Summary
Dobbelt i livmoderen elektroporation tillader målretning cellepopulationer, der er rumligt og tidsmæssigt adskilt. Denne teknik er nyttig til at visualisere interaktioner mellem disse cellepopulationer ved hjælp af fluorescerende proteiner under normale forhold, men også efter funktionelle eksperimenter for at forstyrre gener af interesse.
Abstract
In utero elektroporation er en in vivo DNA overførsel teknik flittigt anvendes til at studere de molekylære og cellulære mekanismer underliggende pattedyr corticogenesis. Denne procedure udnytter hjernen hjertekamrene til at tillade indførelsen af DNA af interesse og bruger et par elektroder til direkte indgangen af det genetiske materiale i cellerne foring ventrikel, de neurale stamceller. Denne metode gør det muligt for forskere at mærke de ønskede celler og/ eller manipulere udtryk for gener af interesse i disse celler. Det har flere applikationer, herunder analyser rettet mod neuronal migration, afstamning sporing, og axonal pathfinding. Et vigtigt træk ved denne metode er dens tidsmæssige og regionale kontrol, der muliggør omgåelse af potentielle problemer i forbindelse med fosterdægalitet eller manglen på specifikke CRE-førermus. Et andet relevant aspekt af denne teknik er, at det bidrager til at reducere de økonomiske og tidsmæssige begrænsninger, der involverer generering af nye muselinjer, som bliver særligt vigtige i studiet af interaktioner mellem celletyper, der stammer fra fjerne områder af hjernen i forskellige udviklingsaltidsaldre. Her beskriver vi en dobbelt elektroporationstrategi, der gør det muligt at målrette mod cellepopulationer, der er rumligt og tidsmæssigt adskilte. Med denne tilgang kan vi mærke forskellige undertyper af celler på forskellige steder med udvalgte fluorescerende proteiner for at visualisere dem, og / eller vi kan manipulere gener af interesse udtrykt af disse forskellige celler på de rette tidspunkter. Denne strategi øger potentialet i in utero elektroporation og giver et kraftfuldt værktøj til at studere adfærd tidsmæssigt og rumligt adskilte cellepopulationer, der migrerer for at etablere tætte kontakter, samt langtrækkende interaktioner gennem axonale fremskrivninger, reducere tidsmæssige og økonomiske omkostninger.
Introduction
Hjernebarken er en meget kompleks og indviklet organiseret struktur. For at opnå en sådan grad af organisation, kortikale projektion neuroner gå gennem komplekse udviklingsprocesser, der kræver deres tidsmæssige generation, migration til deres endelige destination i kortikale plade, og etablering af kort-og langtrækkende forbindelser1,2. I lang tid var den klassiske måde at studere korticogenese baseret på brugen af knockout eller knock-in murine modeller af gener af interesse. Men denne strategi, og især brugen af betingede knockout mus, er tidskrævende og dyrt, og nogle gange giver yderligere problemer med hensyn til eksistensen af genetisk redundans eller manglen på specifikke CRE drivere, blandt andre spørgsmål. En af de metoder , der opstod for at forsøge at løse disse problemer , og som i dag i vid stor grad anvendes til at studere kortikal udvikling er in utero elektroporation3,4. I utero elektroporation er en teknik, der anvendes til somatiske transgenese, så in vivo målretning af neurale stamceller og deres afkom. Denne metode kan anvendes til at mærke celler ved at udtrykke fluorescerende proteiner5,6, til genmanipulation in vivo (dvs. gevinst eller tab af funktionsanalyser)7,8,9, til isolerende elektroporerede cortices in vitro og dyrkning af celler8,10. Desuden tillader elektroporation i livmoderen tidsmæssig og regional kontrol af målområdet. Denne teknik har mange applikationer og har været meget anvendt til at studere neuronal migration, stamcelledeling, neuronal konnektivitet, og andre emner8,,9,,11,,12.
Det nuværende manuskript beskriver brugen af en in utero elektroporation variant, kaldet dobbelt i livmoderen elektroporation, at analysere samspillet mellem celler i hjernebarken med forskellige tidsmæssige og rumlige oprindelse. Disse undersøgelser er yderst komplekse at gennemføre, når der anvendes murine modeller, fordi de kræver kombineret brug af flere transgene linjer. Nogle af anvendelserne af protokollen, der er beskrevet i dette papir omfatter undersøgelse af tætte interaktioner mellem tilstødende celler, samt interaktioner mellem fjerne celler gennem langtrækkende fremskrivninger. Metoden kræver udførelse af to uafhængige in utero elektroporation operationer, adskilt tidsmæssigt og rumligt, på de samme embryoner til at målrette forskellige cellepopulationer af interesse. Fordelen ved denne tilgang er muligheden for at manipulere genfunktion i den ene eller begge typer af neuroner ved hjælp af vilde type dyr. Desuden kan disse funktionelle eksperimenter kombineres med ekspression af cytoplasmatiske eller membranmærkede fluorescerende proteiner for at visualisere den fine morfologi af målrettede celler, herunder dendritter og axoner, og analysere mulige forskelle i cellulære interaktioner i forhold til en kontrol (dvs. celler kun mærket med fluorescerende protein).
