Summary
이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.
Abstract
다발성 경화증 (MS)은 환경 적 요인과 취약한 유전 배경의 조합으로 인한 중추 신경계 (CNS)의 자가 면역 질환입니다. 실험적인 자가면역 뇌척수염(EAE)은 MYelin 항원특이적 T 림프구가 CNS에서 염증 반응을 개시하는 병원발생을 조사하는 데 널리 사용되는 MS의 전형적인 질병 모델이다. CNS의 림프구가 질병의 발달을 어떻게 조절하는지 평가하는 것이 매우 중요합니다. 그러나, CNS에서 침투된 림프구의 양과 품질을 측정하는 접근법은 뇌에서 침투된 림프구를 분리하고 검출하는 데 어려움이 있기 때문에 매우 제한적이다. 이 원고는 CNS에서 침투된 림프구의 격리, 식별 및 특성화에 유용하며 림프구가 CNS 자가 면역 질환의 개발에 어떻게 관여하는지에 대한 우리의 이해에 도움이 될 것입니다.
Introduction
CNS의 만성 탈근질환으로서 MS는 전 세계적으로 약 250만 명에게 영향을 미치고 치료 치료1이부족하다. 또한 골수린 항원 특이적 T 림프구가 염증 반응을 시작하고 CNS2에서탈량 및 축산 손상을 유도하는 자가 면역 질환으로 간주됩니다. 실험적인 자가면역 뇌척수염(EAE)은 CNS3에서고전적인 자가면역 탈생 질환 모델로서 MS의 병원성 메커니즘을 조사하는 데 널리 사용되고 있다. EAE를 유도하는 방법에는 두 가지가 있습니다: 하나는 골린 성분으로 동물을 예방 접종함으로써 EAE를 적극적으로 유도하는 것입니다, 또 다른 하나는 뇌성 T 세포를 수용체2,,4,,5로이송하여 입양 전달이다. EAE에 대한 감수성은 다른 동물 균주6에서다릅니다. C57BL/6 마우스에서, myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG) 35-55 도전은 유전자 표적 마우스를 가진 실험에서 빈번하게 이용되는 CNS에 있는 광대한 탈근 및 염증을 가진 단면질환을 유도합니다7.
골린 특이적 반응성 T 세포의 생성은 EAE에서 질병의 발생 및 발달에 필요하며 EAE와 MS. 활성화 된 자동 반응성 T 림프구가 건강한 CNS로 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 교차하고 EAE 질병을 개시하는 면역 징후입니다. MOG 35-55 Ag가 발생하면, 이러한 T 림프구는 염증과 이펙터 세포의 모집을 CNS로 유도하여 탈근및 축축 파괴8,,9의결과이다. EAE 모델에서는 신경항원 특이적CD4+ T 세포가 신경염증 및 병리학3,,10을시작하고 유지할 수 있다는 충분한 증거가 있다. 생산된 주요 사이토카인에 따라 CD4+ T 림프구는 다른 하위 집합으로 분류되었습니다: Th1 (인터페론 γ 생산 특징), Th2 (인터류킨 4의 생산 특징), Th17 (인터류킨 17의 생산에 의해 특징). Th1 과 Th17 세포의 활성화는 대식세포 활성화 및 염증 부위에 호중구를 모집할 수 있는 이펙터 사이토카인 IFN-γ 및 IL-17을 분비함으로써 EAE 및 MS의 염증성 탈생의 유도,11유지 및 조절에 기여하는 것으로 여겨진다.
