Transformeer chemisch of elektrocompetent E. coli DH5α cellen met de plasmiden van belang, plaat ze op LB agar platen met het juiste antibioticum, en incubeer ze 's nachts bij 37 °C.
OPMERKING: Alle plasmiden die hier worden gebruikt bevatten de algemene promotor voor kip β-actin (CAG) die de expressie van een fluorescerend-reporter eiwit (CAG-mCherry en CAG-EGFP voor strategie A en CAG-BFP en CAG-nEGFP-2A-mtdTomato voor strategie B) aandrijft. Ze bevatten allemaal weerstand tegen ampicilline (AMP). - Kies individuele kolonies uit elke plasmidetransformatie en start een starter vloeibare cultuur in 2 mL Luria bouillon + ampicillin (LB+AMP) in bacteriële kweekbuizen tijdens 3−4 h bij 37 °C met krachtig schudden (200 rpm). Daarna, stel een grotere bacteriële cultuur in een 500 mL Erlenmeyer kolf toe te voegen 200 mL van LB + AMP en 1 mL van de starter cultuur. Incubeer 's nachts bij 37 °C in de orbitale shaker bij 200 rpm.
- Gebruik een endotoxine-vrije maxi-prep kit (Tabel van materialen) volgens de instructies van de fabrikant om zuiver en geconcentreerd plasmide DNA te verkrijgen uit de vloeibare culturen. Resuspend het DNA in ~50−100 μL endotoxinevrije Tris-EDTA buffer (TE) om concentraties van ten minste 5 μg/μL te verkrijgen.
- Bereid voor elke operatie een oplossing voor met een eindvolume van 10 μL met 1 μL snelle groene kleurstof, plasmide DNA-oplossing van belang voor een uiteindelijke concentratie van 1 μg/μL voor elke plasmide en endotoxinevrije TE-buffer. Meng bijvoorbeeld 1 μL snelle groene kleurstof, 2 μL van een 5 μg/μL plasmide DNA-oplossing en 7 μL TE-buffer.
- Transformeer chemisch of elektrocompetent E. coli DH5α cellen met de plasmiden van belang, plaat ze op LB agar platen met het juiste antibioticum, en incubeer ze 's nachts bij 37 °C.
- Het trekken van Pipette
- Trek borosilicaatglazen haarvaten (1/0,58 mm buiten/binnendiameter) in een verticale micropipettrekker tot de punt een lengte van 1−1,5 cm bereikt en snijd deze met behulp van ontledende tangen onder een hoek van ongeveer 30° onder een ontleden toepassingsgebied.
- Chirurgie kamer setup
- Leg alle apparatuur op de operatietafel (d.w.z. pincet, schaar, tang, micropipetten, naald en naaldhouder). Zet het verwarmingskussen aan en bedek het met een steriel chirurgisch absorberend kussen. Zorg ervoor dat het reservoir in de machine voor inademing anesthesie is gevuld met isofluraan, de zuurstoftank voldoende zuurstof bevat en het systeem goed functioneert.
OPMERKING: De operatiekamer en het resistente materiaal moeten zo steriel mogelijk worden gehouden (d.w.z. al het materiaal moet vóór de operatie worden geautolaveerd en oppervlakken moeten worden ontsmet met 70% ethanol). Platina elektroden moeten eerst zorgvuldig worden ontsmet met kiemdodende zeep en ten tweede met 70% ethanol voorafgaand aan de operatie. - Bereid 100 mL van 0,9% (w/v) steriele zoutoplossing met penicilline-streptomycine 1:100 en vul een petrischaaltje van 10 cm. Leg de plaat bovenop het verwarmde pad om de oplossing op te warmen.
- Vul een spuit van 1 mL met 150 μL pijnstillende oplossing (bijvoorbeeld 0,1 mg/kg buprenorfine).
- Laad de getrokken pipet met 5 μL van de uiteindelijke plasmide DNA-oplossing bereid in stap 1.1.4. Sluit de capillaire aan op een mondgestuurde aspiratorbuis.
- Leg alle apparatuur op de operatietafel (d.w.z. pincet, schaar, tang, micropipetten, naald en naaldhouder). Zet het verwarmingskussen aan en bedek het met een steriel chirurgisch absorberend kussen. Zorg ervoor dat het reservoir in de machine voor inademing anesthesie is gevuld met isofluraan, de zuurstoftank voldoende zuurstof bevat en het systeem goed functioneert.
