Summary
Bu el yazması farelerde aktif deneysel deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indüklemek için bir protokol sunar. Merkezi sinir sisteminde (CNS) infiltrasyon lenfositlerin izolasyon ve karakterizasyonu için bir yöntem de lenfositler CNS otoimmün hastalığın gelişiminde nasıl rol olduğunu göstermek için sunulmaktadır.
Abstract
Multipl skleroz (MS), çevresel faktörler ve duyarlı genetik arka planın birleşimi ile oluşan merkezi sinir sisteminin (CNS) otoimmün bir hastalığıdır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), Miyelin antijenlerine özgü T lenfositlerinin CNS'de inflamatuar reaksiyon başlattığı patogenezi araştırmak için yaygın olarak kullanılan tipik bir MS hastalığı modelidir. CNS lenfositler hastalığın gelişimini nasıl düzenleyen değerlendirmek için çok önemlidir. Ancak, CNS'de infiltrasyonlu lenfositlerin miktarını ve kalitesini ölçme yaklaşımı, beyinden sızmış lenfositlerin izole edilmesi ve saptanmasındaki güçlükler nedeniyle çok sınırlıdır. Bu el yazması, CNS'den infiltrasyona geçen lenfositlerin izolasyonu, tanımlanması ve karakterizasyonu için yararlı olan bir protokol sunar ve lenfositlerin CNS otoimmün hastalığının gelişiminde nasıl rol aldığını anlamamıza yardımcı olacaktır.
Introduction
CNS kronik bir demiyelinating hastalık olarak, MS dünya çapında yaklaşık 2,5 milyon kişi etkiler ve küratif tedavileryoksun 1. Ayrıca bir otoimmün hastalık olarak kabul edilir, hangi miyelin antijen spesifik T lenfositler inflamatuar bir reaksiyon başlatmak ve CNS demiyelinasyon ve aksonal yaralanmaya yol2. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) yaygın CNS bir klasik otoimmün demiyelinasyon hastalığı modeli olarak MS patojenik mekanizmaları araştırmak için kullanılmıştır3. EAE ikna etmek için iki yolu vardır: bir miyelin bileşenleri ile hayvanlar aşılayarak aktif EAE ikna etmektir, başka reseptöriçineensefalojenik T hücreleri aktararak benimseyen transfer 2,4,5. EAE duyarlılıkları farklı hayvan suşları farklıdır6. C57BL/6 farelerinde, myelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG) 35-55 sorun cns geniş demiyelinasyon ve inflamasyon ile monophasik bir hastalığa neden olur, sık sık gen hedefli fareler ile deneylerde kullanılan7.
EAE'de hastalığın oluşumu ve gelişimi için miyelinspesifik reaktif T hücrelerinin üretimi gereklidir ve hem EAE hem de MS. Aktif otoreaktif T lenfositlerinin sağlıklı CNS'ye kan beyin bariyerini (BBB) geçmelerinin ve EAE hastalığının başlatılmasının immünolojik bir işaretidir. MOG 35-55 Ag karşılaştığında, Bu T lenfositler inflamasyon ve CNS içine efektör hücrelerin işe neden, demiyelinasyon ve akson yıkımı ile sonuçlanan8,9. EAE modelinde, nöroantijene özgü CD4+ T hücrelerinin nöroinflamasyon vepatolojiyibaşlatabildiği ve sürdürebileceğine dair yeterli kanıt vardır 3,10. Üretilen majör sitokinlere bağlı olarak, CD4+ T lenfositler farklı alt kümelere sınıflandırılmıştır: Th1 (interferon-γ üretimi ile karakterize), Th2 (interlökin üretimi ile karakterize 4), ve Th17 (interlökin üretimi ile karakterize 17). Bu Th1 ve Th17 hücrelerinin aktivasyonu indüksiyon katkıda olduğuna inanılmaktadır, bakım, ve EAE ve MS inflamatuar demiyelinasyon düzenlenmesi etki edici sitokinler IFN-γ ve IL-17 salgılayarak, hangi makrofajlar aktive yeteneğine sahip ve lezyonları hızlandırmak için inflamatuar sitelere nötrofiller işe11.
