Summary
Двойная электропорация матки позволяет ориентироваться на популяции клеток, которые пространственно и временно разделены. Этот метод полезен для визуализации взаимодействий между этими популяциями клеток с использованием флуоресцентных белков в нормальных условиях, но и после функциональных экспериментов, чтобы возмутить гены, представляющие интерес.
Abstract
В утробе электропорации in vivo метод передачи ДНК широко используется для изучения молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе кортикогенеза млекопитающих. Эта процедура использует желудочки мозга, чтобы позволить введение ДНК интерес и использует пару электродов, чтобы направить вход генетического материала в клетки, выстилающие желудочек, нервные стволовые клетки. Этот метод позволяет исследователям маркировать желаемые клетки и/или манипулировать выражением генов, представляющих интерес в этих клетках. Он имеет несколько приложений, в том числе анализы, ориентированные на миграцию нейронов, отслеживание линий и аксональный поиск путей. Важной особенностью этого метода является его временный и региональный контроль, позволяющий обойти потенциальные проблемы, связанные с эмбриональной летальностью или отсутствием конкретных мышей-водителей CRE. Другим важным аспектом этого метода является то, что он помогает значительно уменьшить экономические и временные ограничения, которые связаны с генерацией новых линий мыши, которые становятся особенно важными в изучении взаимодействий между типами клеток, которые возникают в отдаленных областях мозга в разном возрасте развития. Здесь мы описываем стратегию двойного электропорации, которая позволяет ориентироваться на популяции клеток, которые пространственно и временно разделены. При таком подходе мы можем маркировать различные подтипы клеток в разных местах с выбранными флуоресцентными белками, чтобы визуализировать их, и/или мы можем манипулировать генами, представляющими интерес, выраженными этими различными клетками в надлежащее время. Эта стратегия повышает потенциал в электропорации матки и обеспечивает мощный инструмент для изучения поведения временно и пространственно разделенных популяций клеток, которые мигрируют для установления тесных контактов, а также дальнобойных взаимодействий через аксональные прогнозы, снижая временные и экономические издержки.
Introduction
Кора головного мозга является очень сложной и замысловато организованной структурой. Для достижения такой степени организации, корковые проекционные нейроны проходят через сложные процессы развития, которые требуют их временного поколения, миграции к конечному пункту назначения в корковой пластине, и создания коротких и дальних соединений1,2. Долгое время классический способ изучения кортикогенеза основывался на использовании нокаут-или стук-в мурин модели генов, представляющих интерес. Тем не менее, эта стратегия, и в частности использование условного нокаут мышей, занимает много времени и дорого, а иногда и создает дополнительные проблемы, связанные с существованием генетической избыточности или отсутствие конкретных драйверов CRE, среди других вопросов. Один из подходов, которые возникли, чтобы попытаться решить эти проблемы, и что в настоящее время широко используется для изучения коркового развития в утробеэлектропорации 3,4. В утробе электропорации является метод, используемый для соматического трансгенеза, что позволяет in vivo ориентации нервных стволовых клеток и их потомства. Этот метод может быть использован для обозначения клеток по выражению флуоресцентных белков5,,6, для манипуляции генами in vivo (т.е. получить или потерю функциональных анализов)7,8,9, для изоляции электропорированных кортиков в пробирке и культивирования клеток8,10., Кроме того, в утробе электропорации допускается временное и региональное управление целевым районом. Этот метод имеет многочисленные применения и широко используется для изучения нейронной миграции, деления стволовых клеток, нейронной связи, и другие предметы8,9,11,12.
Нынешняя рукопись описывает использование в утробе электропорации вариант, называется двойной в утробе электропорации, для анализа взаимодействий клеток в коре головного мозга с различными височных и пространственных происхождения. Эти исследования чрезвычайно сложны для завершения при использовании моделей мурина, поскольку они требуют комбинированного использования нескольких трансгенных линий. Некоторые из применений протокола, описанного в настоящем документе, включают изучение тесных взаимодействий между соседними клетками, а также взаимодействия между удаленными клетками через долгосрочные проекции. Метод требует выполнения двух независимых в утробе электропорации операций, разделенных временно и пространственно, на одних и тех же эмбрионов для целевой различных групп клеток, представляющих интерес. Преимуществом такого подхода является возможность манипулирования функцией генов в одном или обоих типах нейронов с использованием диких животных типа. Кроме того, эти функциональные эксперименты могут быть объединены с выражением цитоплазматических или мембранных флуоресцентных белков для визуализации тонкой морфологии целевых клеток, включая дендритов и аксонов, и анализировать возможные различия в клеточных взаимодействиях по сравнению с контролем (т.е. клетки, помеченные только флуоресцентным белком).