Protokollen afgrænset her er fokuseret på studiet af cellulære interaktioner inde i neocortex, men denne strategi kan også bruges til at undersøge interaktioner med ekstrakortikale områder, der kan målrettes ved hjælp af utero elektroporation, ligesom subpallium eller thalamus13,14, eller celle-celle interaktioner i andre strukturer, ligesom cerebellum15. Målretning af forskellige områder er baseret på retningen af elektroderne og på ventrikel, hvor DNA injiceres (lateral, tredje eller fjerde). Med den strategi, der er beskrevet her, kan vi mærke et betydeligt antal celler, hvilket er nyttigt til at evaluere generelle ændringer i konnektivitet / innervation i funktionelle eksperimenter. Ikke desto mindre, at studere fine ændringer i tilslutningsmuligheder, kan man bruge modificerede versioner af in utero elektroporation at få sparser mærkning og identificere enkelte celler16. Sammenfattende er dobbelt i livmoderen elektroporation en alsidig metode, der gør det muligt at målrette tidsmæssigt og rumligt adskilte cellepopulationer og studere deres interaktioner i detaljer, enten i kontrolforhold eller kombineret med funktionelle eksperimenter, hvilket reducerer tidsmæssige og økonomiske omkostninger betydeligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den beskrevne procedure er blevet godkendt af det etiske udvalg med ansvar for forsøg, dyrevelfærden i Universidad de Valencia og Conselleria de Agricultura. Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Transición Ecológica fra Comunidad Valenciana og overholder retningslinjerne fra Det Internationale Råd for Laboratoriedyrsvidenskab (ICLAS) i Real Decreto 53/2013 i den spanske lovgivning samt i Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU.
BEMÆRK: Denne protokol omfatter to forskellige formål: 1) den første undersøgelse, benævnt "strategi A", giver mulighed for analyse af samspillet mellem Cajal-Retzius celler (CR-celler) og tidlig-fødte kortikale projektion neuroner inden for samme hjernehalvdel; 2) den anden undersøgelse, "strategi B", udføres for at undersøge innervation af det øverste lag callosal projektion neuroner til den kontralaterale side af neocortex.
1. Forberedelse af presurgery
- DNA-forberedelse
- Omdan kemisk eller elektrokompetente E. coli DH5α-celler med de relevante plasmider, plade dem på LB-agarplader med det relevante antibiotikum og inkuber dem natten over ved 37 °C.
BEMÆRK: Alle plasmider, der anvendes her, indeholder den generelle promotor for kylling β-actin (CAG), der driver udtrykket af et fluorescerende reporterprotein (CAG-mCherry og CAG-EGFP for strategi A og CAG-BFP og CAG-nEGFP-2A-mtdTomato til strategi B). Alle af dem indeholder resistens over for ampicillin (AMP). - Vælg individuelle kolonier fra hver plasmidtransformation, og start en forretsvæskekultur i 2 ml Luria-bouillon + ampicillin (LB+AMP) i bakteriekulturrør i løbet af 3-4 timer ved 37 °C med kraftig omrystning (200 rpm). Efter, indstille en større bakteriekultur i en 500 ml Erlenmeyer kolbe tilføje 200 ml LB + AMP og 1 ml af starterkulturen. Inkuber natten over ved 37 °C i orbital shaker ved 200 rpm.
- Brug et endotoksinfrit maxi-prep-sæt (Tabel over Materialer) efter fabrikantens anvisninger for at opnå rent og koncentreret plasmid-DNA fra de flydende kulturer. Opslæmm DNA'et i ~50−100 μL endotoksinfri Tris-EDTA(TE) buffer for at opnå koncentrationer på mindst 5 μg/μL.
- For hver operation fremstilles en opløsning med et endeligt volumen på 10 μL indeholdende 1 μL hurtigt grønt farvestof, plasmid-DNA-opløsning af interesse for en endelig koncentration på 1 μg/μL for hver plasmid og endotoksinfri TE-buffer. Der blandes f.eks.
- Omdan kemisk eller elektrokompetente E. coli DH5α-celler med de relevante plasmider, plade dem på LB-agarplader med det relevante antibiotikum og inkuber dem natten over ved 37 °C.
- Pipette trækker
- Træk borosilikatglaskapillærer (1/0,58 mm ydre/indre diameter) i en lodret mikropipettetræker, indtil spidsen når en længde på 1,5 cm, og trim den ved hjælp af dissekerende pincet i en vinkel på ca. 30° under et dissekerende anvendelsesområde.
- Opsætning af operationsrum
- Læg alt udstyr på operationsbordet (dvs. pincet, saks, pincet, mikropipetter, nåle- og nåleholder). Tænd for varmepuden og dæk den til med en steril kirurgisk absorberende pude. Sørg for, at beholderen i maskinen til indåndingsanæstesi er fyldt med isofluran, at ilttanken indeholder nok ilt, og at systemet fungerer korrekt.