Otoreaktif T hücreleri BBB'yi CNS'ye geçtiği nden ve MS ve EAE'de hastalığın gelişmesine neden olduğundan, CNS'deki T hücrelerini analiz etmek çok önemlidir. Ancak, CNS12lenfositlerin izolasyonu için çok az kurulmuş protokoller vardır. Bu nedenle, beyinden mononükleer hücreleri izole etmek ve t lenfositleri cd45, CD11b, CD3, CD4, INF-g ve IL-17 ile analiz etmek için optimize edilmiş bir yöntem geliştirilmiştir. Yöntem farelerde EAE aktif bir bağışıklama modeli neden MOG35-55 adjuvan Mycobacterium tuberculosis H37 Ra ve Pertussis Toksin Çalışma Solüsyonu (PTX) kullanır. Daha sonra CNS mononükleer hücrelerin izolasyonu için mekanik ayırma ve yoğunluk gradyan santrifüj yöntemleri kullanılır. Son olarak, bir optimize akış sitometri gating stratejisi birden fazla belirteçleri boyama tarafından beyinden T lenfositler ve alt kümeleri tanımlamak için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Temel Tıp Bilimleri Okulu, Şangay Jiao Tong Üniversitesi hayvan komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Malzemelerin hazırlanması
- Ticari kaynaklardan liyofilize peptid elde etmek için MOG35-55'in MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK dizisini kullanın. Peptitin saflığının %gt;%95 olduğundan emin olun. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 10 mg/mL MOG stok çözeltisi hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
- M. tüberküloz H37 Ra'nın 4 mg/mL stok çözeltisini, Tam Freund'un Adjuvan (CFA) 25 mL'ine 100 mg m. tüberküloz H37 Ra tüpü koyarak hazırlayın ve karıştırın. Stok çözeltisini -20 °C'de saklayın.
- 50 mL PBS'ye 50 μg PTX ekleyerek 1 ng/μL Pertussis Toxin Çalışma Solüsyonu (PTX) hazırlayın. Çalışma çözeltisini -20 °C'de saklayın.
- Tüm antikorları (yani FITC anti-mouse CD3, PE/Cy7 anti-mouse CD4, PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b, Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2, PE anti-mouse IL-17A ve APC anti-mouse IFN-γ) 4 °C'de saklayın.
- 500 mL PBS içine 2 mM etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) ve %1 fetal sığır serumu (FBS) ekleyerek Akış Sitometri Boyama (FCS) Tamponu yapın.
2. C57BL/6 farelerinin gövdesi
- 8-12 haftalık kendişi C57BL/6 farelerini kullanın.
- Acclimate C57BL/6J fareler enjeksiyondan en az 7 gün önce.
- Ev fareleri, 12 saatlik ışık/karanlık döngüsünde sabit sıcaklık ve nemde patojensiz koşullar altında bir hayvan tesisinde bulunan farelere ve su ve standart pelet gıdalarına ücretsiz erişim sağlar.
3. C57BL/6 fare bağışıklama
- Tam rehidrasyon sağlamak için oda sıcaklığında (RT) 15 dakika tüm stok çözümleri bırakın.
- 3 mg/mL çalışma çözeltisi hazırlamak için 700 μL PBS ile 300 μL MOG-peptid stok çözeltisini seyreltin.
- M. tüberküloz H37 Ra stok çözeltisi 1 mL ve ayrı 10 mL şırınga içine MOG35-55 peptidler çalışma solüsyonu 1 mL koyun, sonra en az 10 dakika emülsifiye etmek için dört yönlü bir stop horoz kullanın. Enjeksiyondan önce tam emülsifikasyon sağlamak.
- %1 sodyum pentobarbital (50 mg/kg) intraperitonial enjeksiyon ile EAE zirvesinde fareleranestezi.
- 1 mL şırınga ile farelere her ikisi de boyuna yakın iki noktada 100 μL MOG 35-55/CFA emülsiyon (300 μg/200 μL) enjekte edin. Deri altı enjekte kontrol fareleri 200 μL PBS ile.
- Aynı gün (gün 0) ve 2. İntraperitoneally 200 μL PBS ile kontrol farelerenjekte.
- Bir ısınma pedi ile kendi kafese fareler aktarın.
- Tablo 111,13'tegösterilen nörolojik bulgular Table 1için enjeksiyondan sonra her gün tüm fareleri kör bir şekilde inceleyin ve derecelendirin. Eğer skorlar 4.
- Hastalık sırasında kilo değişikliklerini kaydedin. Bu EAE modelinde hastalık aktivitesi için değerli bir ek önlemdir11,13.
