Summary
Detta manuskript presenterar ett protokoll för att inducera aktiva experimentella autoimmuna encefalomyelit (EAE) i möss. En metod för isolering och karakterisering av de infiltrerade lymfocyterna i centrala nervsystemet (CNS) presenteras också för att visa hur lymfocyter är involverade i utvecklingen av CNS autoimmun sjukdom.
Abstract
Multipel skleros (MS) är en autoimmun sjukdom i centrala nervsystemet (CNS) som orsakas av kombinationen av miljöfaktorer och mottaglig genetisk bakgrund. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en typisk sjukdom modell av MS används allmänt för att undersöka patogenesen i vilka T-lymfocyter specifika för myelin antigener initiera en inflammatorisk reaktion i CNS. Det är mycket viktigt att bedöma hur lymfocyter i CNS reglerar utvecklingen av sjukdom. Men tillvägagångssättet för att mäta kvantitet och kvalitet av infiltrerade lymfocyter i CNS är mycket begränsad på grund av svårigheterna att isolera och upptäcka infiltrerade lymfocyter från hjärnan. Detta manuskript presenterar ett protokoll för som är användbart för isolering, identifiering och karakterisering av infiltrerade lymfocyter från CNS och kommer att vara till hjälp för vår förståelse av hur lymfocyter är inblandade i utvecklingen av CNS autoimmun sjukdom.
Introduction
Som en kronisk demyelinating sjukdom i CNS, MS drabbar cirka 2,5 miljoner människor över hela världen och saknar botande behandlingar1. Det anses också vara en autoimmun sjukdom, där myelin antigen specifika T-lymfocyter initiera en inflammatorisk reaktion och leda till demyelination och axonal skada i CNS2. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) har använts i stor utsträckning för att undersöka patogena mekanismer av MS som en klassisk autoimmun demyelination sjukdom modell i CNS3. Det finns två sätt att inducera EAE: ett är att inducera EAE aktivt genom att immunisera djur med myelinkomponenter, en annan är adoptivöverföring genom att överföra encefalitogena T-celler till receptor2,4,5. Mottagligheterna för EAE är olika i olika djurstammar6. Hos C57BL/6-möss inducerar myelinoligodendrocyte glykoprotein (MOG) 35–55-utmaning en monofasisk sjukdom med omfattande demyelination och inflammation i CNS, som ofta används i försök med geninriktade möss7.
Genereringen av myelinspecifika reaktiva T-celler krävs för förekomst och utveckling av sjukdom i EAE och är ett immunologiskt tecken på både EAE och MS. Aktiverade autoreaktiva T-lymfocyter korsar blodhjärnbarriären (BBB) i den friska CNS och initierar EAE-sjukdomen. När MOG 35–55 Ag påträffas framkallar dessa T-lymfocyter inflammation och rekrytering av effektorceller till CNS, vilket resulterar i demyelination och axonförstörelse8,9. I EAE-modellen finns det gott om bevis för att neuroantigenspecifika CD4+ T-celler kan initiera och upprätthålla neuroinflammation och patologi3,10. Beroende på de stora cytokiner som produceras, CD4+ T-lymfocyter har klassificerats i olika delmängder: Th1 (kännetecknas av produktion av interferon-γ), Th2 (kännetecknas av produktion av interleukin 4), och Th17 (kännetecknas av produktion av interleukin 17). Man tror att aktivering av Th1 och Th17 celler bidrar till induktion, underhåll, och reglering av inflammatorisk demyelination i EAE och MS genom att utsöndra effektor cytokiner IFN-γ och IL-17, som är i stånd att aktivera makrofager och rekrytera neutrofiler till de inflammatoriska platserna för att påskynda de skador11.
Eftersom autoreaktiva T-celler korsar BBB i CNS och inducerar utvecklingen av sjukdom i MS och EAE, är det mycket viktigt att analysera T-celler i CNS. Det finns dock mycket få etablerade protokoll för isolering av lymfocyter från CNS12. Därför utvecklades en metod som är optimerad för att isolera mononukleära celler från hjärnan och analysera T-lymfocyter med markörerna CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g och IL-17 för flödescytometri. Metoden använder MOG35– 55 adjuvant Mycobacterium tuberculosis H37 Ra och Pertussis Toxin Working Solution (PTX) för att inducera en aktiv immuniseringsmodell av EAE hos möss. Därefter används mekaniska separations- och densitetsgradientcentrifugationsmetoder för isolering av CNS mononukleära celler. Slutligen används en optimerad flödescytometri gating strategi för att identifiera T-lymfocyter och delmängder från hjärnan genom färgning av flera markörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av djurkommittén vid School of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University.
1. Beredning av materialen
- Använd MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK-sekvensen av MOG35–55 för att erhålla den lyofilaterade peptiden från kommersiella källor. Se till att peptidens renhet är >95%. Bered 10 mg/mL MOG-stamlösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och förvara vid -20 °C.
- Bered en 4 mg/mL stamlösning av M. tuberkulos H37 Ra genom att sätta en 100 mg tub M. tuberkulos H37 Ra i 25 mL av Complete Freunds Adjuvant (CFA) och blandning. Förvara stamlösningen vid -20 °C.