BEMÆRK: Operationsrummet og det resistente materiale skal holdes så sterilt som muligt (dvs. skal alt materialet autoklateres, før operationen og overfladerne skal desinficeres med 70% ethanol). Platinelektroder skal desinficeres omhyggeligt først med bakteriidal sæbe og andet med 70% ethanol før operationen. - Der fremstilles 100 ml 0,9 % (w/v) steril saltvandsopløsning indeholdende penicillin-streptomycin 1:100, og der fyldes en 10 cm petriskål. Anbring pladen oven på den opvarmede pude for at varme opløsningen op.
- Fyld en 1 ml sprøjte med 150 μL af en smertestillende opløsning (f.eks. 0,1 mg/kg buprenorphin).
- Den trak pipette indbelast med 5 μL af den endelige plasmid-DNA-opløsning, der er fremstillet i trin 1.1.4. Tilslut kapillæren til et mundstyret aspiratorrør.
- Læg alt udstyr på operationsbordet (dvs. pincet, saks, pincet, mikropipetter, nåle- og nåleholder). Tænd for varmepuden og dæk den til med en steril kirurgisk absorberende pude. Sørg for, at beholderen i maskinen til indåndingsanæstesi er fyldt med isofluran, at ilttanken indeholder nok ilt, og at systemet fungerer korrekt.
2. Første i livmoderen elektroporation kirurgi
- Placer en E11.5 (strategi A) eller E13.5 (strategi B) C57BL/6 gravid mus inde i et lukket induktionskammer med 2,5% (v/v) isoflurane ved 0,8 L/min. og vent, indtil den bliver hugget. Overfør musen til varmepuden og læg næsen i en maske for konstant levering af isofluran. Kontroller, om der ikke er en pedalrefleks som indikator for korrekt anæstesi.
BEMÆRK:E-mbryonisk alder bestemmes ud fra den dag, hvor vaginalproppen observeres (E0.5). - Indsprøjt den gravide kvinde med den smertestillende opløsning (0,1 mg/kg buprenorphin) subkutan. For at forhindre øjnene i at tørre under proceduren, anvende en dråbe af øjet salve i hvert øje ved hjælp af en vatpind.
- Barber musen abdominal område med en elektrisk barbermaskine og vask det 2x med 70% (v / v) ethanol klude, en gang med jod klude, og en sidste gang med en ethanol tørre.
- Brug en saks til at lave et 30 mm langt snit gennem huden i højre side af dyret og forsigtigt adskille den tilstødende hud fra musklen med en stump spatel. Bagefter gør et andet snit i bugvæggen.
- Dæk maven med et stykke foldet silkepapir, der tidligere var desinficeret med 70 % ethanol, der indeholder en 40 mm lang slids i midten. Træk forsigtigt livmoderen ud af bughulen med ring pincet.
BEMÆRK: Livmoderen skal holdes våd med den varme saltvandsopløsning, der er fremstillet i trin 1.3.2 under hele proceduren. - Forindlæs de trak pipetter med DNA-opløsningen, der er fremstillet i trin 1.1.4. Sprøjt ~0,5 μL af DNA-opløsningen pr. embryo ind i den valgte halvkugles laterale ventrikel ved hjælp af det mundstyrede aspiratorrør, indtil det hurtige grønne farvestof er mærkbart inde i hjertekammeret.
- Anbring pincetflektroder sideværts omkring hovedet af det injicerede embryo (som vist i figur 1A og figur 2A). Orienter elektroderne til at målrette den ønskede hjerneregion. Ret den positive pol mod den mediale væg for at elektroporate den kortikale kant (strategi A) eller mod den laterale cortex (strategi B) for at mærke celler, der genereres i dette område.
BEMÆRK: I alle tilfælde skal hjertet og moderkagen undgås for at sikre embryonal overlevelse. - Den specifikke sekvens af elektriske impulser med en kvadratisk bølgeelektroporator efter angivelserne i tabel 1 (strategi A E11.5-embryoner: fire impulser på 25 V og 40 ms, adskilt af 950 ms intervaller; strategi B E13.5 embryoner: fem impulser på 35 V og 60 ms med 950 ms intervaller).
- Forsigtigt placere livmoderen tilbage i bughulen med pincet, fylde den med varm saltvandsopløsning, og luk bugvæggen med en nål 6-0 sutur. Deltag i de to sider af det første snit lavet i huden enten ved hjælp af en nål 6-0 sutur eller sutur klip.
- Hold dyret på varmepuden og overvåge det, indtil dets nyttiggørelse fra anæstesi. Giv en ekstra dosis analgesi (150 μL) i en hydrogelopløsning, der er anbragt i sit hjembur.
- 24 timer efter operationen skal du administrere en ekstra dosis analgesi (150 μL). Fortsæt den daglige overvågning ved besigtigelse for mulig smerte og angst. Overhold dyrets adfærd, test dets normale bagbensreflekser, og undersøg suturen for mulige tegn på skader på grund af slikke eller ridser af såret.
3. Anden in utero elektroporation
- To dage efter den første operation gentages trin 2.1−2.3. Selv om inddrivelse af gravide kvinder efter operationen er meget god, kontrollere, at de viser normal adfærd og præsenterer ingen tegn på smerte eller angst, før du udfører den anden operation (E13.5 embryoner til strategi A og E15.5 for strategi B).
