Summary
子宫电穿孔的双倍允许瞄准空间和时间分离的细胞群。该技术可用于在正常条件下使用荧光蛋白可视化这些细胞群之间的相互作用,而且在功能实验后也可用于干扰感兴趣的基因。
Abstract
在子宫电穿孔是一种体内DNA转移技术,广泛用于研究哺乳动物皮质成基的分子和细胞机制。此过程利用大脑心室,允许引入感兴趣的DNA,并使用一对电极引导遗传物质进入心室内衬的细胞,神经干细胞。这种方法允许研究人员标记所需的细胞和/或操作这些细胞中感兴趣的基因的表达。它有多种应用,包括针对神经元迁移、系系跟踪和斧头路径查找的测定。这种方法的一个重要特点是它的时间和区域控制,允许规避与胚胎杀伤性或缺乏特定的CRE驱动小鼠相关的潜在问题。这项技术的另一个相关方面是,它有助于减少涉及产生新的小鼠线的经济和时间限制,这在研究不同发育年龄时起源于大脑遥远区域的细胞类型之间的相互作用方面变得尤为重要。在这里,我们描述了一个双电镀策略,能够瞄准空间和时间分离的细胞群。通过这种方法,我们可以用选定的荧光蛋白标记不同位置的不同亚型细胞,以可视化它们,和/或者我们可以在适当的时候操纵这些不同细胞表达感兴趣的基因。这一策略增强了子宫电穿孔的潜力,并提供了一个强大的工具,用于研究迁移以建立密切接触的时空和空间分离的细胞群的行为,以及通过xxon投影进行远程相互作用,从而降低时间和经济成本。
Introduction
大脑皮层是一个非常复杂和复杂的组织结构。为了实现这种程度的组织,皮质投影神经元经历复杂的发育过程,需要其时间生成,迁移到皮质板的最终目的地,以及建立短和远程连接11,2。2长期以来,研究皮质成因的经典方法基于对感兴趣的基因的敲除或敲模模型的使用。然而,这种策略,特别是使用有条件的挖空小鼠,既费时又昂贵,有时在存在遗传冗余或缺乏具体的CRE驱动因素等方面提出了其他问题。试图解决这些问题的方法之一,现在被广泛用于研究皮质发育的方法之一是在子宫电穿孔33,4。4在子宫电穿孔是一种用于体细胞转变的技术,允许在体内瞄准神经干细胞及其后代。该方法可用于通过表达荧光蛋白55、66来标记细胞,用于体内基因操作(即功能测定的增益或丧失)7、8、9,8,用于在体外分离7电质皮质和培养细胞98,8、10。此外,在电体电穿孔中,允许对目标区域进行时间和区域控制。该技术具有多种应用,已广泛应用于研究神经元迁移、干细胞分裂、神经元连通性等学科88、9、11、12。9,11,12
目前的手稿描述了在子宫电穿孔中使用一种称为双质电穿孔的电穿孔变体,用于分析不同时间和空间起源的大脑皮层细胞的相互作用。这些研究在使用鼠型时完成极其复杂,因为它们需要组合使用几种转基因系。本文中描述的协议的一些应用包括研究相邻细胞之间的紧密相互作用,以及通过远程投影研究远程细胞之间的相互作用。该方法要求在子宫电穿孔手术中进行两次独立的手术,在时间和空间上分离,以针对感兴趣的不同细胞群。这种方法的优点是有可能利用野生动物操纵一种或两种神经元的基因功能。此外,这些功能实验可以结合细胞质或膜标记荧光蛋白的表达相结合,以可视化靶细胞(包括树突和斧头)的精细形态,并分析与对照组相比细胞相互作用的可能差异(即仅标记荧光蛋白的细胞)。
此处划定的协议侧重于研究新皮质内的细胞相互作用,但这一策略也可用于研究与可用于子宫电穿孔的外皮质区域的相互作用,如亚皮质或丘脑13、14,14或其他结构中的细胞-细胞相互作用,如小脑15。不同区域的瞄准基于电极的方向和注入DNA的心室(横向、第三或第四)。通过此处描述的策略,我们可以标记大量细胞,这对于评估功能实验中连接/内伸的一般变化非常有用。然而,为了研究连接性的变化,人们可以使用子宫电穿孔的修改版本来获得更稀疏的标签和识别单细胞16。总之,双电镀是一种通用方法,它允许瞄准时空分离的细胞群,并在控制条件下或与功能实验相结合,详细研究它们的相互作用,大大降低了时间和经济成本。