자동 반응성 T 세포가 CBB를 CNS로 교차하고 MS 및 EAE에서 질병의 발달을 유도하기 때문에 CNS에서 T 세포를 분석하는 것이 매우 중요합니다. 그러나, CNS12로부터림프구의 분리를 위한 확립된 프로토콜은 거의 없다. 따라서, 뇌로부터 단핵세포를 분리하고 마커 CD45, CD3, CD4, INF-g 및 IL-17을 사용하여 뇌로부터 단핵세포를 분리하고 T 림프구를 분석하는 데 최적화된 방법이 개발되었다. 이 방법은 MOG35-55 보조 균 결핵 H37 라와 백혈구 독소 작업 용액 (PTX)을 사용하여 마우스에서 EAE의 활성 예방 접종 모델을 유도합니다. 이어서, 기계적 분리 및 밀도 그라데이션 원심분리 방법은 CNS 단핵세포의 분리를 위해 사용된다. 마지막으로, 최적화된 유동 세포측정 게이팅 전략은 여러 마커를 염색하여 뇌에서 T 림프구와 하위 집합을 식별하는 데 사용됩니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 상하이 자오퉁 대학교 기초의학대학의 동물위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 재료의 준비
- MOG35-55의 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK 서열을 사용하여 상업적 인 공급원으로부터 리오필화 펩티드를 얻습니다. 펩티드의 순도가 >95%인지 확인합니다. 인산염 완충식식염(PBS)에 10 mg/mL MOG 스톡 용액을 준비하고 -20°C에 보관하십시오.
- M. 결핵 H37 Ra의 4 mg/mL 스톡 솔루션을 완전 프룬트(CFA)의 25mL에 M. 결핵 H37 Ra 100 mg 튜브를 넣고 믹싱을 준비합니다. 재고 용액을 -20 °C에 보관하십시오.
- PBS의 50mL에 PTX의 50 μg를 추가하여 1 ng/μL 백합 소독 작업 솔루션(PTX)을 준비하십시오. 작업 용액을 -20°C에 저장합니다.
- 모든 항체(즉, FITC 항마우스 CD3, PE/Cy7 항마우스 CD4, PerCP/Cy5.5 항마우스 CD11b, 알렉사 플루오르700 항마우스 CD45.2, PE 항마우스 IL-17A 및 APC 항마우스 IFN-γ)를 저장합니다.
- PBS의 500mL에 2mM 에틸렌 디아민 테트라아세틱산(EDTA)과 1% 태아 소 혈청(FBS)을 추가하여 유동 세포체 염색(FCS) 버퍼를 만드십시오.
2. C57BL/6 마우스의 하우징
- 8-12주에 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하십시오.
- C57BL/6J 마우스를 주입하기 7일 전에 적어도 반케.
- 12h 빛/암흑 주기에서 일정한 온도와 습도에서 병원체가 없는 조건하에서 동물 시설에 마우스를 보관하고 물과 표준 펠릿 식품에 무료로 접근할 수 있습니다.
3. C57BL/6 마우스의 예방 접종
- 모든 스톡 솔루션을 실온(RT)에서 15분 동안 그대로 두어 완전한 재수화를 보장합니다.
- 3 mg /mL 작업 용액을 준비하기 위해 PBS70μL로 MOG 펩티드 스톡 용액 300 μL을 희석하십시오.
- M. 결핵 H37 Ra 스톡 용액 1mL과 MOG35-55 펩타이드 작동 용액을 별도의 10mL 주사기에 넣은 다음 4방향 스톱 콕을 사용하여 최소 10분 동안 유화합니다. 주입 전에 완전한 유화를 보장합니다.
- 1% 나트륨 펜토바르비탈 (50 mg/kg)의 관전 주사와 EAE의 절정에 마우스를 마취.
- 1mL 주사기를 사용하면 목 근처의 뒤쪽에 있는 두 부위에 MOG 35-55/CFA 에멀젼(300 μg/200 μL)의 100 μL을 가진 마우스를 피하시 주사합니다. PBS의 200 μL을 가진 피하 로 제어 마우스를 피하.
- 같은 날(0일)과 2일째 예방접종(PI)에 1 ng/μL PTX 작업 용액의 200μL을 가진 마우스를 내분한다. PBS의 200 μL을 가진 관면 마우스를 내성으로 주입합니다.
- 온난 패드와 함께 자신의 홈 케이지에 마우스를 전송합니다.
- 표 111,,13에표시된 신경 학적 징후를 맹목적으로 Table 1주사 후 매일 모든 마우스를 검사하고 채점한다. 점수가 4 학년보다 더 나쁜 경우 동물을 안락사.
- 질병 과정 동안 체중 변화를 기록합니다. 이는 EAE모델(11)및13에서의질병 활성에 대한 귀중한 추가 척도이다.
- 개별 마우스에 대한 임상 징후의 첫 날을 추가하고 그룹에서 마우스의 수로 분할; 결과가 시작됩니다. 개별 마우스에 대한 최대 EAE 점수의 첫 날을 추가하고 그룹에서 마우스의 수로 분할; 결과가 최고입니다.