- Lav et 30 mm langt snit gennem huden som i trin 2.4 og et andet snit ved bugvæggen, denne gang i venstre side af dyret. Udsæt forsigtigt livmoderen oven på et desinficeret væv som beskrevet i trin 2.5.
BEMÆRK: Pas på ikke at forstyrre det snit, der tidligere er foretaget på den anden side. - Indsprøjtning ca. 0,5 μL pr. embryo af DNA-opløsningen i den laterale hjernevenbrud på den halvkugle, der tidligere blev elektroporeret i forbindelse med strategi A og i den laterale hjernevenbrud på den kontralaterale halvkugle for strategi B.
BEMÆRK: Brug kun embryoner, der udviser normal udvikling og ingen tegn på reabsorption. - Elektroderne placeres rundt om fostrets hoved som beskrevet i trin 2.7. lede den positive elektrode mod den laterale cortex og anvende de relevante impulser efter angivelserne i tabel 1 (strategi A E13.5 embryoner: fem impulser på 35 V og 60 ms adskilt af 950 ms intervaller; strategi B E15.5 embryoner: fem impulser på 50 V og 80 ms adskilt af 950 ms intervaller).
- Fortsæt og afslut operationen som beskrevet i trin 2.8−2.10.
4. Vævshøst og -sektion
- Strategi A
- Fire dage efter den anden elektroporation (E17.5), udføre cervikal dislokation af den gravide kvinde og placere den i en liggende stilling.
- Brug saks, lave en ventral snit til at udtrække livmoderhorn og med pincet placere dem i en petriskål fyldt med 1x fosfat-buffered saltvand (PBS) placeret på is.
BEMÆRK: Den lave temperatur gør bedøvelse af embryonerne mulig. - Brug en pincet, ekstrakt embryonerne ud af fostervandssækken og overføre dem med pincet til en ny PBS-fyldt petriskål under en dissekerende rækkevidde. Hold forsigtigt hovedet af embryoner ved hjælp af pincet og adfærd hjerne dissektion med pincet til først at fjerne huden over hovedet og derefter kraniet. Brug en spatel til at trække de udsatte hjerner ud.
- Opsaml hjernen med en ske og deponere dem i en 48 brønd plade fyldt med fiksativ opløsning (4% [w / v] paraformaldehyd [PFA] i 1x PBS). Test straks for et vellykket resultat af begge elektroporationer ved at undersøge hjernerne ved hjælp af et omvendt epifluorescensmikroskop, for eksempel.
- Fastgør embryonale hjerner natten over ved 4 °C i en orbital shaker. Vask med 1x PBS for at eliminere spor af PFA. Derefter overføres dem til PBS med svampedræbende konserveringsmidler (1x PBS-0,05% (w / v) natriumazid).
FORSIGTIG: PFA og natriumazid er cytotoksiske forbindelser, der kræver særlig forsigtighed under deres udnyttelse. - Integrer de fikserede hjerner i 4% (w / v) lavt smeltepunkt agarose i 1x PBS og vent ~ 10 min, indtil det størkner. Sæt dem fast på vibratomvævsholderen ved hjælp af cyanoacrylatlim med olfaktoriske pærer opad for at opnå koronale sektioner.
- Vibratomen påbegyndes, og de ønskede parametre vælges: 100 μm bredde, 0,60 μm/s hastighed og 0,60 mm amplitude.
- Fastgør hjernen inde i vibratome beholderen, fylde den med 1x PBS opløsning, og begynde at indsamle koronale serielle sektioner ved hjælp af en pensel i en 48 godt plade fyldt med 1x PBS-0,05% (w / v) natriumazid at have en komplet skildring af hjernen (f.eks omkring syv sektioner pr godt og seks brønde pr embryo).
- Monter de ønskede sektioner i mikroskopglasdias med en fin børste. Dæk dem med glasovertræk. Til langtidsopbevaring tilføje montering medium, som forhindrer fotobleaching og fotooxidation. Overhold objektglassene under et opretstående epifluorescensmikroskop for at vurdere elektroporationseffekten.
- Strategi B
- Lad ungerne, der tidligere var elektroporerede på E13.5 og E15.5, blive født, og vent til P15 skal udføre transcardialperfusion ved hjælp af den samme fiksative opløsning, der anvendes i trin 4.1.4.
- Lige før perfusion, intraperitoneally administrere en dosis på 75/1 mg/kg ketamin/medeididin. Når pedalrefleksen går tabt, fastgør musen i liggende stilling og lav et ventralt snit efter midterlinjen ved hjælp af en saks for at eksponere både brystkassen og mellemgulvet.
- Skær mellemgulvet og åbne brystkassen for at få adgang til hjertet. Hold brystkassen ved hjælp af en hemostat og gøre et snit i højre atrium med fine saks.
- Trænge ind i venstre ventrikel med en nål forbundet med et fleksibelt rør til en peristaltisk perfusionspumpe. Start transcardial perfusion, der giver mindst 25 ml 4% PFA ved en konstant flux på 5,5 ml/min (samlet tid ~5 min).