- Bireysel fareler için klinik işaretlerin ilk gününü ekleyin ve gruptaki fare sayısına bölün; sonuç başlangıcıdır. Tek tek fareler için maksimum EAE puanının ilk gününü ekleyin ve gruptaki fare sayısına bölün; sonuç zirvedir.
4. Beyinden tek hücreli süspansiyon hazırlığı
- Son %100 çözeltiyi elde etmek için 15 mL konik tüpte PBS ile 9:1 oranında seyreltilmiş yoğunluk gradyan ortamı.
- %1 sodyum pentobarbital (50 mg/kg) intraperitonial enjeksiyonla EAE zirvesindeki fareleri anestezik ve 20 mL steril buz gibi PBS ile intrakardiyal perfüzyon. Bunu, 20 mL şırınga kullanarak kalbin sol ventrikülüne pbs enjekte ederek ve sağ atriyumu açarak bunu başarır.
- Kafatasını burundan boyuna kadar dikkatlice kesin, sonra kafatası kutusundan beyni 50 mL konik tüplerde 10 mL RPMI'ye çıkarın. Yapışık kırmızı kan hücrelerini temizlemek için iyice karıştırın. Daha sonra aspirasyon ile orta çıkarın ve RPMI 10 mL ekleyin.
- 100 mm çanak içinde beyin ve orta yerleştirin. Jiletle ince ince doğrayın.
- Çanaktan 6 mL'lik buz gibi 7 mL sinterlenmiş cam homogenizer temiz pipetle aktarın. Pipette büyük miktarda doku bırakmaktan kaçının. Küçük bir miktar kaçınılmazdır.
- Önce havaneli "gevşek" piston kullanarak beyin Grind, sonra süspansiyon homojen olana kadar "sıkı" piston kullanın, ve önceden iliştirilmiş 15 mL konik tüp içine dökün ve buz üzerinde tutmak.
- Tüm örnekler homojenize edildikten sonra, hacmi tahmin edin. RPMI ile ses seviyesini 7 mL'ye ayarlayın. Daha sonra soğutulmuş 15 mL konik santrifüj tüpüne 3 mL buz gibi %100 bazal bazal membran matrisyerleştirin ve son %30 yoğunluk gradyan ortamı nı sağlamak için beynin homojen 7 mL'sini ekleyin. Birkaç kez ters tarafından karıştırın. Girdap etmeyin.
- Keskin bir arayüz sağlamak için, RPMI'ye 3 mL pipetle 1 mL ve yavaş yavaş %70 altkat yoğunluk gradyan ortam ekleyin.
- Santrifüj 800 x g'de 4 °C'de sadece 20 dk. Ivmeyi 1'e, yavaşlamayı 0'a ayarlayın. Santrifüjden sonra, üst fazın hemen hemen tümünü aspire etmek, üstteki miyelini tamamen çıkarmaya dikkat etmektir (Şekil 1).
- Arayüzü yeni bir 15 santrifüj tüpe çıkarın. RPMI ile ses seviyesini 10 mL'ye ayarlayın.
- 10 dk için 500 x g santrifüj. Santrifüjden sonra, supernatant aspire. ~200 μL akış sitometri boyama (FSC) tamponundaki peleti yeniden askıya alın. Peletler daha sonra FACS için leke hazırdır.
5. Beyinden tek hücrelerin akış sitometrik analizi
- Hücreleri saymak için bir hemositometre ve mikroskop kullanın. 10 μL'lik trypan mavisine 10 μL'lik hücreleri ekleyin, iyice karıştırın ve hücreleri saymak için bir hemositometreye 10 μL yerleştirin. Daha sonra ters mikroskop altında mikrolitre başına canlı hücre sayısını hesaplayın (örneğin, Olympus Ters mikroskop).
- Aliquot yaklaşık 2 x 106 RPMI hücrelerinin tek bir kuyu içine 96 kuyu plaka.
- Kuyulara 500x hücre stimülasyon kokteyli artı protein taşıma inhibitörleri ekleyin.
- Plakayı kuluçka makinesinde 37 °C'de 4 saat kuluçkaya yatırın.
- Rt 5 dakika için 400 x g hücreleri santrifüj. Supernatant atın ve FCS Tampon 100 μL hücreleri yeniden askıya.
- Anti-mouse CD16/CD32 Fc blok (1:33) ile hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca öninkitleyerek nonspesifik Fc aracılı etkileşimleri engelleyin.