2. Eerste in utero elektroporatie chirurgie
- Plaats een E11.5 (strategie A) of E13.5 (strategie B) C57BL/6 zwangere muis in een gesloten inductiekamer met 2,5% (v/v) isoflurane op 0,8 L/min en wacht tot deze verdoofd is. Breng de muis naar het verwarmingskussen en zet zijn neus in een masker voor constante levering van isoflurane. Controleer op de afwezigheid van een pedaalreflex als indicator van de juiste anesthesie.
OPMERKING: Embryonic leeftijd wordt bepaald op basis van de dag waarop de vaginale plug wordt waargenomen (E0.5). - Injecteer het zwangere vrouwtje met de pijnstillende oplossing (0,1 mg/kg buprenorfine) onderhuids. Om te voorkomen dat de ogen drogen tijdens de procedure, breng een druppel oogzalf in elk oog met behulp van een wattenstaafje.
- Scheer de muis buikstreek met een elektrisch scheerapparaat en was het 2x met 70% (v/ v) ethanol doekjes, een keer met jodium doekjes, en een laatste keer met een ethanol doekje.
- Gebruik een schaar om een 30 mm lange incisie te maken door de huid in de rechterkant van het dier en zorgvuldig scheiden van de aangrenzende huid van de spier met een stompe spatel. Maak daarna een tweede incisie in de buikwand.
- Bedek de buik met een stuk gevouwen tissuepapier dat eerder is ontsmet met 70% ethanol met een 40 mm lange spleet in het midden. Trek de baarmoeder voorzichtig uit de buikholte met ringkrachten.
LET OP: De baarmoeder moet nat worden gehouden met de warme zoutoplossing die tijdens stap 1.3.2 tijdens de hele procedure wordt bereid. - Laad de getrokken pipetten voor met de DNA-oplossing bereid in stap 1.1.4. Injecteer ~0,5 μL van de DNA-oplossing per embryo in de laterale ventrikel van het geselecteerde halfrond met behulp van de mondgestuurde aspiratorbuis totdat de snelle groene kleurstof merkbaar is in de ventrikel.
- Plaats de platinae elektroden van het type Tang lateraal rond het hoofd van het geïnjecteerde embryo (zoals te zien is in figuur 1A en figuur 2A). Oriënteer de elektroden om het gewenste hersengebied te targeten. Richt de positieve pool naar de mediale wand om de corticale zoom (strategie A) te elektroporen of naar de laterale cortex (strategie B) om cellen die in dat gebied worden gegenereerd te labelen.
OPMERKING: In alle gevallen moeten het hart en de placenta worden vermeden om de embryonale overleving te garanderen. - Pas de specifieke volgorde van elektrische pulsen aan met een vierkante golfeletroporator volgens de indicaties in tabel 1 (strategie A E11.5 embryo's: vier pulsen van 25 V en 40 ms, gescheiden door intervallen van 950 ms; strategie B E13.5 embryo's: vijf pulsen van 35 V en 60 ms, met intervallen van 950 ms).
- Plaats de baarmoeder voorzichtig terug in de buikholte met tangen, vul deze met warme zoutoplossing en sluit de buikwand met een naald 6-0 hechting. Sluit je aan bij de twee zijden van de initiële incisie gemaakt in de huid, hetzij met behulp van een naald 6-0 hechting of hechting clips.
- Houd het dier op het verwarmingskussen en houd het in de gaten tot het herstel van de anesthesie. Zorg voor een extra dosis analgesie (150 μL) in een hydrogeloplossing die in de thuiskooi is geplaatst.
- 24 uur na de operatie, een extra dosis analgesie (150 μL) toedienen. Blijf dagelijks controleren door visuele inspectie voor mogelijke pijn en nood. Observeer het gedrag van het dier, test zijn normale achterpootreflexen en inspecteer de hechting op mogelijke tekenen van schade als gevolg van het likken of krabben van de wond.
3. Tweede in utero elektroporatie
- Twee dagen na de eerste operatie herhaalt u stap 2.1−2.3. Hoewel het herstel van zwangere vrouwen na de operatie zeer goed is, controleer dan of ze normaal gedrag vertonen en geen tekenen van pijn of angst vertonen voordat ze de tweede operatie uitvoeren (E13.5 embryo's voor strategie A en E15.5 voor strategie B).