- Dissekere hjernen af perfunderede dyr. Først skal du fjerne huden over hovedet med en saks og pincet. Begynde at skære kraniet ved hjælp af en saks og forsigtigt trække dele af kraniet knogler, indtil de er helt fjernet. Endelig udtrække hjernen ved hjælp af en spatel.
- Overfør hjernen til en 24 brønd plade og fastgør dem med 4% PFA natten over ved 4 °C på en orbital shaker. Stop fiksering ved at erstatte PFA med 0,05% (w/v) natriumazid i PBS.
BEMÆRK: Som angivet i trin 4.1.5 tilrådes det at foretage en mellemvask med 1x PBS. - Trin 4.1.6−4.1.9 gentages, og vibratomparametrene for postnatale hjerner (40 μm bredde, 1,20 μm/s hastighed og 0,5 mm amplitude).
BEMÆRK: Immunhistokemi eller immunfluorescens kan udføres for at detektere specifikke cellemarkører eller forbedre signalet af fluorescerende proteiner, der anvendes i elektroporation.
5. Konfokal fluorescensbilleddannelse og -analyse
- Tænd for det konfokale mikroskop, anbring mikroskopets objektglas, der indeholder de monterede hjernesektioner, på indehaveren af mikroskopdiaset, og vælg de kanaler, hvor der skal tages fluorescensbilleder (dvs. 420−460 nm til BFP, 490−540 nm til GFP og 570-620 nm for mCherry og tdTomato).
- Udfør prøvescanning for at få kortbilleder af hver hjernesektion ved to forskellige bølgelængder for at få et generelt overblik over dobbeltelektroporationsoutputtet. Når du er færdig, skal du vælge 10x linsen og multi-area-Z-stack-timelapse observation mode. Dette vil gøre det muligt at programmere automatisk erhvervelse af fluorescens billeder på forskellige XYZ lokaliseringer inden for hjernen sektioner.
- I hver af de valgte regioner (XY) skal der indstilles korrekte billeddannelsesparametre (dvs. laserintensitet, fotomultiple følsomhed og en minimumsopløsning på 1,024 x 1,024) samt scanningens (Z) dybde i henhold til prøvens planer, hvor fluorescens er synlig.
- Hent billeder med lav forstørrelse (10x) af alle de valgte områder, og eksporter dem fra OIF-format til TIFF-format ved hjælp af mikroskopfremvisersoftwaren.
- Skift til 60x linsen, gentag trin 5.3 og tag billeder med høj forstørrelse for at observere cellecelleinteraktionerne på en mere detaljeret måde. De eksporteres som angivet i trin 5.4.
- Åbn de erhvervede billeder med enhver billedbehandlingssoftware (f.eks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Interaktioner mellem tilstødende celler opstod på distale steder og på forskellige tidspunkter: Cajal-Retzius celler (CR-celler) og tidlig migrerende kortikale projektion neuroner (strategi A)
Samspillet mellem CR-celler og tidlige kortikale projektionneurer blev tidligere beskrevet som nødvendigt for at regulere somal translokation via nectin- og cadherinadhæsionsmolekyler ved hjælp af en dobbelt elektroporationstrategi8. CR-celler stammer fra neuroepithelium i kanterne af pallium og migrere tangentielt at befolke den mest overfladiske del af cortex, den marginale zone17,18,19,mens kortikale projektion neuroner genereres i den proliferative zone af hjernebarken og migrere radialt ind i den spirende kortikale plade20. Der er en tidsmæssig forskel i genereringen af begge typer celler. CR-celler dannes i meget tidlige embryonale stadier fra E10.521,22 og kortikale projektionsneurer, der migrerer ved somal translokation , er født fra E12.5-E13.523. Ved hjælp af dobbelt i uteroelektroporation gør det muligt for det tidsmæssige mellemrum mellem operationerne CR-celler, der er rettet mod E11.5 på et af de steder, hvor der er tale om oprindelse (den kortikale kant), at nå den marginale zone i den laterale neocortex, herunder det somatosensoriske område i tide til at etablere kontakter med kortikale projektionsneurer, der er mærket på E13,5 (Figur 1A,B). De førende processer i projektionen neuroner udtrykker forbedret GFP (EGFP) voldsomt arborize i den marginale zone af cortex og blander sig med processerne i CR-celler, der udtrykker mCherry (Figur 1C). Funktionelle forsøg har vist, at ængstelse af cellecelleadhæsionsmolekyler udtrykt ved projektionsneuroner eller CR-celler påvirker arboriseringen af deres processer som følge af ændrede kontakter mellem begge celletyper8.
Langtrækkende interaktioner mellem distale celler genereret på forskellige tidspunkter: innervation af øverste lag callosal projektion neuroner til den kontralaterale side af neocortex (strategi B)
Callosal kortikal projektion neuroner er til stede i hele hjernebarken, er mere rigelige i øvre lag24. Disse neuroner projicere deres axoner gennem corpus callosum og kontakte deres målceller, projektion neuroner placeret på tværs af de forskellige lag af den kontralaterale cortex 25,,26,27. Øvre lag projektion neuroner er evolutionært nyere end lavere lag neuroner og er blevet stærkt udvidet i primater28. Disse celler er afgørende for komplekse tanke og højere associative opgaver, og dysfunktioner i grupper af gener specifikt udtrykt af denne population af celler er for nylig blevet relateret med autisme29.