- Hücre yüzey ilerleçlerini yıkamadan lekeleyin. Anti-fare CD45.2 (01:200), anti-mouse CD11b (1:200), anti-mouse CD3 (1:200) ve anti-mouse CD4 (1:200) antikorları ekleyin.
NOT: Pozitif ve negatif kapıları belirlemek için her renk için bir floresan eksi (FMO) ve bir iyotip kontrol antikor lekeli olmalıdır. - Plakayı 4 °C'de veya buzüzerinde en az 30 dakika kuluçkaya yatırın. Işıktan koruyun.
- FCS Arabellek ekleyerek hücreleri yıkayın. Mikrotiter plakalar için 200 μL/iyi kullanın. Sentrifuge 400 x g 5 dk RT. Supernatant atın.
- Hücreleri düzeltmek için her kuyuya 200 μL hücre içi (IC) fiksasyon tamponu ekleyin. Hücrelerin çözeltide tamamen askıya alındığından emin olun.
- RT'de 30-60 dk inkübat.
- Numuneleri RT'de 400 x g'da 5 dk santrifüj edin. Supernatant atın.
- Her kuyuya 200°L 1x permeabilizasyon tamponu ekleyin ve numuneleri 400 x g'de RT'de 5 dakika santrifüj edin. Supernatant atın.
- Artık hacimdeki peleti yeniden askıya alın ve 1x permeabilizasyon tamponu ile hacmi yaklaşık 100°L'ye ayarlayın.
- Hücrelere hücre içi antijenlerin saptanması için fare içi IL-17A (1:200) ve fare karşıtı IFN-g (1:200) antikorları ekleyin.
- 4 °C'de en az 30 dakika kuluçkaya yatırın. Işıktan koruyun.
- Her kuyuya 100°L 1x permeabilizasyon tamponu ekleyin ve numuneleri 400 x g'de RT'de 5 dakika santrifüj edin. Supernatant atın.
- 100 μL akış sitometri boyama tamponunda lekeli hücreleri yeniden askıya alın.
- Akış sitometrisi ile analiz edin.
NOT: Akış sitometresindeki lazer ve kompanzasyon ayarları ayarlanır, numuneler sitometreye yerleştirilir ve tüm olaylar üreticinin önerilerine göre kaydedilir.
6. Veri analizi
- FSC-A vs FSC-H ve SSC-A vs SSC-H kullanarak kapı singlets.
- Canlı hücreleri boyuta göre FSC-A ve SSC-A kullanarak geçirin.
- Daha sonra, cd45+ CD11b - hücrelere gating tarafından, monositler- hariç, lökositler tanımlayın.
- Daha sonra CD3+CD4+ hücrelerine bakarak CD4 T lenfositlerini tanımlayın.
- Son olarak, IFN-γ+ hücreleri ve IL-17+ hücrelerini ayrı ayrı inceleyerek Th1 ve Th17 alt kümelerini tanımlayın ve izotip kontrolleri ve FMO kullanarak pozitif ve negatif popülasyonları belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C57BL/6 farelerinin bağışıklaştırılmasından sonra tüm fareler nörolojik bulgular için tartıldı, incelendi ve günlük olarak derecelendi. EAE'nin temsili klinik seyri Şekil 2A'da sunulduğu gibi bir hastalık eğrisi ve Şekil 2B'desunulduğu gibi farede vücut ağırlığının değişmesiile sonuçlanmalıdır. MOG35-55 ile aşılanmış C57BL/6 fareler genellikle 10-12.Figure 2A Ağırlık değişimi EAE modelinde değerli bir göstergeydi. Hastalığın başlangıcından önce, bağışıklık farelerin vücut ağırlığı yavaş yavaş arttı, daha sonra genellikle artan hastalık belirtileri ile ilişkili azaldı. EAE zirvesinde, fareler de en düşük vücut ağırlığı gösterdi(Şekil 2B). Klinik semptomlar azaldıkça vücut ağırlığı hafifçe iyileşti. Ancak, fareler genellikle tam olarak kurtarmak değildi. C57BL/6 farelerde MOG35-55 testi nde monofhasik kronik hastalık patolojisi gelişmiştir (Şekil 2A).