- Maak een 30 mm lange incisie door de huid zoals in stap 2.4 en een tweede incisie aan de buikwand, dit keer in de linkerkant van het dier. Stel de baarmoeder zorgvuldig bloot bovenop een gedesinfecteerd weefsel zoals beschreven in stap 2.5.
LET OP: Zorg ervoor dat u zich niet bemoeit met de incisie die eerder aan de andere kant is gemaakt. - Injecteer ongeveer 0,5 μL per embryo van de DNA-oplossing in de laterale hersenventaarde van de hemisfeer die eerder geëlektrpoleerd werd in het geval van strategie A en in de laterale hersenventaarde van de contralaterale hemisfeer voor strategie B.
OPMERKING: Gebruik alleen embryo's met een normale ontwikkeling en geen tekenen van reabsorptie. - Plaats de elektroden rond het hoofd van het embryo zoals beschreven in stap 2.7, het sturen van de positieve elektrode naar de laterale cortex en de juiste pulsen toepassen volgens de indicaties in tabel 1 (strategie A E13.5 embryo's: vijf pulsen van 35 V en 60 ms gescheiden door 950 ms intervallen; strategie B E15.5 embryo's: vijf pulsen van 50 V en 80 ms gescheiden door 950 ms intervallen).
- Ga verder en rond de operatie af zoals beschreven in stap 2.8−2.10.
4. Weefseloogst en -sectie
- Strategie A
- Vier dagen na de tweede elektroporatie (E17.5) voert cervicale dislocatie van het zwangere vrouwtje uit en plaatst u deze in een supinepositie.
- Maak met behulp van een schaar een ventrale incisie om de baarmoederhoorns te extraheren en leg ze met tangen in een petrischaal gevuld met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs.
LET OP: De lage temperatuur maakt de verdoving van de embryo's mogelijk. - Met behulp van een pincet, haal de embryo's uit de vruchtzak en breng ze met tangen naar een nieuwe PBS-gevulde Petri schotel onder een ontleden toepassingsgebied. Houd het hoofd van de embryo's voorzichtig vast met tangen en voer hersendissectie met een pincet om eerst de huid boven het hoofd en vervolgens de schedel te verwijderen. Gebruik een spatel te trekken uit de blootgestelde hersenen.
- Verzamel de hersenen met een lepel en deponeer ze in een 48 put plaat gevuld met de fixatieve oplossing (4% [w / v] paraformaldehyde [PFA] in 1x PBS). Test onmiddellijk op de succesvolle uitkomst van beide elektroporaties door de hersenen te onderzoeken met behulp van bijvoorbeeld een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop.
- Fixeer de embryonale hersenen 's nachts bij 4 °C in een orbitale shaker. Was met 1x PBS om sporen van PFA te elimineren. Breng ze vervolgens over naar PBS met schimmeldodende conserveringsmiddelen (1x PBS-0,05% (w/v) natriumadium).
LET OP: PFA en natrium azide zijn cytotoxische verbindingen die speciale voorzorgsmaatregelen vereisen tijdens het gebruik ervan. - Sluit de gefixeerde hersenen in 4% (w / v) laag smeltpunt agarose in 1x PBS en wacht ~ 10 min totdat het stolt. Plak ze aan de vibratome weefsel houder met behulp van cyanoacrylaat lijm met de reuklampen naar boven gericht om coronale secties te verkrijgen.
- Start het vibratome en selecteer de gewenste parameters: 100 μm breedte, 0,60 μm/s snelheid en 0,60 mm amplitude.
- Zet de hersenen in de vibratomecontainer vast, vul deze met 1x PBS-oplossing en begin met het verzamelen van coronale seriële secties met behulp van een borstel in een 48 putplaat gevuld met 1x PBS-0,05% (w/v) natriumachode om een volledige weergave van de hersenen te hebben (bijvoorbeeld ongeveer zeven secties per put en zes putten per embryo).
- Monteer de gewenste secties in microscoopglazen dia's met behulp van een fijne borstel. Bedek ze met glazen hesjes. Voor langdurige opslag toe te voegen montage medium, die fotobleaching en fotooxidatie voorkomt. Observeer de dia's onder een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop om de werkzaamheid van elektroporatie te beoordelen.
- Strategie B
- Laat de pups die eerder geëlektrooeerd waren op E13.5 en E15.5 geboren worden en wacht tot P15 om transcardiale perfusie uit te voeren met dezelfde fixatieve oplossing die in stap 4.1.4 wordt gebruikt.