Протокол, очерченный здесь, сосредоточен на изучении клеточных взаимодействий внутри неокортекса, но эта стратегия может также быть использована для изучения взаимодействий с внекортикальными областями, которые могут быть направлены с помощью электропорации внутриутробности, как подпаллий или таламус13,,14, или клеточно-клеточных взаимодействий в других структурах, таких как мозжечок15. Ориентация на различные области основана на ориентации электродов и на желудочке, где впрыскивается ДНК (боковая, третья или четвертая). При описанной здесь стратегии мы можем обозначить значительное количество ячеек, что полезно для оценки общих изменений в подключении/иннервации в функциональных экспериментах. Тем не менее, для изучения мелких изменений в подключении, можно использовать модифицированные версии в электропорации матки, чтобы получить разреженную маркировку и определить одиночные клетки16. Таким образом, двойное в утробе электропорации является универсальным методом, который позволяет ориентации временно и пространственно разделенных популяций клеток и изучение их взаимодействия в деталях, либо в условиях контроля или в сочетании с функциональными экспериментами, значительно снижая временные и экономические затраты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Описанная в настоящем чиновническом процедура была одобрена комитетом по этике, отвечающим за эксперименты, благополучие животных Университета Валенсии и Конселлерии де Агрикультура, Десарролло Сельские, Чрезвычайные Климатика и Transici'n Ecol'gica Из Comunidad Валенсиана, и придерживается руководящих принципов Международного совета по лабораторным наукам животных (ICLAS) рассмотрены в реальном Decreto 53/2013 испанского законодательства, а также в Директиве 2010/63/EU Европейского парламента и Совета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол включает в себя две различные цели: 1) первое исследование, называемое "стратегия А", позволяет анализировать взаимодействия между клетками Cajal-Retzius (CR-клетки) и раннерожденных корковых проекционных нейронов в одном полушарии мозга; 2) второе исследование, "стратегия B", проводится для того, чтобы изучить иннервацию верхнего слоя мозолальных проекционных нейронов к контралатеральной стороне неокортекса.
1. Предупреждении
- Препарат ДНК
- Преобразуйте химически или электрокомпетентные клетки E. coli DH5 с плазмидами интереса, потените их на пластины LB agar с соответствующим антибиотиком, и инкубировать их на ночь при 37 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все плазмиды, используемые здесь, содержат общий промоутер для куриного й-актина (CAG), вождения выражение флуоресцентного-репортер белка (CAG-mCherry и CAG-EGFP для стратегии A и CAG-BFP и CAG-nEGFP-2A-mtdTomato для стратегии B). Все они содержат устойчивость к ампициллину (AMP). - Выберите отдельные колонии из каждой плазмидной трансформации и инициируйте стартерную жидкую культуру в 2 мЛ бульона Лурия и ампициллина (ЛБЗ AMP) в бактериальных трубках культуры в течение 3–4 ч при 37 градусах с энергичным встряхиванием (200 об/мин). После, установить большую бактериальную культуру в 500 mL Erlenmeyer колбу добавив 200 мл LB-AMP и 1 mL стартовой культуры. Инкубировать ночью при 37 градусах в орбитальном шейкере при 200 об/мин.
- Используйте комплект макси-подготовки без эндотоксина(Таблица материалов)в соответствии с инструкциями производителя для получения чистой и концентрированной плазмидной ДНК из жидких культур. Повторное увеличение ДНК в буфере Трис-ЭДТА (TE) без эндотоксина для получения концентраций не менее 5 мкг/л.
- Для каждой операции подготовьте раствор с окончательным объемом 10 мл, содержащий 1 мл быстрого зеленого красителя, плазмидный ДНК, представляющий интерес для окончательной концентрации 1 мкг/л для каждой плазмиды, и эндотоксина без буфера TE. Например, смешайте 1 мл быстрого зеленого красителя, 2 л раствора ДНК с плазмидой 5 мкг/л и 7 мл буфера TE.
- Преобразуйте химически или электрокомпетентные клетки E. coli DH5 с плазмидами интереса, потените их на пластины LB agar с соответствующим антибиотиком, и инкубировать их на ночь при 37 градусов по Цельсию.
- Пипетт потянув
- Вытяните борозиликата стеклянные капилляры (1/0,58 мм внешнего/внутреннего диаметра) в вертикальный микропьеттерный шкив до тех пор, пока кончик не достигнет длины 1–1,5 см, и обрежьте его с помощью рассекающих щипцов под углом примерно 30 градусов под расчленяющей прицелом.
- Установка хирургической комнаты
- Положите все оборудование на операционный стол (на то есть пинцет, ножницы, щипцы, микропьетты, иглу и иглу). Включите грелку и накройте ее стерильной хирургической абсорбирующей прокладкой. Убедитесь, что резервуар в аппарате для ингаляционной анестезии заполнен изофлураном, кислородный баллон содержит достаточно кислорода, и система функционирует должным образом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическое отделение и устойчивый материал должны быть как можно более стерильными (т.е. весь материал должен быть автоматически обнаружен до операции, а поверхности должны быть продезинфицированы 70% этанолом). Платиновые электроды должны быть тщательно дезинфицированы сначала с зародышем мылом, а во-вторых с 70% этанола до операции. - Приготовьте 100 мл 0,9% (w/v) стерильный солевой раствор, содержащий пенициллин-стрептомицин 1:100 и заполните 10-сантиметровую чашку Петри. Поместите пластину на верхней части нагретой площадки, чтобы разогреть раствор.