EAE klinik şiddeti doğrudan otoreaktif T hücre aktivasyonu ile ilişkilidir14. Nöroantijene özgü CD4+ T hücreleri EAE3'tenöroinflamasyon ve patolojiyi başlatabilme ve sürdürebilme yeteneğine sahiptir. EAE zirvesindeki CD4+T hücrelerinin tipik özellikleri Şekil 3'tegösterilmiştir. Ayrıca, EAE'ye aracılık eden başlıca patojenik hücreler olan ensefalojenik hücrelerdeki Th1 ve Th17 alt kümelerinin oranı akış sitometrisi ile analiz edildi. Tek hücreli süspansiyonun beyinden ayrılmasının ardından hücreler CD45, CD11b, CD3, CD4, IFN-γ ve IL-17 antikorları ile boyandı. FSC-A vs FSC-H ve SSC-A vs SSC-H tekli(Şekil 3A, B), daha sonra FSC-A vs SSC-A boyutu ve parçalıdayalı canlı hücreleri kapısı için kullanılmıştır (Şekil 3C). Sonra, CD45+ CD11b- hücreler monositler hariç lökositleri tanımlamak için geçitli edildi(Şekil 3D). Daha sonra, kapı CD3+CD4+ CD4 + CD4 + T lenfositler(Şekil 3E)tanımlamak için ayarlandı.+ Son olarak, IFN-γ ve IL-17, Th1 ve Th17 alt kümelerini tanımlamak ve etkitanımlayıcı sitokinlere göre fonksiyonel etkiyi değerlendirmek için kullanılmıştır(Şekil 3F). Hastalığın klinik şiddetine göre, temsili sonuçlar IFN-γ üreten Th1 ve IL-17 üreten Th17 hücrelerinin EAE farelerin ensefalojenik hücrelerinde önemli ölçüde arttığını göstermiştir.
| Sınıf | Klinik işaret |
| 0 | hiçbir hastalık |
| 1 | azalmış kuyruk tonu veya biraz sakar yürüyüş |
| 2 | kuyruk atoni ve orta derecede beceriksiz yürüyüş ve /veya kötü düzeltme yeteneği |
| 3 | ekstremite zayıflığı |
| 4 | ekstremite felci |
| 5 | moribund devlet. |
Tablo 1: Klinik skorlama sistemi. C57BL/6 fareler MOG35-55 peptid ile aşılandı. Sonra nörolojik belirtiler kaydedildi. AAE'nin şiddetini değerlendirmek için 5 puanlık bir puanlama sistemi kullanıldı.
Şekil 1: Mononükleer hücrelerin izolasyonu için Percoll gradyan kurulumu şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: AAE'nin temsili seyri. EAE protokolde açıklandığı gibi MOG35-55 enjeksiyonu ile C57BL/6 farelerde indüklendi. Bu farelerde klinik skor(A)ve vücut ağırlığının değişimi(B)belirlendi. Veriler ortalama sem ± olarak sunulur; n = 8 her grup için. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Beyindeki lenfositlerin temsili akış sitometri analizi. EAE'nin zirvesinde beyinden tek hücreli bir süspansiyon izole edildi. T lenfositlerinin gating stratejisi gösterilmiştir. Singlets FSC-A vs FSC-H ve SSC-A vs SSC-H (A,B) olarak geçitli edildi. Canlı hücreler FSC-A vs SSC-A(C)olarak geçitli idi. Monositler hariç lökositler CD45+ CD11b- (D) olarak geçitlendi. CD4+ T lenfositler CD3+CD4+ (E) olarak geçitli idi. Th1 ve Th17 alt kümeleri IFN-γ+ ve IL-17+ (F) olarak geçitli idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, MS. EAE'nin tipik bir nöroimmünolojik deneysel hayvan modeli olarak kabul edilen C57BL/6 farelerinde MOG35-55 kullanarak EAE'yi indüklemek ve izlemek için bir protokol sunmaktadır. Örneğin, SJL farelerde PLP139-151 peptid kullanarak özelliklerelaps15terapötik etkileri değerlendirmek için uygun bir nüks-remitting EAE hastalığı ders neden olabilir. Burada özetlenen deneysel prosedür diğer EAE protokollerine de uygulanabilir7. Bu modelde C57BL/6 fareler MOG35-55 peptid ile aşılanır ve monohasik bir hastalık gelişir. AAE'nin şiddetini değerlendirmek için 5 puanlık bir puanlama sistemi kullanılır. Hastalık şiddeti7,16,,17arasında değişen çeşitli puanlama sistemleri istihdam edilmiştir rağmen, bu sonuçlar 5 puanlık bir puanlama sistemi gruplar ve diğer AAE puanlama sistemleri arasında hastalık skorları istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar belirleme yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir belirgin iyileşmeye yol açmaz.