- Vlak voor perfusie, intraperitoneally toedienen van een dosis van 75/1 mg/kg ketamine/medetomidine. Wanneer de pedaalreflex verloren gaat, bevestigt u de muis in een supinepositie en maakt u een ventrale incisie na de middenlijn met behulp van een schaar om zowel de ribbenkast als het middenrif bloot te leggen.
- Snijd het middenrif en open de ribbenkast om toegang te krijgen tot het hart. Houd de ribbenkast vast met een hemostat en maak een incisie in het rechteratrium met een fijne schaar.
- Penetreer de linker ventrikel met een naald verbonden met een flexibele buis met een peristaltische perfusiepomp. Start transcardiale perfusie, het leveren van ten minste 25 mL van 4% PFA bij een constante flux van 5,5 mL /min (totale tijd ~ 5 min).
- Ontleed de hersenen van geperfuseerde dieren. Verwijder eerst de huid over het hoofd met een schaar en tang. Begin met het snijden van de schedel met behulp van een schaar en zorgvuldig trek delen van de schedel botten totdat ze volledig zijn verwijderd. Ten slotte, extract de hersenen met behulp van een spatel.
- Breng de hersenen naar een 24 put plaat en bevestig ze met 4% PFA 's nachts op 4 °C op een orbitale shaker. Stop fixatie door PFA te vervangen door 0,05% (w/v) natriumaproide in PBS.
LET OP: Zoals aangegeven in stap 4.1.5 is het raadzaam om een tussenwas uit te voeren met 1x PBS. - Herhaal stap 4.1.6−4.1.9, het veranderen van de vibratome parameters voor postnatale hersenen (40 μm breedte, 1,20 μm/s snelheid en 0,5 mm amplitude).
OPMERKING: Immunohistochemie of immunofluorescentie kan worden uitgevoerd om specifieke celmarkers te detecteren of het signaal van fluorescerende eiwitten die bij elektroporatie worden gebruikt, te verbeteren.
5. Confocale fluorescentie beeldvorming en analyse
- Zet de confocale microscoop aan, plaats de microscoopdia's met de gemonteerde hersensecties op de microscoopdia's en selecteer de kanalen waarop fluorescentiebeelden worden genomen (d.w.z. 420−460 nm voor BFP, 490−540 nm voor GFP en 570-620 nm voor mCherry en tdTomato).
- Voer voorbeeldscans uit om kaartafbeeldingen van elke hersensectie op twee verschillende golflengten te verkrijgen voor een algemeen beeld van de dubbele elektroporatieoutput. Als u klaar bent, selecteert u de 10x-lens en de multi-area-Z-stack-timelapse-observatiemodus. Dit zal het mogelijk maken de programmering van de automatische verwerving van fluorescentie beelden op verschillende XYZ lokalisaties binnen hersensecties.
- Stel in elk van de gekozen gebieden (XY) de juiste beeldvormingsparameters in (d.w.z. laserintensiteit, fotomultipliergevoeligheid en een minimale resolutie van 1.024 x 1.024), evenals de diepte van het scannen (Z) volgens de vlakken van het monster waar fluorescentie zichtbaar is.
- Verkrijg afbeeldingen met een lage vergroting (10x) van alle gekozen regio's en exporteer ze van OIF naar TIFF-formaat met behulp van de software voor microscoopviewer.
- Verander in de 60x lens, herhaal stap 5.3 en leg beelden met een hoge vergroting vast om de celcelinteracties op een meer gedetailleerde manier te observeren. Exporteer ze zoals aangegeven in stap 5.4.