- Заполните шприц 1 мл 150 мл обезболивающего раствора (например, бупренорфин 0,1 мг/кг).
- Загрузите вытягиваемую пипетки с 5 мл окончательного плазмидного ДНК раствора, подготовленного в шаге 1.1.4. Подключите капилляр к контролируемой ртом аспираторной трубке.
- Положите все оборудование на операционный стол (на то есть пинцет, ножницы, щипцы, микропьетты, иглу и иглу). Включите грелку и накройте ее стерильной хирургической абсорбирующей прокладкой. Убедитесь, что резервуар в аппарате для ингаляционной анестезии заполнен изофлураном, кислородный баллон содержит достаточно кислорода, и система функционирует должным образом.
2. Первый в утробе электропорации хирургии
- Поместите E11.5 (стратегия A) или E13.5 (стратегия B) C57BL/6 беременной мыши внутри закрытой индукционной камеры с 2,5% (v/v) изофлураном на 0,8 л/мин и подождите, пока она будет анестезирована. Перенесите мышь на грелку и положите ее нос в маску для постоянной доставки изофлурана. Проверьте отсутствие педали рефлекс как показатель правильной анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Embryonic возраст определяется на основе дня, когда вагинальный штепсельной вилки наблюдается (E0.5). - Вводят беременной женщине анальгетиковый раствор (0,1 мг/кг бупренорфина) подкожно. Чтобы предотвратить высыхание глаз во время процедуры, нанесите одну каплю глазной мази на каждый глаз с помощью ватного тампона.
- Бритье брюшной области мыши с электрической бритвой и мыть его 2x с 70% (v/ V) этанол салфетки, один раз с йодом салфетки, и в последний раз с этанолом протрите.
- Используйте ножницы, чтобы сделать 30 мм длинный разрез через кожу в правой стороне животного и тщательно отделить соседнюю кожу от мышцы с тупой шпателем. После этого сделайте второй разрез в брюшной стенке.
- Обложка живота с куском сложенной бумаги ткани ранее дезинфицируют с 70% этанола, содержащего 40 мм длиной щели в центре. Аккуратно вытащите матку из брюшной полости с помощью кольцевых щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Матка должна быть мокрой с теплым солевым раствором, подготовленным в шаге 1.3.2 в течение всей процедуры. - Предварительно загрузите вытягиваемые пипетки раствором ДНК, подготовленным в шаге 1.1.4. Впрысните 0,5 мл раствора ДНК на эмбрион в боковой желудочек выбранного полушария с помощью контролируемой ротом аспираторной трубки до тех пор, пока быстрый зеленый краситель не будет заметен внутри желудочка.
- Поместите платиновые электроды типа щипцов на голове инъекционного эмбриона (как показано на рисунке 1A и рисунке 2A). Ориентируйте электроды на нужную область мозга. Направьте положительный полюс к медиальной стене, чтобы электропорировать корковый подол (стратегия А) или к боковой коре (стратегия B) для обозначения клеток, генерируемых в этой области.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех случаях, сердце и плацента следует избегать, чтобы обеспечить эмбриональное выживание. - Примените специфическую последовательность электрических импульсов с помощью электропоратора квадратной волны по показаниям, указанным в таблице 1 (стратегия эмбрионов A E11.5: четыре импульса 25 В и 40 мс, разделенные интервалами 950 мс; стратегия B E13.5 эмбрионов: пять импульсов 35 V и 60 мс, с интервалами 950 мс).
- Аккуратно поместите матку обратно в брюшную полость щипцами, заполните ее теплым солевым раствором и закройте брюшную стенку игольным швом 6-0. Присоединяйтесь к двум сторонам первоначального разреза, сделанного в коже либо с помощью иглы 6-0 швов или швов клипов.
- Поддерживайте животное на грелке и следите за ним до его выздоровления после анестезии. Обеспечьте дополнительную дозу анальгезии (150 мл) в растворе гидрогеля, помещенном в его домашнюю клетку.
- Через 24 часа после операции вводят дополнительную дозу анальгезии (150 мл). Продолжить ежедневный мониторинг путем визуального осмотра на возможные боли и бедствия. Наблюдайте за поведением животного, проверяйте его нормальные рефлексы задней конечности и осматривайте шов на наличие возможных признаков повреждения из-за лизания или царапин раны.
3. Второе место в электропорации матки
- Через два дня после первой операции, повторите шаги 2.1'2.3. Хотя восстановление беременных женщин после операции очень хорошо, убедитесь, что они показывают нормальное поведение и не представляют никаких признаков боли или бедствия перед выполнением второй операции (E13.5 эмбрионов для стратегии А и E15.5 для стратегии B).