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Protocol
此处所述的程序已获得负责实验、瓦伦西亚大学动物福利和农业学院道德委员会的批准, 巴伦西亚纳大学(巴伦西亚纳大学)的德萨罗罗罗农村,《特兰西纳大学》和《欧洲实验室动物科学委员会》的准则,遵守西班牙立法第53/23/2013号《真实声明》以及欧洲议会和理事会第2010/63/欧盟指令中审查的国际实验室动物科学理事会(ICLAS)的指导方针。
注:该协议涉及两个不同的目的:1) 第一项研究,称为"策略A",允许分析Cajal-Retzius细胞(CR细胞)和同一大脑半球内早期出生的皮质投影神经元之间的相互作用;2) 第二项研究"策略B"是为了检查上层角投影神经元与新皮质的对侧的内部。
1. 手术前准备
- DNA制备
- 用感兴趣的质粒进行化学或电合大肠杆菌DH5+细胞,用适当的抗生素在LB加盘上盘,并在37°C下孵育过夜。
注:此处使用的所有质粒都含有用于鸡β-活性蛋白(CAG)的一般促进剂,驱动荧光报告蛋白的表达(CAG-mCherry 和 CAG-EGFP 策略 A 和 CAG-BFP 和 CAG-nEGFP-2A-mtdMmta 为策略 B)。它们都含有对青霉素 (AMP) 的耐药性。 - 从每个质粒转化中选取单个菌落,并在37°C下3⁄4小时,在37°C下,在细菌培养管中的2 mL Luria肉汤 + 安西林 (LB+AMP) 中启动起始液体培养,进行剧烈摇动(200 rpm)。之后,在500 mL Erlenmeyer烧瓶中加入200 mL的LB+AMP和1 mL的起始培养物中设置更大的细菌培养物。在200rpm的轨道振动器中以37°C孵育过夜。
- 按照制造商的说明,使用无内毒素maxi制备试剂盒(材料表),从液体培养物中获得纯和浓缩质粒DNA。在不含内毒素的Tris-EDTA(TE)缓冲液中的DNA在±50±100μL中重新悬浮,以获得至少5μg/μL的浓度。
- 对于每个手术,准备一个溶液,最终体积为10μL,含有1μL的快速绿色染料,质粒DNA溶液感兴趣的每个质粒的最终浓度为1μg/μL,以及无内毒素TE缓冲液。例如,混合1 μL的快速绿色染料,2 μL的5μg/μL质粒DNA溶液和7μL的TE缓冲液。
- 用感兴趣的质粒进行化学或电合大肠杆菌DH5+细胞,用适当的抗生素在LB加盘上盘,并在37°C下孵育过夜。
- 移液器拉
- 将硼硅酸盐玻璃毛细管(外径/内径1/0.58毫米)拉在垂直微移液拉拔器中,直到尖端长度达到 1±1.5 厘米,并在解剖范围下使用大约 30° 角的解剖钳进行修剪。
- 手术室设置
- 将所有设备放在操作台上(即钳子、剪刀、钳子、微移液器、针头和针架)。打开加热垫,用无菌手术吸水垫盖住它。确保吸入麻醉机中的储液罐充满二氧,氧气罐含有足够的氧气,系统功能正常。
注:手术室和耐药材料必须尽可能无菌(即,所有材料必须在手术前进行解剖,表面必须用70%乙醇消毒)。铂电极首先需要用杀菌肥皂仔细消毒,其次在手术前用70%乙醇进行消毒。 - 准备100 mL 0.9%(w/v)无菌盐水溶液,含有青霉素-链霉素1:100,并填充10厘米的培养皿。将板放在加热垫顶部,使溶液预热。
- 用150μL的镇痛溶液(例如,0.1毫克/千克丁丙诺啡)填充1 mL注射器。