EAE şiddeti genellikle nörolojik disfonksiyon11,13şiddetini dikkate alınarak bir EAE klinik skoru ile değerlendirilir. Deneyin tüm fareler için karşılaştırılabilirliğini sağlamak için, kafes değişiklikleri, yiyecek ve su yönetimi ve özellikle fare barınma koşulları da dahil olmak üzere onları aynı koşullar altında tutmak önemlidir. Buna ek olarak, çapraz aşılama da araştırmacı tarafından indüklenen kafese özgü olayları önlemek için yapılmalıdır.
Bu çalışma, teknükleer hücreleri FACS analizi veya fonksiyonel çalışma için uygun olan CNS'den ayırmak için bir yöntem sunmaktadır. Kanın CNS dokusundan çıkarıldığından emin olmak için, fareler insadantisi önce doku ayrıştırılmalıdır. Mononükleer hücrelerin yoğunluk gradyan santrifüjünde saflaştırılması izolasyonda önemli bir adımdır. Ayırma efektini sağlamak için santrifüjün hızlanması ve yavaşlaması sırasıyla 1 ve 0 olarak ayarlanmalıdır. Bu yöntemi kullanarak, tek hücre verimleri genellikle normal beyinden düşük, ancak EAE ile hastalıklı beyinden daha yüksektir. Temsili sonuçlar CD3 belirgin bir artış olduğunu göstermektedir+CD4+ T lenfositler, özellikle IFN-γ üreten hücreler ve IL-17 üreten hücreler, hangi kötüleşen hastalığa katkıda bulunduğu kabul edilir.
Bu protokolün bazı sınırlamaları vardır. MOG35-55 ile indüklenen EAE modeli ağırlıklı olarak CD4+ T hücre odaklı immünolojik yanıtı gösterir. CD8+ T ve B hücrelerinin rolünün analiz edilmesi gerekiyorsa, alternatif protokoller göz önünde bulundurulmalıdır. Bir CNS inflamatuar hastalık olarak, ciddi bir patolojik fenotip de EAE modelinde omurilik bulunur. Ancak, miyelin büyük miktarda varlığı nedeniyle, FACS analizi için omurilik yeterli tek hücre almak zordur. Bu durumda, omurilik dokusuanaliz etmek için immünohistokimya veya immünofloresan kullanarak gereklidir. Facs analizi için mononükleer hücreleri ayırmak için beyin ve omuriliği bir araya getiren araştırmacılar da vardır12. Bu protokol, FACS analizi için tek hücreleri beyinden ayırır ve immünohistokimya ve immünofloresan analizi için omurilik dokusu.
MS ve EAE immün regülasyonunda T lenfositlerinin önemi son zamanlarda daha fazla ilgi çekmiştir. Yayınlanan literatürün çoğu dalak ve lenf düğümleri11; ancak, lenfositler EAE farelerin CNS boyunca bulunur ve böylece, CNS T lenfositlerin karakteristik analizi gereklidir. Kesitlerin immünolojik boyanması CNS'deki infiltrasyon hücrelerini belirleyebilir. Ancak, henotibik ve fonksiyonel analiz sınırlıdır. Bağışıklık hücrelerinin normal veya hastalıklı farelerin CNS'sinden izole edilmesinden sonra, daha ayrıntılı fenotiplerin analizi mümkün olur. Bu yöntemle beyindeki T lenfositleri hücre bazında incelenebilir ve farklı yüzey belirteçleri, sitokinler, kemokinler ve transkripsiyon faktörlerinin (örn. hücre içi proteinler) ekspresyonu daha iyi analiz edilebilir. Protokol, MS ve EAE sırasında beyindeki T lenfositlerinin fenotipini ve işlevini değerlendirmek için gelecekteki çalışmalariçin yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan etmek için çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı hibe (31570921 ZJ, 81571533 LS), Şangay Belediye Sağlık Komisyonu ve Aile Planlaması (201540206 ZJ), Ruijin Hastanesi Kuzey araştırma hibe (2017ZX01 ZJ) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
- Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
- Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R.
- McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
- Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
- Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
- Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
- Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Miller, S. D., Karpus, W. J.
- Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).