- Сделайте 30 мм длинный разрез через кожу, как в шаге 2.4 и второй разрез на брюшной стенке, на этот раз в левой стороне животного. Тщательно подвергать матку на верхней части дезинфицированной ткани, как описано в шаге 2.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не вмешиваться в разрез, ранее сделанный в другой стороне. - Введите около 0,5 мл на эмбрион раствора ДНК в боковой желудочек мозга полушария, ранее электропорированный в случае стратегии А и в боковой желудочек мозга контралатерского полушария для стратегии B.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только эмбрионы, показывающие нормальное развитие и отсутствие признаков реабсорбции. - Поместите электроды вокруг головы эмбриона, как описано в шаге 2.7, направляя положительный электрод в сторону боковой коры и применяя соответствующие импульсы по показаниям, указанным в таблице 1 (стратегия эмбрионов E13.5: пять импульсов 35 V и 60 мс, разделенных интервалами 950 мс; стратегия B E15.5 эмбрионов: пять импульсов по 50 В и 80 мс, разделенных интервалами 950 мс).
- Продолжить и закончить операцию, как описано в шагах 2.8'2.10.
4. Заготовки тканей и секцио сечение
- Стратегия А
- Через четыре дня после второй электропорации (Е17,5) выполните вывих шейки матки беременной самки и поместите ее в положение на спине.
- Используя ножницы, сделайте вентральный разрез для извлечения рога матки и с щипцами поместите их в чашку Петри, наполненную 1x фосфат-буферизированный солевой раствор (PBS), помещенный на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Низкая температура делает возможным обезболивания эмбрионов. - Используя пинцет, извлекайте эмбрионы из амниотического мешка и переносите их с щипцами в новую заполненную PBS чашку Петри под расчленяющим прицелом. Аккуратно держите голову эмбрионов с помощью щипцов и проводите вскрытие мозга пинцетом, чтобы сначала удалить кожу над головой, а затем и черепом. Используйте шпатель, чтобы вытащить открытые мозги.
- Соберите мозги ложкой и депозйте их в 48-й колодец, наполненный фиксирующим раствором (4% параформальдегида в 1x PBS). Испытание немедленно для успешного исхода обоих электропораций путем изучения мозга с помощью перевернутого эпифлуоресценции микроскоп, например.
- Зафиксировать эмбриональный мозг на ночь при 4 градусах Цельсия в орбитальном шейкере. Вымойте с 1x PBS для устранения следов PFA. Затем перенесите их в PBS с противогрибковыми консервантами (1x PBS-0.05% (w/v) азид натрия).
ВНИМАНИЕ: ПФА и азид натрия являются цитотоксическими соединениями, которые требуют особой предосторожности во время их использования. - Встраивайте зацикленные мозги в 4% (w/v) низкой температуре плавления агарозы в 1x PBS и подождите 10 минут, пока она не затвердеет. Приклеить их к держателю ткани вибратома с помощью цианоакрилата клея с обонятельными луковицами, обращенными вверх, чтобы получить корональные секции.
- Инициировать вибратом и выбрать желаемые параметры: 100 мкм шириной, 0,60 мкм/с скоростью и 0,60 мм амплитуды.
- Безопасный мозг внутри контейнера вибратом, заполните его 1x РЕШЕНИЕм PBS, и начните собирать корональные серийные разделы с помощью кисти в 48 хорошо пластины заполнены 1x PBS-0.05% (w/v) натрия азиде иметь полное изображение мозга (например, около семи разделов на колодец и шесть скважин на эмбрион).
- Смонтировать желаемые секции в микроскоп стеклянные слайды с помощью тонкой кисти. Обложка их со стеклянными крышками. Для длительного хранения добавляем монтажную среду, которая предотвращает фотосъемку и фотооксоксидацию. Наблюдайте слайды под вертикальным эпифлуоресценцией микроскопом для оценки эффективности электропорации.
- Стратегия B
- Пусть щенки ранее электропорированных на E13.5 и E15.5 родиться и ждать, пока P15 для выполнения транскардиальной перфузии с использованием того же фиксаторного решения, используемого в шаге 4.1.4.
- Непосредственно перед перфузией, интраперитонально вводят дозу 75/1 мг/кг кетамина/медетомидина. Когда педальный рефлекс теряется, обеспечить мышь в положении на спине и сделать брюшной разрез после средней линии с помощью ножниц, чтобы разоблачить как грудная клетка и диафрагма.
- Вырежьте диафрагму и откройте грудную клетку, чтобы получить доступ к сердцу. Держите грудную клетку с помощью гемостата и сделайте разрез в правом предсердии с тонкими ножницами.
- Проникнуть в левый желудочек с помощью иглы, подключенной с гибкой трубкой к перистальтическому насосу перфузии. Начало транскардиальной перфузии, обеспечивая по крайней мере 25 мл 4% PFA при постоянном потоке 5,5 мл/мин (общее время 5 мин).