- Open de verworven beelden met alle beeldvormingssoftware (bijvoorbeeld Fiji) voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Interacties tussen naburige cellen zijn ontstaan op distale plaatsen en op verschillende tijdstippen: Cajal-Retzius cellen (CR-cellen) en vroege migrerende corticale projectie neuronen (strategie A)
De interactie van CR-cellen en vroege corticale projectieneuronen werd eerder beschreven als noodzakelijk om somale translocatie via nectin en cadherine adhesiemoleculen te reguleren met behulp van een dubbele elektroporatiestrategie8. CR-cellen zijn afkomstig uit het neuroepithelium aan de randen van het pallium en migreren tangentiaal om het meest oppervlakkige deel van de cortex te bevolken, de marginale zone17,18,19, terwijl corticale projectieneuronen worden gegenereerd in de proliferative zone van de hersenschors en radiaal migreren naar de ontluikende corticale plaat20. Er is een tijdelijk verschil in de generatie van beide soorten cellen. CR-cellen worden gegenereerd in zeer vroege embryonale stadia van E10.521,22 en corticale projectieneuronen die migreren door somale translocatie zijn geboren uit E12.5–E13.523. Met behulp van dubbele in utero elektroporatie, de temporele kloof tussen de operaties maakt CR-cellen, gericht op E11.5 in een van de plaatsen van herkomst (de corticale zoom), om de marginale zone van de laterale neocortex met inbegrip van de somsensoratoy gebied in de tijd om contacten te leggen met corticale projectie neuronen gelabeld op E13.5 (Figuur 1A,B). De toonaangevende processen van projectieneuronen die verbeterde GFP (EGFP) uitdrukken, verelenen overvloedig in de marginale zone van de cortex en vermengen zich met de processen van CR-cellen die mCherry uitdrukken(figuur 1C). Functionele experimenten hebben aangetoond dat verstoring van celcelhechtingmoleculen uitgedrukt door projectieneuronen of CR-cellen de verboring van hun processen beïnvloedt als gevolg van gewijzigde contacten tussen beide celtypen8.
Lange-afstandsinteracties tussen distale cellen die op verschillende tijdstippen worden gegenereerd: innervatie van callosale projectieneuronen van de bovenste laag aan de contralaterale kant van de neocortex (strategie B)
Callosal corticale projectie neuronen zijn aanwezig in de hele hersenschors, die meer overvloedig in de bovenste lagen24. Deze neuronen projecteren hun axonen door het corpus callosum en contact met hun doelcellen, projectieneuronen verspreid over de verschillende lagen van de contralaterale cortex 25,26,27. Bovenste laag projectie neuronen zijn evolutionair nieuwer dan lagere laag neuronen en zijn sterk uitgebreid in primaten28. Deze cellen zijn van cruciaal belang voor complexe denken en hogere associatieve taken, en disfuncties in groepen van genen specifiek uitgedrukt door deze populatie van cellen zijn onlangs gerelateerd aan autisme29.
Om specifiek de interacties van de subpopulatie van callosale projectieneuronen in de bovenste lagen te bestuderen met hun doelcellen verspreid over het contralaterale halfrond, ontwikkelden we een dubbele utero elektroporatie protocol. Om de doelcellen van callosale projectieneuronen van de bovenste laag te labelen, hebben we bij utero-elektroporatie op E13.5 uitgevoerd met behulp van een BFP-uitdrukkende plasmide (figuur 2A−C). Deze leeftijd werd strategisch gekozen omdat het niet alleen gericht op een brede corticale projectie neuron populatie met inbegrip van vele laag-V neuronen, maar ook een aanzienlijk aantal neuronen gelegen in de bovenste lagen(Figuur 2C), in principe die alle doelgebieden van callosale projectie neuronen van de contralaterale halfrond. Een tweede elektroporatie in de contralaterale kant op E15.5 gericht op de bovenste laag callosale projectie neuron subpopulatie (uitdrukken nEGFP en mtdTomato) (Figuur 2A,B,D), maar niet de onderste laag projectie neuronen geboren op eerdere leeftijden. De behoefte aan heterochronische dubbele elektroporatie was daarom gerechtvaardigd wegens de verschillende tijden in de generatie van de het projecterende cellen van belang en de cellen innervated door hen. Die bovenste laag gerichte neuronen sturen hun axonen naar de contralaterale hemisfeer met een karakteristiek arborisatiepatroon(figuur 2C). Verschillen in dit typische axonale prieel arborisatiepatroon kunnen worden geëvalueerd bij winst of verlies van functie-experimenten in doelcellen met behulp van dit dubbele elektroporatieprotocol. Hoge vergroting analyse toont in detail de callosale axonen innervating gerichte projectie neuronen in de contralaterale hemisfeer (Figuur 2E).