- 使用步骤 1.1.4 中制备的最终质粒 DNA 溶液的 5 μL 装载拉取移液器。将毛细管连接到口控吸气管。
- 将所有设备放在操作台上(即钳子、剪刀、钳子、微移液器、针头和针架)。打开加热垫,用无菌手术吸水垫盖住它。确保吸入麻醉机中的储液罐充满二氧,氧气罐含有足够的氧气,系统功能正常。
2. 首次在子宫电穿孔手术
- 将 E11.5(策略 A)或 E13.5(策略 B)C57BL/6 怀孕小鼠放在封闭感应室内,在 0.8 L/min 处使用 2.5% (v/v) 等氟兰,并等待其麻醉。将鼠标转移到加热垫,并将其鼻子放入面罩中,以便不断交付二分流。检查没有踏板反射作为适当麻醉的指示器。
注:Embryonic 年龄根据观察阴道塞的当天确定 (E0.5)。 - 给怀孕的雌性注射镇痛溶液(0.1毫克/千克丁丙诺啡)皮下。为了防止眼睛在手术过程中干燥,使用棉签在每个眼睛上涂抹一滴眼药膏。
- 用电动剃须刀剃须鼠标腹部区域,用 70% (v/v) 乙醇湿巾清洗 2 倍,一次使用碘湿巾,最后一次用乙醇擦拭。
- 使用剪刀在动物右侧的皮肤进行30毫米长的切口,并使用钝铲小心地将相邻的皮肤与肌肉分开。之后,在腹壁上做第二个切口。
- 用一块折叠的纸巾覆盖腹部,以前用70%的乙醇消毒,中间有40毫米长的缝隙。小心地用环钳将子宫从腹腔中取出。
注:在整个过程中,子宫必须使用步骤 1.3.2 中准备的温盐水溶液保持湿润。 - 使用步骤 1.1.4 中准备的 DNA 溶液预装拉移液器。使用口控制的吸气管将每个胚胎的DNA溶液的 ±0.5 μL 注入所选半球的侧心室,直到心室内明显出现快速绿色染料。
- 将钳子型铂电极横向放置在被注射胚胎的头部周围(如图1A和图2A所示)。定向电极以瞄准所需的大脑区域。将正极定向到中壁,以电化皮质下姆(策略A)或向侧皮层(策略B)标记该区域产生的细胞。
注:在所有情况下,必须避免心脏和胎盘,以确保胚胎存活。 - 按照表1所示的指示(策略 A E11.5 胚胎:四个 25 V 和 40 ms 的脉冲,间隔 950 毫秒;策略 B E13.5 胚胎:5 个脉冲为 35 V 和 60 ms,间隔为 950 毫秒),使用方波电波电波电波电脉冲的特定序列。
- 小心地将子宫放回腹腔,用钳子填充其温暖的盐水溶液,用针6-0缝合关闭腹壁。使用针 6-0 缝合或缝合夹加入皮肤中初始切口的两侧。
- 将动物放在加热垫上并对其进行监测,直到从麻醉中恢复。在 放在家庭笼中的水凝胶溶液中提供额外剂量的甘痛药(150 μL)。
- 手术后24小时,多服药加一剂量的肛门(150μL)。通过目视检查继续日常监测,以监测可能的疼痛和苦恼。观察动物的行为,测试其正常的后肢反射,并检查缝合线是否有可能因舔或划伤伤口而损坏的迹象。
3. 子宫电穿孔第二
- 初始手术后两天,重复步骤2.1~2.3。虽然手术后怀孕女性的恢复情况非常好,但在第二次手术之前检查她们是否表现出正常行为,没有出现疼痛或痛苦的迹象(策略A的E13.5胚胎和策略B的E15.5)。
- 在步骤 2.4 和腹壁上进行 30 mm 长的切口,这一次在动物的左侧。小心地在消毒组织的顶部暴露子宫,如步骤 2.5 所述。
注:小心不要干扰先前在对方制造的切口。 - 将DNA溶液每个胚胎约0.5μL注入以前在策略A和反向半球的横向大脑心室中电穿孔的半球侧脑心室中。
注:仅使用显示正常发育且无再吸收迹象的胚胎。 - 按照步骤2.7所述,将电极放在胚胎头部周围,将正极定向到侧皮层,按照表1所示的指示应用适当的脉冲(策略A E13.5胚胎:5个脉冲的35 V和60 ms间隔间隔;策略B E15.5胚胎:50 V和80 ms的5个脉冲间隔间隔分离)。