For at studere specifikt samspillet mellem subpopulationen af callosal projektion neuroner placeret i de øverste lag med deres målceller fordelt over hele den kontralaterale halvkugle, udviklede vi en dobbelt i livmoderen elektroporation protokol. For at mærke målcellerne i det øverste lag callosal projektion neuroner vi udført i utero elektroporation på E13.5 ved hjælp af en BFP udtrykke plasmid (Figur 2A−C). Denne alder blev strategisk valgt, fordi det giver ikke kun målretning af en bred kortikal projektion neuron befolkning, herunder mange lag-V neuroner, men også et betydeligt antal neuroner placeret i øverste lag (Figur 2C), dybest set dækker alle målområder af callosal projektion neuroner fra kontralaterale halvkugle. En anden elektroporation i den kontralaterale side på E15.5 målrettet det øverste lag callosal projektion neuron subpopulation (udtrykke nEGFP og mtdTomato) (Figur 2A,B,D), men ikke det nederste lag projektion neuroner født i tidligere aldre. Behovet for heterkronic dobbelt elektroporation var derfor berettiget på grund af de forskellige tidspunkter i genereringen af de fremspringende celler af interesse og cellerne innervated af dem. Disse øverste lag målrettede neuroner sende deres axoner til den kontralaterale halvkugle med en karakteristisk arborization mønster (Figur 2C). Forskelle i dette typiske axonale arborization mønster kunne evalueres ved gevinst eller tab af funktionsforsøg i målceller ved hjælp af denne dobbelte elektroporation protokol. Høj forstørrelse analyse viser i detaljer callosal axoner innervating målrettede projektion neuroner i den kontralaterale halvkugle (Figur 2E).
Figur 1: Strategi A. Dobbelt i utero elektroporation strategi for at studere tætte interaktioner mellem celler med forskellige rumlige og tidsmæssige oprindelse. (A) Skemaer over den protokol, der anvendes til at målrette CR-celler, der udtrykker mCherry og kortikale projektionneurer, der udtrykker EGFP. (B) Repræsentativt billede af en koronal del af en hjerne efter dobbelt elektroporation i kortikale kant og den laterale cortex. Celler, der er mål for den kortikale kant (rød), migrerer tangentielt og befolker neocortex'ens marginalzone. Mærkede celler i ventrikelzonen af cortex generere kortikale projektion neuroner (grøn), der migrerer radialt at indtaste den spirende kortikale plade. Skalabar = 200 μm. (C) Forstørrelse af det område, der er pakket i panel B, og som viser den laterale cortex og de to typer celler, der er mærket efter dobbeltelektroporationsprotokollen. Stiplede linjer indrammer den marginale zone og kortikal plade. Skalabar = 100 μm. Høj forstørrelse til højre viser en detalje af den marginale zone, der indeholder de arboriserede førende processer i projektionen neuroner blandet med CR-celler organer og processer. Vægtstang = 10 μm. Ctx = cortex; Hem = kortikale kant; MZ = marginalzone; CP = kortikalplade; IZ = mellemzone. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Strategi B. Dobbelt elektroporationstrategi for at studere langtrækkende interaktioner mellem celler med forskellig rumlig og tidsmæssig oprindelse. (A) Ordning, der viser strategien for at målrette forskellige populationer af kortikale projektion neuroner i lateral neocortex herunder somatosensoriske område i forskellige halvkugler ved dobbelt i livmoderen elektroporation. Projektion neuroner i somatosensoriske cortex af højre halvkugle rettet mod E13.5 udtrykt BFP. Målrettede projektionneurer i den kontralaterale side rettet mod E15.5 udtrykte nuklear EGFP (nEGFP) og membranmålrettet tdtomat (mtdTomato). (B) Repræsentativt billede af en koronal del af en hjerne, der gennemgik dobbelt elektroporation kirurgi med de nævnte plasmider i panel A. Bemærk de forskellige fordelinger af cellerne mærket af BFP eller nEGFP og den intense mærkning af axoner af øverste lag callosal projektion neuroner (mtdTomato) mærket på E15.5. Skala bar = 500 μm. (C) Billede af den somatosensoriske cortex placeret i højre hjernehalvdel i en dobbelt elektroporeret hjerne. Bemærk den brede fordeling af projektionen neuroner (blå) på tværs af lag og den rigelige arborization af callosal axoner (rød) kommer fra projektion neuroner målrettet i den kontralaterale halvkugle. Skala bar = 100 μm. (D) Billede af den somatosensoriske cortex i venstre hjernehalvdel af en dobbelt elektroporeret hjerne. Bemærk den diskrete lokalisering af de målrettede projektionneurer i den øverste del af kortikpladen som vist ved udtrykket af nEGFP (grøn) samt den store røde mærkning, der omgivende cellelegemer og alle neuronale projektioner (rød). Skala bar = 100 μm. (E) Høj forstørrelse billeder af somatosensoriske cortex i højre halvkugle viser detaljer om arborization af callosal axoner omkring målrettede projektion neuroner. Vægtlinje = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Strategi | Rækkefølgen af elektroporation | Målceller | Målrettet region | Ventrikel injiceres | Elektrodernes placering | Spænding og impulser | Anvendte Plasmider | Analysealderen |
| A | Første | CR-cell hos E11.5 | Kortikale hem | Venstre | Positiv i venstre halvkugle (rettet mod den mediale væg) | 25 V, 40 ms, 4p | CAG-mCherry | Dagens e-n og -er ikke til at tage en del af |
| Anden | Cortical Projection neuroner hos E13.5 | Somatosensory Cortex | Venstre | Positiv i venstre halvkugle | 35 V, 60 ms, 5p | CAG-EGFP | ||
| (rettet mod cortex) | ||||||||
| B | Første | Cortical Projection neuroner hos E13.5 | Somatosensory Cortex | Højre | Positiv i højre halvkugle | 35 V, 60 ms, 5p | CAG-BFP | P15 |
| (rettet mod cortex) | ||||||||
| Anden | Cortical Projection neuroner hos E15.5 | Somatosensory Cortex | Venstre | Positiv i venstre halvkugle | 50 V, 80 ms, 5p | CAG-nEGFP-2A-mTdTomato | ||
| (rettet mod cortex) |
Tabel 1: Oversigt over de elektroporationbetingelser, der anvendes i de forskellige forsøg.