- Вскрыть мозг переросшие животные. Во-первых, удалить кожу над головой с ножницами и щипцами. Начните резки черепа с помощью ножниц и тщательно снять разделы костей черепа, пока они полностью удалены. Наконец, извлечь мозг с помощью шпателя.
- Перенесите мозги на 24-го колодца и зафиксируйте их с 4% PFA на ночь при 4 градусах на орбитальном шейкере. Остановить фиксацию, заменив PFA с 0,05% (w/v) азиде натрия в PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как указано в шаге 4.1.5, желательно провести промежуточную стирку с 1x PBS. - Повторите шаги 4.1.6'4.1.9, изменяя параметры вибрама для послеродового мозга (40 мкм шириной, 1,20 мк/с скоростью и 0,5 мм амплитуды).
ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуногистохимия или иммунофлуоресценция может быть проведена для обнаружения конкретных маркеров клеток или повышения сигнала флуоресцентных белков, используемых в электропорации.
5. Конфокальная флуоресценция изображений и анализа
- Включите конфокальный микроскоп, поместите слайды микроскопа, содержащие установленные участки мозга, на держатель слайдов микроскопа и выберите каналы, по которым будут сделаны изображения флуоресценции (т.е. 420-460 нм для BFP, 490-540 нм для GFP и 570-620 нм для mCherry и tdTomato).
- Выполните сканирование образца для получения картографических изображений каждого раздела мозга на двух разных длинах волн для общего представления о выходе двойного электропорации. После завершения, выберите 10x объектив и многопрофильной--стек-timelapse режим наблюдения. Это позволит с программированию автоматического приобретения флуоресценции изображений на различных локализациях XY' в разделах мозга.
- В каждом из выбранных регионов (XY) установлены надлежащие параметры визуализации (т.е. интенсивность лазера, чувствительность фотомультиля и минимальное разрешение 1024 x 1024), а также глубина сканирования (я) в зависимости от плоскостей образца, где видна флуоресценция.
- Получить низкое увеличение (10x) изображения всех выбранных регионов и экспортировать их из формата OIF в формат TIFF с помощью программного обеспечения просмотра микроскопа.
- Измените на 60x объектив, повторите шаг 5.3 и захват изображения высокого увеличения для наблюдения за взаимодействиями клеток и клеток более подробным образом. Экспорт их, как указано в шаге 5.4.
- Откройте приобретенные изображения с помощью любого программного обеспечения для визуализации (например, Фиджи) для дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Взаимодействие между соседними клетками возникло в дистальных местах и в разное время: клетки Cajal-Retzius (CR-клетки) и ранние мигрирующие корковые проекционные нейроны (стратегия А)
Взаимодействие CR-клеток и ранних корковой проекции нейронов ранее было описано как необходимое для регулирования сомальной транслокации через молекулы смешения нектина и кадерина с помощью стратегии двойной электропорации8. CR-клетки происходят из нейроэпителия по краям паллия и мигрируют касательно, чтобы заселить самую поверхностную часть коры головного мозга, маргинальную зону17,18,,19, в то время как корковые проекционные нейроны генерируются в пролиферативной зоне коры головного мозга и мигрируют радиально в зарождающуюся корковую пластину20. Существует временная разница в генерации обоих типов клеток. CR-клетки генерируются на очень ранних эмбриональных стадиях от E10.521,22 и корковых проекционных нейронов, которые мигрируют по сомальной транслокации рождаются из E12.5-E13.523., Используя двойное в утробе электропорации, височный разрыв между операциями позволяет CR-клетки, ориентированные на E11.5 в одном из своих мест происхождения (корковый подол), чтобы достичь маргинальной зоны боковой неокортекса, включая соматосенсорную область вовремя установить контакты с кортикальными проекционными нейронами, помеченными на E13.5(рисунок 1A,B). Ведущие процессы проекционных нейронов, выражающих усиленный GFP (EGFP), обильно арразизируются в маргинальной зоне коры головного мозга и смешиваются с процессами CR-клеток, которые выражают mCherry(рисунок 1С). Функциональные эксперименты показали, что возмущение молекул клея клеток,выраженных проекционными нейронами или CR-клетками влияет на арборизацию их процессов в результате измененных контактов между обоими типами клеток8.
Долгосрочные взаимодействия между дистальными клетками, генерируемыми в разное время: иннервация нейронов мозоли-проекции верхнего слоя к контралатеральной стороне неокортекса (стратегия B)
Каллозальные корковые проекционные нейроны присутствуют по всей коре головного мозга, будучи более обильными в верхних слоях24. Эти нейроны проецируют свои аксоны через мозоли корпуса и контактируют с их клетками-мишенями, проекционными нейронами, расположенными через различные слои контратераальной коры 25,,26,,27. Верхний слой проекции нейронов эволюционно новее, чем нижний слой нейронов и были значительно расширены у приматов28. Эти клетки имеют решающее значение для сложной мысли и более высоких ассоциативных задач, и дисфункции в группах генов, специально выраженных этой популяции клеток были недавно связаны с аутизмом29.