- 继续并完成步骤 2.8_2.10 中所述的手术。
4. 组织收获和切片
- 战略 A
- 第二次电穿孔(E17.5)四天后,对怀孕的雌性进行宫颈脱位,并将其置于假发位置。
- 使用剪刀,做一个腹腔切口,提取子宫角,并用钳子将它们放置在一个培养皿中,里面装满了1倍磷酸盐缓冲盐水(PBS),放在冰上。
注:低温使胚胎的麻醉成为可能。 - 使用钳子,从羊水囊中提取胚胎,并用钳子将它们转移到一个新的PBS填充的培养皿在解剖范围下。小心地用钳子握住胚胎的头部,用钳子进行脑部解剖,首先去除头部的皮肤,然后取出头骨。用铲子拉出暴露的大脑。
- 用勺子收集大脑,并把它们沉积在48个装有固定溶液的井盘中(1x PBS 中含有4%[w/v]甲醛[PFA])。例如,使用倒置的出人荧光显微镜检查大脑,立即测试两个电镀的最终结果。
- 在轨道振动器中,在4°C下固定胚胎大脑过夜。使用 1x PBS 进行清洗,以消除 PFA 的痕迹。然后用抗真菌防腐剂(1x PBS-0.05%(w/v)氧化钠将其转移到PBS。
注意:PFA和氧化钠是细胞毒性化合物,在使用过程中需要特别预防措施。 - 将固定的大脑嵌入 4% (w/v) 低熔点,在 1x PBS 中,等待 10 分钟,直到它凝固。使用氰丙烯酸酯胶水将其粘在振动组织支架上,嗅觉球朝上获得日冕部分。
- 启动振动器并选择所需的参数:100 μm 宽度、0.60 μm/s 和 0.60 mm 振幅。
- 将大脑固定在振动容器内,用1x PBS溶液填充大脑,并开始在48孔板的刷子的帮助下收集日冕序列部分,该底板装有1x PBS-0.05%(w/v)钠子德,可完整地描述大脑(例如,每口约7个部分,每个胚胎6口)。
- 使用细刷将所需部分安装到显微镜玻璃幻灯片中。用玻璃盖玻片盖住它们。对于长期存储添加安装介质,防止光漂白和光氧化。在直立的外皮显微镜下观察幻灯片,以评估电穿孔效果。
- 战略B
- 让以前在E13.5和E15.5上电镀的小狗出生,直到P15使用步骤4.1.4中使用的相同固定溶液进行转体灌注。
- 就在灌注之前,腹内施用75⁄1毫克/千克氯胺酮/麦地他胺的剂量。当踏板反射丢失时,将鼠标固定在上皮位置,并使用剪刀在中间线下进行腹腔切口,以暴露肋骨保持架和隔膜。
- 切下隔膜,打开肋骨笼,进入心脏。用六合一握住肋骨笼,用细剪刀在右中庭进行切口。
- 用用柔性管连接到蠕动灌注泵的针头穿透左心室。开始转体灌注,以5.5mL/min的恒定通量(总时间±5分钟)提供至少25 mL的4%PFA。
- 解剖渗透动物的大脑。首先,用剪刀和钳子去除头上的皮肤。开始用剪刀切割头骨,并小心地拉出头骨的部分,直到它们被完全移除。最后,在铲子的帮助下提取大脑。
- 将大脑转移到24孔板,并在轨道振动器上用4°C过夜4%的PFA固定它们。通过在 PBS 中用 0.05% (w/v) 钠子德替换 PFA 来阻止固定。
注:如步骤 4.1.5 所示,建议使用 1x PBS 进行中间清洗。 - 重复步骤 4.1.6×4.1.9,更改产后大脑的振动参数(40 μm 宽度、1.20 μm/s 速度和 0.5 mm 振幅)。
注:免疫性化学或免疫荧光可以检测特定的细胞标记或增强电穿孔中使用的荧光蛋白的信号。
5. 共聚焦荧光成像和分析
- 打开共聚焦显微镜,将包含安装的大脑部分的显微镜幻灯片放在显微镜幻灯片支架上,并选择拍摄荧光图像的通道(即,BFP 为 420×460 nm,GFP 为 490±540 nm,mCherry 和 tdTomato 的 570×620 nm)。