Figuur 1: Strategie A. Dubbel in utero elektroporatie strategie om nauwe interacties tussen cellen met verschillende ruimtelijke en temporele oorsprong te bestuderen. (A) Schema's van het protocol dat wordt gebruikt om CR-cellen te targeten die mCherry en corticale projectieneuronen uitdrukken die EGFP uitdrukken. (B) Representatief beeld van een coronale sectie van een brein na dubbele elektroporatie in de corticale zoom en de laterale cortex. Cellen gericht in de corticale zoom (rood) migreren tangentiaal, bevolkten de marginale zone van de neocortex. Gelabelde cellen in de ventriculaire zone van de cortex genereren corticale projectieneuronen (groen) die radiaal migreren om de ontluikende corticale plaat binnen te gaan. Schaalbalk = 200 μm. (C) Vergroting van het gebied in paneel B met de laterale cortex en de twee soorten cellen die zijn gelabeld na het dubbele elektroporatieprotocol. Gestippelde lijnen omlijsten de marginale zone en corticale plaat. Schaalbalk = 100 μm. Hoge vergroting aan de rechterkant toont een detail van de marginale zone met de geschepte leidende processen van de projectieneuronen vermengd met CR-cellen lichamen en processen. Schaalbalk = 10 μm. Ctx = cortex; Hem = corticale zoom; MZ = marginale zone; CP = corticale plaat; IZ = tussenzone. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Strategie B. Dubbele elektroporatiestrategie om lange-afstandsinteracties tussen cellen met verschillende ruimtelijke en temporele oorsprong te bestuderen. (A) Regeling die de strategie toont om verschillende populaties corticale projectieneuronen in de laterale neocortex te targeten, met inbegrip van het somatosensorische gebied in verschillende hemisferen door dubbel in utero-elektroporatie. Projectieneuronen in de somatosensorische cortex van de rechterhersenhelft gericht op E13.5 uitgedrukt BFP. Gerichte projectieneuronen in de contralaterale zijde gericht op E15.5 uitgedrukt nucleaire EGFP (nEGFP) en membraan-gerichte tdTomato (mtdTomato). (B) Representatief beeld van een coronale sectie van een brein dat een dubbele elektroporatieoperatie onderging met de genoemde plasmiden in paneel A. Let op de verschillende verdelingen van de cellen gelabeld door BFP of nEGFP en de intense etikettering van de axonen van de bovenste laag callosale projectie neuronen (mtdTomato) gelabeld op E15.5. Schaalbalk = 500 μm. (C) Beeld van de somatosensorische cortex in de rechterhersenhelft in een dubbel geëlektrooeerd brein. Let op de brede verdeling van de projectie neuronen (blauw) over lagen en de overvloedige arborisatie van de callosale axonen (rood) afkomstig van projectie neuronen gericht in de contralaterale halfrond. Schaalbalk = 100 μm. (D) Beeld van de somatosensorische cortex in de linkerhersenhelft van een dubbel geëlektrooeerd brein. Let op de discrete lokalisatie van de beoogde projectieneuronen in het bovenste deel van de corticale plaat, zoals blijkt uit de expressie van nEGFP (groen), evenals de overvloedige rode etikettering van omringende cellichamen en alle neuronale projecties (rood). Schaalbalk = 100 μm. (E) Hoge vergrotingsfoto's van de somatosensorische cortex in de rechterhersenhelft met details van de verborisatie van de callosale axonen rond gerichte projectieneuronen. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Strategie | Volgorde van elektroporatie | Doelcellen | Doelgebied | Ventrikel geïnjecteerd | Locatie van de elektroden | Spanning en pulsen | Plasmiden gebruikt | Leeftijd van analyse |
| A | Eerste | CR-cell bij E11.5 | Corticale Hem | Links | Positief in linkerhersenhelft (gericht op de mediale muur) | 25 V, 40 ms, 4p | CAG-mCherry | E17.5 |
| Tweede | Corticical Projection neuronen bij E13.5 | Somatosensorische Cortex | Links | Positief in linkerhersenhelft | 35 V, 60 ms, 5p | CAG-EGFP | ||
| (gericht op de cortex) | ||||||||
| B | Eerste | Corticical Projection neuronen bij E13.5 | Somatosensorische Cortex | Recht | Positief op rechterhersenhelft | 35 V, 60 ms, 5p | CAG-BFP | P15 |
| (gericht op de cortex) | ||||||||
| Tweede | Corticical Projection neuronen bij E15.5 | Somatosensorische Cortex | Links | Positief in linkerhersenhelft | 50 V, 80 ms, 5p | CAG-nEGFP-2A-mTdTomato | ||
| (gericht op de cortex) |
Tabel 1: Samenvatting van de elektroporatieomstandigheden die in de verschillende experimenten worden gebruikt.