4. 뇌에서 단세포 서스펜션 준비
- 15mL 원물 튜브에서 PBS를 사용하여 9:1 비율로 밀도 그라데이션 배지를 희석하여 최종 100% 용액을 산출합니다.
- 1% 나트륨 펜토바르비탈 (50 mg/kg)의 관전 주사와 EAE의 절정에 마우스를 마취하고 멸균 얼음 감기 PBS의 20 mL와 내막 내 perfuse. 20mL 주사기를 사용하여 심장의 왼쪽 심실에 PBS를 천천히 꾸준히 주입하고 오른쪽 아트리움을 열어 이를 달성하십시오.
- 코에서 목까지 두개골을 조심스럽게 자른 다음 두개골 상자에서 뇌를 50 mL 원문 튜브에서 RPMI10 mL로 제거합니다. 잘 섞어서 참혈세포를 제거합니다. 그런 다음 포부로 매체를 제거하고 RPMI10 mL을 추가합니다.
- 뇌와 중간을 100mm 접시에 놓습니다. 면도날로 잘게 자릅니다.
- 접시에서 깨끗한 파이펫으로 얼음처럼 차가운 7mL 소결 유리 균질화로 6mL를 옮긴다. 파이펫에 많은 양의 조직을 두지 마십시오. 소량은 피할 수 없습니다.
- 먼저 유봉의 "느슨한"플런저를 사용하여 뇌를 갈아, 다음 서스펜션이 균일 할 때까지 "꽉"플런저를 사용하고, 미리 냉각 된 15 mL 원추형 튜브에 부어 얼음에 유지.
- 모든 샘플이 균질화된 후 볼륨을 추정합니다. RPMI로 볼륨을 7mL로 조정합니다. 그런 다음 차가운 15mL 원심분리기 튜브에 얼음-차가운 100% 지하 멤브레인 매트릭스 3mL을 넣고 최종 30% 밀도 그라데이션 배지를 산출하기 위해 뇌 의 7mL을 첨가한다. 반전으로 몇 번 섞으세요. 소용돌이하지 마십시오.
- 선명한 인터페이스를 보장하기 위해 3mL 파이펫으로 RPMI에 70% 언더레이 밀도 그라데이션 배지의 1mL을 신중하고 천천히 추가합니다.
- 원심분리기 800 x g에서 4°C에서 20분 만드실 수 있습니다. 가속을 1로 설정하고 감속을 0으로 설정합니다. 원심 분리 후, 거의 모든 상부 단계를 흡인하고, 상단의 골린을 완전히 제거하는주의(도 1).
- 새로운 15원심분리기 튜브로 인터페이스를 제거합니다. RPMI로 볼륨을 10mL로 조정합니다.
- 원심 분리기 500 x g에서 10 분 동안. 원심 분리 후, 상퍼를 흡인. 펠릿을 ~200μL의 유동 세포피성 스테인딩(FSC) 버퍼로 재연한다. 그런 다음 펠릿은 FACS에 얼룩이 될 준비가 되어 있습니다.
5. 뇌에서 단일 세포의 흐름 세포 측정 분석
- 세포를 계산하기 위하여 혈전계 및 현미경을 사용합니다. 세포의 10 μL을 트라이판 블루10 μL에 넣고 잘 섞은 다음 혈류계에 10 μL을 배치하여 셀을 계산합니다. 그런 다음 반전된 현미경(예: 올림푸스 반전 현미경)에서 마이크로리터당 살아있는 세포의 수를 계산합니다.
- Aliquot 약 2 x 106 6 RPMI에 있는 세포의 단일 우물으로 96 웰 플레이트.
- 500x 세포 자극 칵테일과 단백질 수송 억제제를 우물에 추가합니다.
- 인큐베이터에서 플레이트를 37°C에서 4시간 동안 배양한다.
- RT에서 5 분 동안 400 x g의 세포를 원심 분리하고 FCS 버퍼의 100 μL에서 셀을 다시 중단하십시오.
- 비특이적 Fc 중재 상호 작용을 차단하기 위해 염색하기 전에 4°C에서 10분 동안 항마우스 CD16/CD32 Fc 블록(1:33)으로 세포를 미리 배양한다.