Для того, чтобы изучить конкретно взаимодействия субпопуляции мозолальных проекционных нейронов, расположенных в верхних слоях с их целевых клеток, распределенных по всему контралатеральному полушарию, мы разработали двойной в утробе электропорации протокола. Для обозначения целевых клеток нейронов кавадозальной проекции верхнего слоя мы проводили в электропорации матки на E13.5 с помощью плазмиды BFP, выражающей плазмиду(Рисунок 2AиC). Этот возраст был стратегически выбран, поскольку он позволяет не только ориентации широкой популяции нейронов корковых проекционных нейронов, включая многие слои V нейронов, но и значительное количество нейронов, расположенных в верхних слоях(Рисунок 2C), в основном охватывающих все целевые области калеозальной проекции нейронов из контралатерального полушария. Вторая электрополяция в контралатеральной стороне на E15.5 целевых верхнего слоя мозоли проекции нейрона субпопуляции (выражение nEGFP и mtdTomato) (Рисунок 2A,B,D), но не нижний слой проекции нейронов, родившихся в более раннем возрасте. Поэтому потребность в гетерохронической двойной электропорации была оправдана из-за разного времени в генерации проецирующихся клеток, представляющих интерес, и интроватированных ими клеток. Эти верхние слои целевых нейронов отправить свои аксоны в контралатеральной полушария с характерной картины арборизации (Рисунок 2C). Различия в этой типичной аксональной модели арборизации могут быть оценены при получении или потере функциональных экспериментов в целевых клетках с помощью этого протокола двойной электропорации. Анализ высокого увеличения показывает подробно мозолальные аксоны иннервирующих целевых проекционных нейронов в контралатеральном полушарии(рисунок 2E).
Рисунок 1: Стратегия A. Двойной в стратегии электропорации матки для изучения тесных взаимодействий между клетками с различными пространственными и височных происхождения. (A) Схема протокола, используемого для целевой CR-клеток, выражающих mCherry и корковых проекционных нейронов, выражающих EGFP. (B) Представительное изображение корональной секции головного мозга после двойного электропорации в корковом подоле и боковой коре. Клетки, нацеленные на корковый подол (красный), мигрируют по касательно, населяя маргинальную зону неокортекса. Приклеенные этикетку клетки в желудочковой зоне коры головного мозга генерируют корковые проекционные нейроны (зеленые), которые радиально мигрируют, чтобы войти в зарождающуюся корковой пластины. Масштабная планка No 200 м. (C) Увеличение области, коробленной в панели B, отображающей боковую кору и два типа клеток, помеченных после протокола двойной электропорации. Dashed линии обрамляют маргинальную зону и корковую пластину. Шкала бар No 100 мкм. Высокое увеличение справа показывает деталь маргинальной зоны, содержащей арборизированные ведущие процессы проекционных нейронов, перемешанных с телами и процессами CR-клеток. Шкала бар No 10 мкм. Ctx и кора; Подол и корковый подол; МЗ - маргинальная зона; CP и корковой пластины; ИЗз - промежуточная зона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Стратегия B. Стратегия двойного электропорации для изучения дальнобойных взаимодействий между клетками с различным пространственным и висеским происхождением. ( A )Схемаотображения стратегии для целевой различных популяций корковых нейронов проекции в боковой неокортекс, включая соматосенсории области в разных полушариях в два раза в утробе электропорации. Проекционные нейроны в соматосенсорной коре правого полушария нацелены на E13.5 выраженный BFP. Целевые проекционные нейроны в контралатеральной стороне, нацеленные на E15.5, выраженные ядерным EGFP (nEGFP) и мембранной таречной tdTomato (mtdTomato). (B) Представитель изображение корональной части мозга, которые прошли двойную электропорацию хирургии с упомянутыми плазмиды в панели А. Обратите внимание на различные распределения клеток, помеченных BFP или nEGFP и интенсивной маркировки аксонов верхних слоев мозолальных проекционных нейронов (mtdTomato) помечены на E15.5. Масштабная планка No 500 мкм . (C) Изображение соматосенсорной коры, расположенной в правом полушарии в двойном электропорированном мозге. Обратите внимание на широкое распределение проекционных нейронов (синий) между слоями и обильное арборизация калеотельных аксонов (красный) исходя из проекционных нейронов, ориентированных на контралатеральное полушарие. Масштабная планка No 100 мкм . (D) Изображение соматосенсорной коры в левом полушарии двойного электропорированного мозга. Обратите внимание на дискретную локализацию целевых проекционных нейронов в верхней части корковой пластины, как показано на выражении nEGFP (зеленый), а также обильной красной маркировки окружающих тел клеток и всех нейрональных проекций (красный). Масштабная планка No 100 мкм . (E) Высокое увеличение изображения соматосенсорной коры в правом полушарии, показывающие детали арборизации калезолов аксонов вокруг целевых проекционных нейронов. Масштабная панель No 10 м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