- 执行样品扫描,以获得两个不同波长的每个大脑部分的地图图像,以便一般查看双电镀输出。完成后,选择 10 倍镜头和多区域-Z 堆栈延时观察模式。这将允许编程自动采集荧光图像在不同的XYZ本地化在大脑部分。
- 在每个选定的区域 (XY) 中,根据可见荧光的样品平面设置适当的成像参数(即激光强度、光倍增灵敏度和最小分辨率为 1,024 x 1,024),以及扫描深度 (Z)。
- 获取所有选定区域的低放大倍率(10倍)图像,并使用显微镜查看器软件将其从 OIF 导出为 TIFF 格式。
- 更改为 60x 镜头,重复步骤 5.3 并捕获高放大倍率图像,以更详细的方式观察细胞-细胞之间的相互作用。按步骤 5.4 中所示导出它们。
- 使用任何成像软件(例如斐济)打开采集的图像,以便进一步分析。
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Representative Results
相邻细胞之间的相互作用起源于远端位置和不同时间:卡贾尔-Retzius细胞(CR细胞)和早期迁移皮质投影神经元(策略A)
CR细胞和早期皮质投影神经元的相互作用先前被描述为有必要通过nectin和地籍粘附分子使用双电穿孔策略8来调节肌质易位。CR细胞起源于皮质边缘的神经上皮,并切向迁移,以填充皮层最表面的部分,边缘区域17,18,19,而皮质17,18,19投影神经元在大脑皮层的增殖区生成,并径向地迁移到新生的皮质板20。这两种类型的细胞的生成存在时间差异。CR细胞在E10.521、22,22的早期胚胎阶段生成,通过皮肤易位迁移的皮质投影神经元由E12.5-E13.523诞生。在子宫电穿孔中,手术之间的时间间隙允许CR细胞,针对E11.5在其原点之一(皮质下边),到达横向新皮质的边际区域,包括声体感觉区及时建立接触与皮质投影神经元标记为E13.5(图1A,B)。B投影神经元的领先过程,表达增强的GFP(EGFP)大量在皮层的边缘区域,并与CR细胞的过程混合,表达mCherry(图1C)。功能实验表明,由于两种细胞类型8之间的接触改变,投影神经元或CR细胞表达的细胞粘附分子的扰动会影响其过程的树成。
不同时间产生的远端细胞之间的远程相互作用:上层角投影神经元与新皮质的对侧内联(策略B)
腹腔皮质投影神经元存在于大脑皮层,在上层24中更为丰富。这些神经元通过肉体肌群投射他们的斧子,并接触它们的目标细胞,投影神经元位于对岸皮层25、26、2726,27的不同层25。上层投影神经元在进化上比下层神经元更新,在灵长类动物28中得到了极大的扩展。这些细胞对于复杂的思维和更高的关联任务至关重要,而这个细胞群特别表达的基因组功能障碍最近与自闭症29有关。
为了具体研究位于上层的电体投影神经元的亚群与分布在反边半球的目标细胞的相互作用,我们开发了双子宫电穿孔方案。为了标记上层角投影神经元的目标细胞,我们在E13.5进行子宫电穿孔时使用BFP表达质粒(图2A+C)。之所以选择这个年龄,是因为它不仅允许瞄准广泛的皮质投影神经元群,包括许多层V神经元,而且还允许大量位于上层的神经元(图2C),基本上覆盖了来自反侧半球的角投影神经元的所有目标区域。E15.5的对侧第二次电穿孔瞄准了上层的角投影神经元子群(表示nEGFP和mtdTomato)(图2A、B、D),而不是早期B出生的下层D投影神经元。因此,异质双电镀的需要是合理的,因为感兴趣的投影细胞的生成和它们内化的细胞的产生时间不同。这些上层目标神经元用典型的树仁模式将其轴子发送到反边半球(图2C)。使用这种双电镀协议,可以在目标细胞中功能实验的增益或损失时评估这种典型轴管化模式的差异。高放大倍率分析显示,在反边半球中,具有电烷的内侧投影神经元(图2E)。