- 세탁하지 않고 얼룩 세포 표면 마커. 항마우스 CD45.2(1:200), 항마우스 CD11b(1:200), 항마우스 CD3(1:200), 항마우스 CD4(1:200) 항체를 추가한다.
참고: 양수 및 음의 문을 결정하기 위해 각 색상에 대해 형광이 하나(FMO)를 뺀 값과 동형 조절 항체를 염색해야 합니다. - 4°C 또는 얼음에서 적어도 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
- FCS 버퍼를 추가하여 셀을 세척합니다. 마이크로티터 플레이트에 200 μL/웰을 사용하십시오. RT에서 5 분 동안 400 x g의 원심 분리기는 상체를 폐기하십시오.
- 세포를 고정하기 위해 각 웰에 세포 내(IC) 고정 버퍼200 μL을 추가합니다. 용액에서 셀이 완전히 다시 중단되었는지 확인합니다.
- RT에서 30-60 분 동안 배양하십시오.
- 원심 분리는 5 분 동안 RT에서 400 x g에서 샘플을 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
- 각 웰에 1배 투과화 버퍼200 μL을 추가하고 5분 동안 RT에서 400 x g의 샘플을 원심분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
- 잔류 부피로 펠릿을 다시 중단하고 1배 의 투과화 버퍼로 약 100 μL로 볼륨을 조절합니다.
- 세포 내 항원 검출을 위해 항마우스 IL-17A(1:200) 및 항마우스 IFN-g(1:200) 항체를 첨가한다.
- 4°C에서 최소 30분 동안 배양합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
- 각 웰에 1x permeabilization 버퍼의 100 μL을 추가하고 5 분 동안 RT에서 400 x g에서 샘플을 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
- 스테인드 셀을 100μL의 유동 세포분석 염색 버퍼로 재보종한다.
- 유동 세포측정에 의해 분석합니다.
참고: 유량 사이토미터의 레이저 및 보상 설정이 조정되고, 샘플은 사이토미터에 배치되며, 모든 이벤트는 제조업체의 권장 사항에 따라 기록됩니다.
6. 데이터 분석
- FSC-A 대 FSC-H 및 SSC-A 대 SSC-H를 사용하는 게이트 싱글트.
- 크기에 따라 FSC-A 및 SSC-A를 사용하여 게이트 라이브 셀.
- 다음으로, 단핵구를 제외한 백혈구를 CD45+ CD11b- 세포에- 게이팅하여 식별한다.
- 그런 다음 CD3+CD4+ 세포에서 게이팅하여 CD4 T 림프구를 식별합니다.
- 마지막으로, IFN-γ+ 세포 및 IL-17+ 세포에 별도로 게이팅하여 Th1 및 Th17 하위 집합을 식별하고, 동형 대조군 및 FMO를 사용하여 양성 및 음수 집단을 결정한다.
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Representative Results
C57BL/6 마우스의 예방 접종 후, 모든 마우스는 신경 징후를 위해 매일 계량, 검사 및 등급이 매겨졌습니다. EAE의 대표적인 임상 과정은 도 2B에제시된 바와 같이 도 2A에 제시된 질병 곡선과 마우스내 체중의 변화를 초래한다. MOG35-55로 예방접종된 C57BL/6 마우스는 보통 10~12일 경에 질병 증상을 일으키기 시작했고, 활성 예방접종 후 15~21일 경에 질병의 피크를 달성하였다(그림2A). 체중 변화는 EAE 모델에서 귀중한 지표였습니다. 질병의 개시 의 앞에, 면역한 마우스의 체중은 점차적으로 증가한 다음, 전형적으로 증가하는 질병 현상에 상관관계를 감소시켰습니다. EAE의 절정에, 마우스는 또한 가장 낮은 체중을 보였다(그림 2B). 그런 다음 임상 증상이 감소함에 따라 체중이 약간 회복되었습니다. 그러나, 마우스는 일반적으로 완전히 복구되지 않았다. C57BL/6 마우스는 MOG35-55 챌린지(그림2A)에따라 단면 만성 질환 병리학을 개발하였다.