| Overleving van embryo's na dubbele utero-elektroporatie in strategie A | |||||||||
| Aantal nesten | Eerste aantal embryo's | Aantal embryo's dat eerste EP overleeft | Aantal embryo's dat tweede EP overleeft | % van de overleving na eerste EP | % van de overleving na tweede EP* | % van de wereldwijde overlevingskans | |||
| 9 | Totaal aantal | (Avg. strooisel ± SD) | Totaal aantal | (Avg. strooisel ± SD) | Totaal aantal | (Avg. strooisel ± SD) | 75% | 83.33% | 62.50% |
| 64 | 7,11 ± 2,08 | 48 | 5,33 ± 1,22 | 40 | 4,44 ± 1,01 | ||||
| Aantal geaborteerde embryo's na eerste EP | Aantal geaborteerde embryo's na tweede EP | Totaal aantal geaborteerde embryo's | % abortus na eerste EP | % abortus na tweede EP* | % van het wereldwijde abortuscijfer | ||||
| Totaal aantal | (Avg. strooisel ± SD) | Totaal aantal | (Avg. strooisel ± SD) | Totaal aantal | (Avg. strooisel ± SD) | 25% | 16.66% | 37.50% | |
| 16 | 1,8 ± 1,09 | 8 | 0,88 ± 0,78 | 24 | 2,67 ± 1,32 | ||||
| * Overleving en abortus berekend gezien de embryo's die de eerste elektroporatie overleefd | |||||||||
Tabel 2: Overleving van embryo's na dubbele utero-elektroporatie in strategie A.
| Overleving van embryo's en pups volgens Strategie B (dubbel EP E13.5 en E15.5) | |||||||||||
| Aantal nesten | Eerste aantal embryo's | Aantal embryo's dat eerste EP overleeft | Aantal pups geboren na dubbele EP | Aantal embryo's dat op P15 overleeft | % van de overleving na eerste EP | % van de overleving na het tweede EP | % van de overleving op P15 | ||||
| 8 | Totaal aantal | (Avg. strooisel ± SD) | Totaal aantal | (Avg. strooisel ± SD) | Totaal aantal | (Avg. strooisel ± SD) | Totaal aantal | (Avg. strooisel ± SD) | 88.46% | 82.69% | 55.77% |
| 52 | 6,5 ± 2 | 46 | 5,75 ± 2,05 | 43 | 5,38 ± 1,77 | 29 | 3,63 ± 1,6 | ||||
| Overleving van embryo's en pups na single EP op E13.5 | ||||||||
| Aantal nesten | Eerste aantal embryo's | Aantal pups geboren na EP | Aantal embryo's dat op P15 overleeft | % van de overleving na ep | % van de overleving op P15 | |||
| 11 | Totaal aantal | (Avg. strooisel ± SD) | Totaal aantal | (Avg. strooisel ± SD) | Totaal aantal | (Avg. strooisel ± SD) | 89.74% | 57.69% |
| 78 | 7,1 ± 1,64 | 70 | 6,36 ± 1,7 | 45 | 4,09 ± 2,07 | |||
Tabel 3: Overleving van pups na het dubbele in utero elektroporatie in Strategie B in vergelijking met eenvoudige elektroporatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De studie van celcelinteracties in vivo in regio's met een hoge cellulaire dichtheid zoals de hersenschors is een complexe taak. Traditionele benaderingen, waaronder het gebruik van antilichamen om neurites te etiketteren, zijn niet geschikt vanwege het ontbreken van specifieke markers voor verschillende celpopulaties. Het gebruik van transgene murinemodellen, waarbij een bepaald celtype een fluorescerend eiwit uitdrukt, is nuttig om de neuronale processen te visualiseren, maar dit hangt af van de beschikbaarheid van dergelijke modellen. Deze taak is nog ingewikkelder wanneer het proberen om mogelijke verschillen in de interacties tussen twee bepaalde celtypes bij verstoring van de genen van belang te visualiseren, omdat het het gebruik van andere dierlijke modellen, zoals knock-outmuizen impliceert. Al deze kwesties maakten deze studies ingewikkeld in het verleden toe te schrijven aan economische en tijdelijke kosten.
De opkomst van nieuwe technieken die somatische transgenese in vivo mogelijk maken, zoals in utero-elektroporatie, biedt de mogelijkheid om strategieën te ontwerpen zoals beschreven in dit protocol, die het gebruik of de generatie van gecombineerde reporter- en knock-outdieren omzeilen, waardoor dit soort experimenten haalbaarder worden. De resultaten in deze publicatie en eerder gepubliceerde studies8 tonen aan dat dit protocol 1) met succes de targeting van celpopulaties met verschillende temporele en ruimtelijke oorsprong mogelijk maakt; 2) maakt het mogelijk de visualisatie van celcelcontacten met hoge resolutie mogelijk te maken; en 3) is nuttig om verschillen in celcontacten na functionele experimenten op te sporen.