图1:策略A.在子宫电镀策略中加倍,以研究不同空间和时间起源的细胞之间的紧密相互作用。(A) 用于定位表达 mCherry 的 CR 细胞和表达 EGFP 的皮质投影神经元的协议原理图。(B) 皮质下层和侧皮层双电穿孔后大脑冠状部分的代表性图像。皮质下姆(红色)中靶向的细胞向切向迁移,填充新皮质的边缘区域。皮层心室区域的标记细胞产生皮质投影神经元(绿色),这些神经元径向迁移进入新生的皮质板。比例尺 = 200 μm. (C)在面板 B中装箱的区域的放大倍数,显示横向皮层和双电镀协议后标记的两种细胞。虚线框架边缘区域和皮质板。比例尺 = 100 μm. 右侧的高放大倍率显示了边缘区域的详细信息,该边缘区域包含与CR细胞体和过程混合的投影神经元的树形前导过程。刻度柱 = 10 μm. Ctx = 皮层;下姆 = 皮质下姆;MZ = 边际区域;CP = 皮质板;IZ = 中间区域。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2:策略B.双电镀策略,以研究不同空间和时间起源的细胞之间的远程相互作用。(A) 显示策略,通过在子宫电穿孔中加倍,针对侧皮质投影神经元的不同种群,包括不同半球的躯体感觉区。右半球躯体皮层的投影神经元以E13.5表示BFP。针对E15.5表示核EGFP(nEGFP)和膜目标tdTomato(mtdTomato)的对侧定向投影神经元。(B) 大脑冠状部分的代表性图像,该部分在A面板中用上述质粒进行了双电穿孔手术。请注意 BFP 或 nEGFP 标记的细胞的不同分布,以及标有 E15.5 的上层角投影神经元 (mtdTomato) 的斧子的强烈标记。比例尺 = 500 μm. (C) 位于右半球的双电脑中躯体感觉皮层的图像。请注意投影神经元(蓝色)在层之间的广泛分布,以及来自反侧半球中针对的投影神经元的轴轴子(红色)的大量树栖。比例尺 = 100 μm . (D) 双电脑左半球左半球的躯体感觉皮层图像。请注意皮质板上部靶向投影神经元的离散定位,如 nEGFP(绿色)的表达所示,以及围绕细胞体和所有神经元投影(红色)的大量红色标记所示。比例尺 = 100 μm. (E) 右半球的躯感皮层的高放大倍率图片,显示靶向投影神经元周围角轴轴的树形化细节。比例尺 = 10 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
策略 | 电穿孔顺序 | 目标单元格 | 目标区域 | 注射心室 | 电极的位置 | 电压和脉冲 | 使用的质粒 | 分析年龄 |
A | 第一 | E11.5 的 CR 单元 | 皮质下姆 | 离开 | 左半球为正(定向到中壁) | 25 V, 40 毫秒, 4p | CAG-mCherry | E17.5 |
第二 | E13.5 的皮质投影神经元 | 躯体感觉皮质 | 离开 | 左半球为正 | 35 V, 60 毫秒, 5p | CAG-EGFP | ||
(定向到皮层) | ||||||||
B | 第一 | E13.5 的皮质投影神经元 | 躯体感觉皮质 | 对 | 右半球为正 | 35 V, 60 毫秒, 5p | CAG-BFP | P15 |
(定向到皮层) | ||||||||
第二 | E15.5 的皮质投影神经元 | 躯体感觉皮质 | 离开 | 左半球为正 | 50 V, 80 毫秒, 5p | CAG-nEGFP-2A-mTdd托姆 | ||
(定向到皮层) |
表1:不同实验中使用的电镀条件摘要。