| Стратегии | Орден электропорации | Целевые ячейки | Целевой регион | Вентрикле вводят | Расположение электродов | Напряжение и импульсы | Использованные плазмиды | Эпоха анализа |
| A | Первый | CR-ячейка на E11.5 | Кортикальная похем | Левой | Позитив в левом полушарии (направленный к медиальной стене) | 25 V, 40 мс, 4p | ЦАГ-мЧерри | E17.5 |
| Второй | Кортикальные проекционные нейроны при E13.5 | Соматосенсория Кортекс | Левой | Позитив в левом полушарии | 35 V, 60 мс, 5p | КАГ-ЭГФП | ||
| (направлено в кору головного мозга) | ||||||||
| B | Первый | Кортикальные проекционные нейроны при E13.5 | Соматосенсория Кортекс | Правильно | Позитив в правом полушарии | 35 V, 60 мс, 5p | КАГ-БФП | P15 |
| (направлено в кору головного мозга) | ||||||||
| Второй | Корковые проекционные нейроны на E15.5 | Соматосенсория Кортекс | Левой | Позитив в левом полушарии | 50 V, 80 мс, 5p | ЦАГ-nEGFP-2A-mTdTomato | ||
| (направлено в кору головного мозга) |
Таблица 1: Резюме условий электропорации, используемых в различных экспериментах.
| Выживание эмбрионов после двойного внутриутробного электропорации в стратегии А | |||||||||
| Количество пометов | Начальное количество эмбрионов | Количество эмбрионов, выживших в первом EP | Количество эмбрионов, выживших во втором EP | % выживаемости после первого EP | % выживаемости после второго ЕПЗ | % от глобальной выживаемости | |||
| 9 | Общее число | (Avg. помета и SD) | Общее число | (Avg. помета и SD) | Общее число | (Avg. помета и SD) | 75% | 83.33% | 62.50% |
| 64 | 7.11 и 2,08 | 48 | 5.33 ю 1,22 | 40 | 4.44 ю 1,01 | ||||
| Количество прерванных эмбрионов после первого EP | Количество прерванных эмбрионов после второго EP | Общее количество прерванных эмбрионов | % абортов после первого ЕР | % абортов после второго ЕПЗ | % от глобального уровня абортов | ||||
| Общее число | (Avg. помета и SD) | Общее число | (Avg. помета и SD) | Общее число | (Avg. помета и SD) | 25% | 16.66% | 37.50% | |
| 16 | 1,8 и 1,09 | 8 | 0,88 и 0,78 | 24 | 2,67 и 1,32 | ||||
| «Выживание и аборты рассчитаны с учетом эмбрионов, переживших первую электропорацию | |||||||||
Таблица 2: Выживание эмбрионов после двойного в электропорации матки в стратегии А.
| Выживание эмбрионов и щенков в соответствии со стратегией B (двойной EP E13.5 и E15.5) | |||||||||||
| Количество пометов | Начальное количество эмбрионов | Количество эмбрионов, выживших в первом EP | Количество щенков, родившихся после двойного EP | Количество эмбрионов, выживших на P15 | % выживаемости после первого EP | % выживаемости после второго EP | % выживаемости при P15 | ||||
| 8 | Общее число | (Avg. помета и SD) | Общее число | (Avg. помета и SD) | Общее число | (Avg. помета и SD) | Общее число | (Avg. помета и SD) | 88.46% | 82.69% | 55.77% |
| 52 | 6,5 и 2 | 46 | 5,75 и 2,05 | 43 | 5,38 и 1,77 | 29 | 3,63 и 1,6 | ||||
| Выживание эмбрионов и щенков после одного EP на E13.5 | ||||||||
| Количество пометов | Начальное количество эмбрионов | Количество щенков, родившихся после EP | Количество эмбрионов, выживших на P15 | % выживаемости после EP | % выживаемости при P15 | |||
| 11 | Общее число | (Avg. помета и SD) | Общее число | (Avg. помета и SD) | Общее число | (Avg. помета и SD) | 89.74% | 57.69% |
| 78 | 7,1 и 1,64 | 70 | 6.36 и 1,7 | 45 | 4.09 и 2,07 | |||
Таблица 3: Выживание щенков после двойного в утробе электропорации в стратегии B по сравнению с простой электропорации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изучение клеточно-клеточных взаимодействий в виво в регионах с высокой клеточной плотностью, как кора головного мозга является сложной задачей. Традиционные подходы, включая использование антител для обозначения нейритов, не подходят из-за отсутствия специфических маркеров для различных популяций клеток. Использование трансгенных моделей мурина, где определенный тип клеток выражает флуоресцентный белок, полезно для визуализации нейронных процессов, но это зависит от наличия таких моделей. Эта задача еще более сложна при попытке визуализировать возможные различия во взаимодействии между двумя определенными типами клеток при возмущении генов, представляющих интерес, потому что она включает в себя использование других моделей животных, таких как летучие мыши. Все эти вопросы осложнялись этими исследованиями в прошлом из-за экономических и временных издержек.