EAE의 임상 적중증은 자가 반응성 T 세포활성화(14)와직접 연관된다. 신경항성CD4+ T 세포는 EAE3에서신경염증 및 병리학을 시작하고 유지할 수 있다. EAE의 피크에 있는 CD4+T 세포의 전형적인 특성은 도 3에도시된다. 또한, EAE를 중재하는 주요 병원성 세포인 뇌성 세포에서 Th1 및 Th17 하위 집합의 비율을 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 뇌로부터 단일 세포 현탁액의 분리에 따라, 세포는 T 림프구에 의해 발현되는 CD45, CD11b, CD3, CD4, IFN-γ 및 IL-17 항체로 염색되었다. FSC-A 대 FSC-H 및 SSC-H 대 SSC-H는 싱글트(그림3A, B),다음 FSC-A 대 SSC-A가 크기와 세분성에 따라 라이브 셀을 게이트하는 데사용되었다(그림 3C). 후, CD45+ CD11b- 세포는 단세포(도3D)를제외한 백혈구를 식별하기 위해 문이 있었다.- 이어서, 게이트는 CD3+CD4++에 설정되어 CD4+ T 림프구(그림3E)를식별하였다. 마지막으로, IFN-γ 및 IL-17은 Th1 및 Th17 서브세트를 식별하고 이펙터 사이토카인(그림3F)에따른 기능적 효과를 평가하는 데 사용되었다. 질병의 임상 적 중증도에 따르면, 대표적인 결과는 IfN-γ-생산 Th1 및 IL-17-Th17 세포EAE 마우스에서 뇌성 세포에서 크게 증가 하는 것으로 나타났다.
| 학년 | 임상 기호 |
| 0 | 질병 없음 |
| 1 | 감소 된 꼬리 톤 또는 약간 서투른 걸음걸이 |
| 2 | 꼬리 아토니와 적당히 서투른 걸음걸이 및 / 또는 가난한 권리 능력 |
| 3 | 사지 약점 |
| 4 | 사지 마비 |
| 5 | 모리번드 상태. |
표 1: 임상 점수 매기기 시스템. C57BL/6 마우스는 MOG35-55 펩티드로 면역되었다. 그런 다음 신경 학적 징후가 기록되었습니다. 5점 득점 시스템은 EAE의 심각도를 평가하는 데 사용되었습니다.
그림 1: 단일 핵 세포의 분리를 위한 퍼콜링 그라데이션 설정의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: EAE의 대표 코스. EAE는 프로토콜에 기재된 MOG35-55의 주사에 의해 C57BL/6 마우스에서 유도되었다. 임상점수(A)와체중의변화(B)는이들 마우스에서 결정되었다. 데이터는 SEM에 ± 의미로 표시됩니다. n = 각 그룹에 대해 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 뇌의 림프구의 대표적인 유동 세포분석. 단일 세포 현탁액은 EAE의 피크에 있는 두뇌에서 격리되었습니다. T 림프구의 게이팅 전략이 표시됩니다. 싱글트는 FSC-A 대 FSC-H 와 SSC-A 대 SSC-H(A,B)로문이 되었습니다. 살아있는 세포는 FSC-A 대 SSC-A(C)로문이 되었습니다. 단세포구를 제외한 백혈구는 CD45+ CD11b- (D)로문이 있었다. CD4+ T 림프구는 CD3+CD4+ (E)로문이 되었습니다. Th1 및 Th17 하위 집합은 IFN-γ+ 및 IL-17+ (F)로게이트되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 연구는 C57BL/6 마우스에서 MOG35-55를 사용하여 EAE를 유도하고 모니터링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 EAE MS의 전형적인 신경면역 실험 동물 모델로 간주되는 것으로 간주되어 연구의 목적에 따라 유도에 사용되는 마우스 균주 또는 단백질의 종류를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, SJL 마우스에서 PLP139-151 펩티드를 사용하면 재발에 대한 치료 효과를 평가하기에 특히 적합한 재발-방출 EAE 질병 과정을 유도할 수있다. 여기에 설명된 실험 절차는 다른 EAE 프로토콜7에도적용할 수 있습니다. 이 모델에서, C57BL/6 마우스는 MOG35-55 펩티드로 면역화되고 단면질환을 개발한다. 5점 득점 시스템은 EAE의 심각도를 평가하는 데 사용됩니다. 0-3점 또는 0-10점에 이르는 여러 득점 시스템이 질병 심각도7,,16,,17점을획득하기 위해 사용되지만, 이러한 결과는 5점 득점 시스템이 그룹과 다른 EAE 득점 시스템 간의 질병 점수에서 통계적으로 유의한 차이를 결정할 수 있음을 보여 주지만 명백한 개선으로 이어지지는 않습니다.