策略A中子宫电穿孔中双倍后胚胎存活率 | |||||||||
垃圾数量 | 胚胎的初始数量 | 首次EP存活的胚胎数量 | 存活第二个EP的胚胎数量 | 首次 EP 后存活率的百分比 | 第二次 EP 后存活率百分比* | 占全球存活率百分比 | |||
9 | 总数 | (平均垃圾 = SD) | 总数 | (平均垃圾 = SD) | 总数 | (平均垃圾 = SD) | 75% | 83.33% | 62.50% |
64 | 7.11 × 2.08 | 48 | 5.33 × 1.22 | 40 | 4.44 × 1.01 | ||||
首次EP后流产的胚胎数量 | 第二次EP后流产胚胎的数量 | 流产胚胎总数 | 第一次EP后流产的百分比 | 第二次EP后流产百分比* | 占全球堕胎率百分比 | ||||
总数 | (平均垃圾 = SD) | 总数 | (平均垃圾 = SD) | 总数 | (平均垃圾 = SD) | 25% | 16.66% | 37.50% | |
16 | 1.8 × 1.09 | 8 | 0.88 × 0.78 | 24 | 2.67 × 1.32 | ||||
*考虑到首次电穿孔后存活的胚胎,计算了生存和流产 |
表2:策略A中子宫电穿孔双倍后胚胎存活率。
遵循策略 B 的胚胎和小狗的生存(双 EP E13.5 和 E15.5) | |||||||||||
垃圾数量 | 胚胎的初始数量 | 首次EP存活的胚胎数量 | 双EP后出生的小狗数量 | 在P15下存活的胚胎数量 | 首次 EP 后存活率的百分比 | 第二次 EP 后存活率的百分比 | P15生存百分比 | ||||
8 | 总数 | (平均垃圾 = SD) | 总数 | (平均垃圾 = SD) | 总数 | (平均垃圾 = SD) | 总数 | (平均垃圾 = SD) | 88.46% | 82.69% | 55.77% |
52 | 6.5 × 2 | 46 | 5.75 × 2.05 | 43 | 5.38 × 1.77 | 29 | 3.63 × 1.6 |
E13.5 单 EP 后胚胎和小狗的生存 | ||||||||
垃圾数量 | 胚胎的初始数量 | EP 后出生的小狗数量 | 在P15下存活的胚胎数量 | EP 后存活率的百分比 | P15生存百分比 | |||
11 | 总数 | (平均垃圾 = SD) | 总数 | (平均垃圾 = SD) | 总数 | (平均垃圾 = SD) | 89.74% | 57.69% |
78 | 7.1 × 1.64 | 70 | 6.36 × 1.7 | 45 | 4.09 × 2.07 |
表3:与简单的电穿孔相比,策略B中双倍电穿孔后,小狗的存活率。
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Discussion
研究大脑皮层等细胞密度高的区域体内细胞相互作用是一项复杂的任务。传统方法,包括使用抗体来标记神经衰弱是不适合的,因为缺乏针对不同细胞群的特定标记。使用转基因鼠模型(特定细胞类型表示荧光蛋白)有助于可视化神经元过程,但这取决于此类模型的可用性。当试图想象两种特定细胞类型之间在感兴趣的基因扰动时相互作用的可能差异时,这项任务就更加复杂了,因为它涉及使用其他动物模型,如挖空小鼠。所有这些问题使这些研究在过去由于经济和时间成本而变得复杂。