Появление новых методов, позволяющих соматический трансгенез в vivo, например, в утробе электропорации, предлагает возможность разработки стратегий, как описано в этом протоколе, которые обходят использование или поколение комбинированных репортеров и нокаут животных, что делает этот тип эксперимента более осуществимым. Результаты, приведенные в этой публикации и ранее опубликованные исследования8, свидетельствуют о том, что этот протокол 1) успешно позволяет ориентироваться на популяции клеток с различным временным и пространственным происхождением; 2) позволяет визуализация контактов клеток с высоким разрешением; и 3) полезно обнаружить различия в контактах клеток после функциональных экспериментов.
Несмотря на широкое применение в утробе электропорации, этот метод требует значительной подготовки для того, чтобы безопасно выполнять операцию, манипулировать эмбрионами, не повреждая их, и обеспечить правильное таргетинг желаемого региона. Однако, после этой тренировки, выживание беременных женщин превосходно (около 100% в наших руках) и мы не нашли никакие разницы между одиночным и двойным в электропорации утробы. Одинокие и двойные электропорированные беременные женщины очень быстро восстанавливаются после операции. В подавляющем большинстве случаев, их поведение на следующий день после одной или двойной операции кажется нормальным, и эти беременные женщины едят, пьют, ходить, и даже подняться без трудностей без видимых признаков боли и бедствия.
Выживание эмбрионов после первой и второй электропорации также хорошо в целом, и скорость аборта уменьшается по мере увеличения возраста эмбрионов(Таблица 2 и Таблица 3). Основная трудность заключается в успешном таргетинге в обоих электропорациях. При более старых эмбрионах от E13.5 степень успеха очень высока. Ранние возрасты, такие как E11.5, являются более сложными, потому что небольшой размер эмбрионов затрудняет обработку и инъекцию, что, кроме того, влияет на их выживание. Тем не менее, эмбрионы, пережившие первую электропорацию E11.5, представляют очень хорошие показатели выживаемости после второй электропорации на E13.5(Таблица 2). Чтобы улучшить уровень знаний с помощью этой техники, мы настоятельно рекомендуем практиковать операции у щенков в E14.5 и постепенно пробуя операции в более молодом возрасте.
Другой проблемой является послеродовое выживание, потому что матери, перенесющие операцию, не всегда заботятся обо всех своих щенках, хотя беременные женщины одинокие или двойные электропорированные доставляют щенков без проблем(Таблица 3)и их поведение и фитнес-статус выглядят нормально. В наших руках, и со сроками, описанными здесь, мы не находим никаких важных различий в послеродовой выживания после простой и двойной электропорации (Таблица 3), но, чтобы обойти возможные проблемы выживания щенков могут быть переданы приемных матерей при родах, когда реальные матери отображения плохого поведения матери при рождении. Предоставление дополнительного материала гнездования и богатой пищи для беременных самок до даты родов также может помочь увеличить выживаемость щенков.
Одним из основных преимуществ этой стратегии является использование диких мышей типа для функциональных исследований, но она также может быть применена, например, к CRE репортер мышей или флоксовых мышей для генов, представляющих интерес, когда это возможно. У этих мышей электропорация CRE-рекомбиназы, выражающей плазмиды, позволит постоянное выражение гена репортера или инактивацию желаемого гена, соответственно, в целевых клетках. Для функциональных экспериментов мы также можем контролировать выражение конструкции только в типе ячейки интереса. Например, нейрональный промоутер может быть использован для манипулирования геном-кандидатом только в нейронах, а не в нервных стволовых клетках, таким образом предотвращая нежелательные эффекты на уровне прародителя. Все эти соображения, вместе с контролем времени и целевой области, сделать двойной в утробе электропорации очень универсальный метод для изучения клеточно-клеточных взаимодействий не только внутри коры, но и в других структурах, которые могут быть направлены с помощью этой технологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Кристину Андрес Карбонелл и сотрудников центра по уходу за животными Университета Валенсии за техническую помощь. Мы также хотим поблагодарить Изабель Фариньяс и Сакраменто Р. Феррон за реагенты и обмен их оборудованием с нами. I.M.W финансируется за счет контракта Гарантии Джувениля от Консорциума де Эдуказон де Валенсия (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D финансируется Министерством де Сьенсия, Innovaci'n y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). К.Гиль-Санс имеет Рамон и Каджал Грант (RYC-2015-19058) от испанского Ministerio de Ciencia, Innovaci'n y Universidades (MICINN). Эта работа была профинансирована RYC-2015-19058 и SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102 (2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139 (2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36 (2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29 (2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