| Overlevelse af embryoner efter dobbelt i livmoderelektroporation i strategi A | |||||||||
| Antal kuld | Første antal embryoner | Antal embryoner, der overlever den første EP | Antal embryoner, der overlever anden EP | % af overlevelse efter første EP | % af overlevelse efter anden EP* | % af den globale overlevelsesrate | |||
| 9 | Samlet antal | (Gennemsnitligt kuld ± SD) | Samlet antal | (Gennemsnitligt kuld ± SD) | Samlet antal | (Gennemsnitligt kuld ± SD) | 75% | 83.33% | 62.50% |
| 64 | 7.11 ± 2.08 | 48 | 5,33 ± 1,22 | 40 | 4,44 ± 1,01 | ||||
| Antal aborterede embryoner efter første EP | Antal aborterede embryoner efter anden EP | Samlet antal aborterede embryoner | % af abort efter første EP | % af abort efter anden EP* | % af den globale abortrate | ||||
| Samlet antal | (Gennemsnitligt kuld ± SD) | Samlet antal | (Gennemsnitligt kuld ± SD) | Samlet antal | (Gennemsnitligt kuld ± SD) | 25% | 16.66% | 37.50% | |
| 16 | 1,8 ± 1,09 | 8 | 0,88 ± 0,78 | 24 | 2,67 ± 1,32 | ||||
| * Overlevelse og abort beregnet i betragtning af de embryoner, der overlevede første elektroporation | |||||||||
Tabel 2: Fostres overlevelse efter dobbelt in utero-elektroporation i strategi A.
| Overlevelse af embryoner og unger efter strategi B (dobbelt EP E13.5 og E15.5) | |||||||||||
| Antal kuld | Første antal embryoner | Antal embryoner, der overlever den første EP | Antal unger født efter dobbelt EP | Antal embryoner, der overlever ved P15 | % af overlevelse efter første EP | % af overlevelse efter anden EP | % af overlevelse ved P15 | ||||
| 8 | Samlet antal | (Gennemsnitligt kuld ± SD) | Samlet antal | (Gennemsnitligt kuld ± SD) | Samlet antal | (Gennemsnitligt kuld ± SD) | Samlet antal | (Gennemsnitligt kuld ± SD) | 88.46% | 82.69% | 55.77% |
| 52 | 6,5 ± 2 | 46 | 5,75 ± 2,05 | 43 | 5,38 ± 1,77 | 29 | 3,63 ± 1,6 | ||||
| Overlevelse af embryoner og unger efter en enkelt EP ved E13.5 | ||||||||
| Antal kuld | Første antal embryoner | Antal unger født efter EP | Antal embryoner, der overlever ved P15 | % af overlevelse efter EP | % af overlevelse ved P15 | |||
| 11 | Samlet antal | (Gennemsnitligt kuld ± SD) | Samlet antal | (Gennemsnitligt kuld ± SD) | Samlet antal | (Gennemsnitligt kuld ± SD) | 89.74% | 57.69% |
| 78 | 7,1 ± 1,64 | 70 | 6,36 ± 1,7 | 45 | 4,09 ± 2,07 | |||
Tabel 3: Hvalpenes overlevelse efter dobbelt i livmoderelektroporation i strategi B sammenlignet med simpel elektroporation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studiet af celle-celle interaktioner in vivo i regioner med høj cellulær tæthed som hjernebarken er en kompleks opgave. Traditionelle tilgange, herunder anvendelse af antistoffer til mærkning af neuritter, er ikke egnede på grund af manglen på specifikke markører for forskellige cellepopulationer. Brugen af transgene murine modeller, hvor en bestemt celletype udtrykker et fluorescerende protein, er nyttigt at visualisere de neuronale processer, men dette afhænger af tilgængeligheden af sådanne modeller. Denne opgave er endnu mere kompliceret, når de forsøger at visualisere mulige forskelle i samspillet mellem to bestemte celletyper ved ætsning af gener af interesse, fordi det indebærer brug af andre dyremodeller, som knockout mus. Alle disse spørgsmål gjorde disse undersøgelser komplicerede tidligere på grund af økonomiske og tidsmæssige omkostninger.