新技术的出现,允许体细胞在体内发生,如在子宫电穿孔,提供了设计策略的可能性,如该协议中描述的,绕过使用或生成组合报告器和挖空动物,使这种类型的实验更加可行。本出版物和先前发表的研究8所示结果表明,该协议1成功地允许以不同时空起源的细胞群为目标;2) 使高分辨率细胞接触的可视化成为可能;和3)在功能实验后检测细胞接触的差异是有用的。
尽管在子宫电穿孔中广泛使用,但这项技术需要大量的训练,以便安全地执行手术,在不破坏胚胎的情况下操作胚胎,并确保对所需区域的正确定位。然而,经过这次训练,怀孕女性的生存是优秀的(大约100%在我们的手中),我们发现在子宫电穿孔的单身和双的区别。单身和双电化怀孕女性从手术中恢复得非常快。在绝大多数情况下,她们在单手术后的第二天的行为似乎很正常,这些怀孕的女性吃、喝、走路,甚至爬不下,没有明显的疼痛和痛苦迹象。
第一次和第二次电穿孔后胚胎存活率总体良好,流产率随着胚胎年龄的增加而降低(表2和表3)。主要困难是成功定位两个电镀。随着从E13.5开始的老年胚胎,成功程度非常高。像E11.5这样的早期年龄更具挑战性,因为胚胎体积小,使得处理和注射更加困难,这还会影响它们的生存。然而,在E13.5进行第二次电穿孔后存活的胚胎存活率非常高(表2)。为了提高这种技术的熟练程度,我们强烈建议在+E14.5的幼崽中练习手术,并在年轻时逐步尝试手术。
另一个挑战是产后生存,因为接受手术的母亲并不总是照顾所有的小狗,虽然怀孕的雌性雌性单子或双电化分娩的小狗没有问题(表3),他们的行为和健身状态看起来正常。在我们的手中,以及这里描述的时间,我们发现在简单和双重电穿孔后产后存活率没有显著差异(表3),但为了规避可能存在的生存问题,幼崽可以在分娩时转移到寄养母亲身上,当真正的母亲在出生时表现出较差的母性行为时。在分娩日期之前,为怀孕的雌性提供额外的筑巢材料和丰富的食物,也有助于提高小狗的存活率。
这一策略的主要优点之一是使用野生型小鼠进行功能研究,但它也可以应用于CRE报告小鼠或浮躁小鼠,以寻找感兴趣的基因。在这些小鼠中,表达质粒的CRE-重组酶的电穿孔将允许报告基因的永久表达或所需基因分别在靶向细胞中失活。对于功能实验,我们还可以控制构造的表达式,只能在感兴趣的单元格类型中。例如,神经元启动器可用于仅在神经元中而不是神经干细胞中操纵候选基因,从而防止在祖细胞水平上产生意外效应。所有这些考虑,加上对时间和目标区域的控制,使双电镀技术成为一种非常通用的技术,不仅研究皮层内部,而且在其他结构中,使用该技术进行靶向。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢克里斯蒂娜·安德烈斯·卡内尔和瓦伦西亚大学动物护理设施的成员提供技术援助。我们还要感谢伊莎贝尔·法里亚斯和萨克拉门托·费伦的试剂,并与我们分享他们的设备。I.M.W由瓦伦西亚大学(GJIDI/2018/A/221)的加兰迪亚·尤韦尼尔合同供资,D.dA.D由伊斯兰大学(国际大学)部长资助。"FPI-PRE2018-086150"。C.Gil-Sanz 持有西班牙法语省法语省(MICINN) 的拉蒙和卡哈尔赠款(RYC-2015-19058)。这项工作资助了RYC-2015-19058和SAF2017-82880-R(MICINN)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
Electric Razor | Oster | 76998 | |
Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
Iodine wipes | Lorsoul | ||
Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).