Summary

Цитометрический анализ инфильтрации лимфоцитов в Центральной нервной системе во время экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

Published: November 17, 2020
doi:

Summary

Эта рукопись представляет собой протокол, чтобы вызвать активный экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЭ) у мышей. Метод изоляции и характеристики проникли лимфоцитов в центральной нервной системе (ЦНС) также представлен, чтобы показать, как лимфоциты участвуют в развитии аутоиммунных заболеваний ЦНС.

Abstract

Рассеянный склероз (МС) является аутоиммунным заболеванием центральной нервной системы (ЦНС), вызванным сочетанием факторов окружающей среды и восприимчивого генетического фона. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЭ) является типичной моделью заболевания MS широко используется для исследования патогенеза, в котором Т-лимфоциты, характерные для миелин антигенов инициировать воспалительные реакции в ЦНС. Очень важно оценить, как лимфоциты в ЦНС регулируют развитие болезни. Тем не менее, подход к измерению количества и качества проникли лимфоцитов в ЦНС очень ограничен из-за трудностей в изоляции и обнаружения проникли лимфоцитов из мозга. Эта рукопись представляет собой протокол для того, что полезно для изоляции, идентификации и характеристики проникли лимфоцитов из ЦНС и будет полезно для нашего понимания того, как лимфоциты участвуют в развитии аутоиммунных заболеваний ЦНС.

Introduction

Как хроническое демиелинизирующей болезни ЦНС, MS затрагивает около 2,5 миллионов человек во всем мире и не хватает лечебноголечения 1. Он также считается аутоиммунным заболеванием, при котором миелин антиген специфических Т-лимфоцитов инициировать воспалительные реакции и привести к демиелинизации и аксональной травмы вЦНС 2. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) широко используется для исследования патогенных механизмов MS как классическая модель аутоиммунных демиелинизации вЦНС 3. Есть два способа индуцировать ЕАЭ: один заключается в том, чтобы индуцировать EAE активно иммунизации животных с компонентами миелина, другой является приемная передача путем передачи энцефалитогенныхТ-клеток в рецептор 2,4,5. Восприимчивость к ЕАЕ различна в различных штаммах животных6. У мышей C57BL/6, миелин олигодендроцит гликопротеин (MOG) 35-55 вызов вызывает монофазное заболевание с обширной демиелинизации и воспаления в ЦНС, который часто используется в экспериментах с генно-целевыхмышей 7.

Генерация миелин-специфических реактивных Т-клеток необходима для возникновения и развития заболевания в ЕАЭ и является иммунологическим признаком как ЕАЕ, так и MS. Активированные аутореактивные Т-лимфоциты пересекают геммозефалический барьер (BBB) в здоровую ЦНС и инициируют болезнь ЕАЭ. Когда MOG 35-55 Ag встречается, эти Т-лимфоциты вызывают воспаление и набор клеток-эффекторов в ЦНС, что приводит к демиелинизации и разрушениюаксона 8,9. В модели EAE, есть достаточно доказательств того, что нейроантиген-специфические CD4И Т-клетки могут инициировать и поддерживать нейровоспламенениеи патологию 3,10. В зависимости от основных производимых цитокинов,CD4 и T лимфоциты были классифицированы на различные подмножества: Th1 (характеризуется производством интерферона-γ), Th2 (характеризуется производством интерлейкина 4) и Th17 (характеризуется производством интерлейкина 17). Считается, что активация клеток Th1 и Th17 способствует индукции, техническому обслуживанию и регуляции воспалительной демиелинизации в ЕАЭ и МС путем секреции эффекторных цитокинов IFN-γ и IL-17, которые способны активировать макрофаги и набирать нейтрофилов ввоспалительные участки для ускорения поражений 11.

Поскольку аутореактивные Т-клетки пересекают BBB в ЦНС и вызывают развитие болезни в MS и EAE, очень важно анализировать Т-клетки в ЦНС. Тем не менее, Есть очень мало установленных протоколов для изоляции лимфоцитов от ЦНС12. Поэтому был разработан метод, оптимизированный для изоляции моноядерных клеток из мозга и анализа Т-лимфоцитов с маркерами CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g и IL-17 для цитометрии потока. Метод использует MOG35-55 адъювант mycobacterium туберкулеза H37 Ra и коклюша токсина рабочего решения (PTX), чтобы вызвать активную модель иммунизации ЕАЭ у мышей. Затем для изоляции моноядерных клеток ЦНС используются методы механического разделения и центрифугации плотности. Наконец, оптимизированная стратегия цитометрии потока используется для идентификации Т-лимфоцитов и подмножества из мозга путем окрашивания нескольких маркеров.

Protocol

Все описанные здесь методы были одобрены комитетом по животным Школы фундаментальных медицинских наук Шанхайского университета Цзяо Тонг. 1. Подготовка материалов Используйте последовательность MEVGWYRSPFSRHLYRNGK MOG35-55 для получения лиофилизированного пептида из коммер?…

Representative Results

После иммунизации мышей C57BL/6, все мыши были взвешены, рассмотрены, и градуированных ежедневно для неврологических признаков. Репрезентативный клинический курс ЕАЭ должен привести к кривой заболевания, представленной на рисунке 2A, и изменению массы тела в мыши, представ…

Discussion

Это исследование представляет собой протокол для индуцирования и мониторинга ЕАЕ с использованием MOG35-55 у мышей C57BL/6, которые считаются типичной нейроиммунологической экспериментальной животной моделью MS. EAE может быть индуцирована с изменением штаммов мышей или типа белка, используе…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая гранта (31570921 к йД, 81571533 lS), Шанхай муниципальной комиссии по здравоохранению и планированию семьи (201540206 до йД), Ruijin больницы Северный научно-исследовательский грант (2017’X01 до йJ).

Materials

Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 eBioscience 56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block BioLegend 101302
APC anti-mouse IFN-g eBioscience 17-7311-82
BD LSRFortessa X-20 BD
Dounce homogenizer Wheaton 353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) eBioscience 00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set eBioscience 88-8824-00
FITC anti-mouse CD3 BioLegend 100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA) Sigma-Aldrich F5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience eBioscience 56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra Difco Laboratories 231141
PE anti-mouse IL-17A eBioscience 12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4 BioLegend 100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400617
Percoll GE 17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b BioLegend 101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400631
pertussis toxin (PTX) Sigma-Aldrich P-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience eBioscience 17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience eBioscience 12-4321-80
Rat MOG35–55 peptides Biosynth International MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

References

  1. Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
  2. Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
  3. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
  4. Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
  5. Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
  6. Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
  7. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  8. Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
  9. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
  10. McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
  11. Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
  12. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
  13. Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
  14. Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
  15. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
  16. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).
  17. Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).

Play Video

Cite This Article
Ji, Z., Zhou, C., Niu, H., Wang, J., Shen, L. Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (165), e61050, doi:10.3791/61050 (2020).

View Video