Fremkomsten af nye teknikker, der tillader somatisk transgenese in vivo, såsom in utero elektroporation, giver mulighed for at designe strategier som den, der er beskrevet i denne protokol, som omgår brugen eller generationen af kombinerede reporter og knockout dyr, hvilket gør denne type eksperiment mere realistisk. De resultater, der fremgår af denne publikation og tidligere offentliggjorte undersøgelser8, viser, at denne protokol 1) med held gør det muligt at målrette mod cellepopulationer med forskellig tidsmæssig og rumlig oprindelse. 2) gør det muligt visualisering af celle-celle kontakter med høj opløsning; og 3) er nyttig til at opdage forskelle i cellekontakter efter funktionelle eksperimenter.
På trods af den brede brug af in utero elektroporation, denne teknik kræver betydelig uddannelse for sikkert at udføre operationen, manipulere embryoner uden at beskadige dem, og sikre den korrekte målretning af den ønskede region. Men efter denne træning, overlevelse af gravide kvinder er fremragende (omkring 100% i vores hænder), og vi har fundet nogen forskelle mellem enkelt og dobbelt i livmoderen elektroporation. Enkelt og dobbelt elektroporeret gravide hunner inddrive meget hurtigt fra operationen. I langt de fleste tilfælde, deres adfærd dagen efter enkelt eller dobbelt kirurgi synes normal, og disse gravide hunner spise, drikke, gå, og endda klatre uden problemer uden synlige tegn på smerte og angst.
Overlevelsen af embryoner efter den første og den anden elektroporation er også god samlet, og antallet af abort falder som alder af embryoner stiger (Tabel 2 og Tabel 3). Den største vanskelighed er vellykket målretning i begge elektroporationer. Med ældre embryoner fra E13.5 og fremefter er graden af succes meget høj. Tidlige aldre som E11.5 er mere udfordrende, fordi den lille størrelse af embryoner gør håndtering og injektion vanskeligere, hvilket desuden påvirker deres overlevelse. Men embryoner, der overlever den første E11.5-elektroporation, har en meget god overlevelsesrate efter den anden elektroporation ved E13.5 (tabel 2). For at forbedre færdigheder med denne teknik, Vi anbefaler stærkt at praktisere operationer hos hvalpe på ~ E14.5 og gradvist forsøger operationer i yngre aldre.
En anden udfordring er postnatal overlevelse, fordi mødre, der gennemgår kirurgi ikke altid tage sig af alle deres hvalpe, selv om gravide hunner enkelt eller dobbelt elektroporeret levere hvalpene uden problemer (Tabel 3) og deres adfærd og fitness status ser normal. I vores hænder, og med den timing, der er beskrevet her, finder vi ingen vigtige forskelle i postnatal overlevelse efter enkel og dobbelt elektroporation (Tabel 3), men for at omgå mulige overlevelsesproblemer hvalpe kan overføres til pleje mødre ved fødslen, når virkelige mødre vise dårlig moderlig adfærd ved fødslen. Giver ekstra redebygning materiale og rig mad til gravide hunner forud for leveringsdatoen kan også bidrage til at øge overlevelsesraten for hvalpene.
En af de største fordele ved denne strategi er brugen af vilde typemus til funktionelle undersøgelser, men den kan også anvendes, for eksempel til CRE reportermus eller floxed mus til gener af interesse, når de er tilgængelige. I disse mus vil elektroporation af CRE-recombinase, der udtrykker plasmider, muliggøre et permanent udtryk for reportergenet eller inaktiveringen af det ønskede gen i henholdsvis målcellerne. Til funktionelle eksperimenter kan vi også kun kontrollere konstruktionens udtryk i celletypen. For eksempel, en neuronal promotor kan bruges til at manipulere en kandidat gen kun i neuroner og ikke i neurale stamceller, dermed forhindre uønskede virkninger på stamcelleniveau. Alle disse overvejelser, sammen med kontrol af tiden og den målrettede region, gør dobbelt i livmoderen elektroporation en meget alsidig teknik til at studere celle-celle interaktioner ikke kun inde i cortex, men også i andre strukturer, der kan målrettes ved hjælp af denne teknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Cristina Andrés Carbonell og medlemmer af Animal Care-faciliteten i Universidad de Valencia for teknisk bistand. Vi vil også gerne takke Isabel Fariñas og Sacramento R. Ferrón for reagenser og dele deres udstyr med os. I.M.W er finansieret af en Garantía Juvenil kontrakt fra Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D er finansieret af Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz har et Ramón y Cajal-legat (RYC-2015-19058) fra den spanske ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Dette arbejde blev finansieret RYC-2015-19058 og SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