Ondanks het brede gebruik van in utero elektroporatie, vereist deze techniek aanzienlijke training om de operatie veilig uit te voeren, de embryo's te manipuleren zonder ze te beschadigen en de juiste targeting van de gewenste regio te verzekeren. Echter, na deze training, overleving van zwangere vrouwen is uitstekend (ongeveer 100% in onze handen) en we hebben geen verschillen gevonden tussen enkele en dubbele in utero elektroporatie. Enkele en dubbele geëlektrooeerde zwangere vrouwen herstellen zeer snel van de operatie. In de overgrote meerderheid van de gevallen, hun gedrag de dag na enkele of dubbele chirurgie lijken normaal en deze zwangere vrouwtjes eten, drinken, lopen, en zelfs klimmen zonder problemen zonder duidelijke tekenen van pijn en nood.
De overleving van de embryo's na de eerste en de tweede elektroporatie is over het algemeen ook goed en het abortuspercentage neemt af naarmate de leeftijd van de embryo's toeneemt(tabel 2 en tabel 3). Het grootste probleem is succesvol richten in beide elektroporaties. Bij oudere embryo's vanaf E13.5 is de mate van succes zeer hoog. Vroege leeftijden zoals E11.5 zijn uitdagender omdat de kleine omvang van de embryo's de behandeling en injectie bemoeilijkt, wat bovendien hun overleving beïnvloedt. Embryo's die de eerste E11.5-elektroporatie overleven, bieden echter zeer goede overlevingskansen na de tweede elektroporatie op E13.5 (tabel 2). Om de vaardigheid met deze techniek te verbeteren, raden we ten zeerste aan om operaties bij pups op ~ E14.5 te oefenen en geleidelijk operaties op jongere leeftijd te proberen.
Een andere uitdaging is postnatale overleving, omdat moeders die een operatie ondergaan niet altijd voor al hun pups zorgen, hoewel zwangere vrouwtjes alleenstaande of dubbele elektroporated de pups zonder problemen leveren(tabel 3)en hun gedrag en fitnessstatus er normaal uitzien. In onze handen, en met de timing hier beschreven, vinden we geen belangrijke verschillen in postnatale overleving na eenvoudige en dubbele elektroporatie(Tabel 3), maar om mogelijke overlevingsproblemen te omzeilen pups kunnen worden overgedragen aan pleegmoeders bij de bevalling wanneer echte moeders vertonen slechte moederlijk gedrag bij de geboorte. Het verstrekken van extra nestmateriaal en rijk voedsel aan zwangere vrouwtjes voorafgaand aan de bevallingsdatum kan ook helpen om de overlevingskansen van de pups te verhogen.
Een van de belangrijkste voordelen van deze strategie is het gebruik van wild type muizen voor functionele studies, maar het kan ook worden toegepast, bijvoorbeeld, op CRE reporter muizen of floxed muizen voor genen van belang, indien beschikbaar. Bij deze muizen zal elektroporatie van CRE-recombinase die plasmiden uitdrukken de permanente expressie van het reportergen of de inactivatie van het gewenste gen mogelijk maken, respectievelijk in de beoogde cellen. Voor functionele experimenten kunnen we ook de expressie van de constructie alleen in het celtype van belang controleren. Bijvoorbeeld, een neuronale promotor kan worden gebruikt om een kandidaat-gen te manipuleren alleen in neuronen en niet in neurale stamcellen, dus het voorkomen van ongewenste effecten op het voorloper niveau. Al deze overwegingen, samen met de controle van de tijd en het beoogde gebied, maken dubbel in utero-elektroporatie een zeer veelzijdige techniek om celcelinteracties te bestuderen, niet alleen in de cortex, maar ook in andere structuren die kunnen worden gericht met behulp van deze technologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Cristina Andrés Carbonell en leden van de Animal Care-faciliteit van de Universidad de Valencia voor technische bijstand. We willen ook Isabel Fariñas en Sacramento R. Ferrón bedanken voor reagentia en het delen van hun apparatuur met ons. I.M.W wordt gefinancierd door een Garantía Juvenil contract uit de Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D wordt gefinancierd door de Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz heeft een Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) van het Spaanse Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Dit werk werd gefinancierd RYC-2015-19058 en SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