EAE 중증도는 일반적으로 신경 기능 장애의 중증도를 고려하여 EAE 임상 점수에 의해 평가된다11,,13. 모든 마우스에 대한 실험의 유사성을 보장하기 위해 케이지의 변화, 음식과 물 관리, 특히 마우스 하우징 조건을 포함하여 동일한 조건하에서 이를 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 교차 예방 접종은 또한 조사자에 의해 유도된 케이지 특정 현상을 피하기 위하여 수행되어야 합니다.
본 연구는 FACS 분석 또는 기능 연구에 적합한 CNS로부터 단핵 세포를 분리하는 방법을 제공한다. 혈액이 CNS 조직에서 제거되도록 하기 위해, 마우스는 조직을 해리하기 전에 퍼펫되어야 합니다. 밀도 그라데이션 원심분리에 대한 단일핵 세포의 정제는 격리의 핵심 단계이다. 분리 효과를 보장하기 위해 원심분리기의 가속 및 감속을 각각 1과 0으로 설정해야 합니다. 이 방법을 사용하여 단일 세포 수율은 일반적으로 정상적인 뇌에서 낮지만 EAE를 가진 병들인 뇌에서 더 높습니다. 대표적인 결과는 CD3+CD4+ T 림프구, 특히 IFN-γ 생산 세포 및 IL-17 생성 세포가 눈에 띄는 증가가 있음을 보여 주며, 이는 악화된 질병에 기여하는 것으로 여겨진다.
이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. MOG35-55로 유도된 EAE 모델은 주로 CD4+ T 세포 구동 면역 반응을 나타낸다. CD8+ T 셀 및 B 셀의 역할을 분석해야 하는 경우 대체 프로토콜을 고려해야 합니다. CNS 염증성 질환으로서, 심한 병리학적 표현형은 또한 EAE 모형에 있는 척수에서 있습니다. 그러나, myelin의 다량의 존재 때문에, FACS 분석을 위한 척수에서 충분한 단하나 세포를 얻는 것은 어렵습니다. 이 경우, 척수 조직을 분석하기 위해 면역 조직 화학 또는 면역 형광을 사용하는 것이 필요하다. 또한 FACS 분석을 위한 단핵세포를 분리하기 위해 뇌와 척수를 한데 모은 연구자들이있다 12. 이 프로토콜은 면역 조직 화학 및 면역 형광 분석을 위한 FACS 분석 및 척수 조직을 위한 두뇌에서 단 하나 세포를 분리합니다.
MS와 EAE의 면역 조절에서 T 림프구의 중요성은 최근 점점 더 많은 관심을 받고 있다. 출판 된 문학의 대부분은 비장과 림프절11에초점을 맞추고; 그러나, 림프구는 EAE 마우스의 CNS 를 통해 발견되며, 따라서, CNS에서 T 림프구의 특성 분석이 필요하다. 섹션의 면역 조직학적 염색은 CNS에서 침투 세포를 식별할 수 있습니다. 그러나, 현상 및 기능 분석은 제한됩니다. 정상 또는 병든 마우스의 CNS에서 면역 세포의 격리에 따라, 더 상세한 표현형의 분석이 가능하게 된다. 이 방법을 통해 뇌의 T 림프구는 세포별로 연구될 수 있으며, 상이한 표면 마커, 사이토카인, 케모킨 및 전사 인자(예를 들어, 세포내 단백질)의 발현을 더 잘 분석할 수 있다. 이 프로토콜은 MS 및 EAE 과정에서 뇌의 T 림프구의 표현형 과 기능을 평가하는 향후 연구에 유용할 것입니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연과학 재단(31570921 ~ZJ, 81571533 ~ LS), 상하이 시 보건위원회 및 가족 계획 (201540206 ~ ZJ), 루이진 병원 노스 연구 보조금 (2017ZX01 )
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
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