- Förbered 1 ng/μL Pertussis Toxin Arbetslösning (PTX) genom att tillsätta 50 μg PTX i 50 mL PBS. Förvara arbetslösningen vid -20 °C.
- Lagra alla antikroppar (dvs, FITC anti-mouse CD3, PE/Cy7 anti-mouse CD4, PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b, Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2, PE anti-mouse IL-17A och APC anti-mouse IFN-γ) vid 4 °C.
- Gör Flow Cytometry Staining (FCS) Buffer genom att lägga till 2 mM etylendiamin tetraättiksyra (EDTA) och 1% fetala nötkreatur serum (FBS) i 500 mL PBS.
2. Inhysning av C57BL/6 möss
- Använd kvinnliga C57BL/6-möss vid 8–12 veckors ålder.
- Acklimatisera C57BL/6J-möss under minst 7 dagar före injektionen.
- Husmöss i en djuranläggning under patogenfria förhållanden vid konstant temperatur och luftfuktighet i en 12 h ljus/mörk cykel och ger fri tillgång till vatten och standard pelletsmat.
3. Immunisering av C57BL/6 möss
- Lämna alla stamlösningar i 15 min vid rumstemperatur (RT) för att säkerställa fullständig rehydrering.
- Späd 300 μL MOG-peptid stamlösning med 700 μL PBS för tillredning av 3 mg/mL arbetslösning.
- Sätt 1 mL M. tuberkulos H37 Ra stamlösning och 1 mL MOG35–55 peptider arbetslösning i separata 10 mL sprutor, använd sedan en fyrvägs stopp kuk att emulgera i minst 10 min. Säkerställ fullständig emulgering före injektion.
- Söva möss på toppen av EAE med en intraperitonial injektion av 1% natrium pentobarbital (50 mg/kg).
- Med en 1 mL-spruta injicerar du subkutant möss med 100 μL av en MOG 35–55/CFA-emulsion (300 μg/200 μL) på två platser, båda på baksidan nära nacken. Subkutant injicera kontrollmöss med 200 μL PBS.
- Samma dag (dag 0) och dag 2 post immunisering (PI), Intraperitoneally injicera möss med 200 μL av 1 ng/μL PTX arbetslösning. Intraperitoneally injicera kontroll möss med 200 μL av PBS.
- Överför mössen till deras hembur med en värmande pad.
- Undersök och gradera alla möss varje dag efter injektionen på ett förblindat sätt för de neurologiska tecken som visas i tabell 111,13. Avliva djuren om poängen är sämre än grad 4.
- Registrera viktförändringarna under sjukdomsförloppet. Detta är en värdefull ytterligare åtgärd för sjukdomsaktivitet i EAE-modellen11,13.
- Lägg till den första dagen av kliniska tecken för enskilda möss och dividera med antalet möss i gruppen; resultatet är inst: Lägg till den första dagen av den maximala EAE-poängen för enskilda möss och dividera med antalet möss i gruppen; resultatet är toppen.
4. Encellig suspension förberedelse från hjärnan
- Utspädd densitet gradient medium i 9:1 förhållande med PBS i en 15 mL koniskt rör för att ge en slutlig 100% lösning.
- Anesthetize möss på toppen av EAE med en intraperitonial injektion av 1% natrium pentobarbital (50 mg/kg) och genomsyra intracardially med 20 mL av steril iskall PBS. Uppnå detta genom att långsamt och stadigt injicera PBS i hjärtats vänstra kammare med hjälp av en 20 mL spruta och öppna det högra förmaket.
- Skär kraniet försiktigt från näsan till halsen, ta sedan bort hjärnan från kraniala lådan i 10 mL RPMI i 50 mL koniska rör. Blanda väl för att ta bort vidhäftande röda blodkroppar. Ta sedan bort mediet genom aspiration och tillsätt 10 mL RPMI.
- Placera hjärnor och medium i en 100 mm skål. Finhacka med ett rakblad.
- Överför 6 mL från skålen till en iskall 7 mL sinterad glas homogenisator med en ren pipett. Undvik att lämna stora mängder vävnad i pipetten. En liten mängd är oundviklig.
- Mala hjärnan med hjälp av "lös" kolven i mortelstöten först, använd sedan den "snäva" kolven tills suspensionen är homogen, och häll i en prechilled 15 mL koniska röret och hålla på is.
- Efter alla prover är homogeniserade, uppskatta volymen. Justera volymen med RPMI till 7 mL. Placera sedan 3 mL iskall 100% källare membran matris i en kyld 15 mL konisk centrifugrör och tillsätt 7 mL av hjärnan homogenate att ge en slutlig 30% densitet gradient medium. Blanda genom inversion ett par gånger. Virvel inte.
- För att säkerställa ett skarpt gränssnitt, försiktigt och långsamt lägga 1 mL av 70% underskikt densitet gradient medium i RPMI med en 3 mL pipett.
- Centrifugera vid 800 x g i endast 20 min vid 4 °C. Ställ in accelerationen på 1 och inbromsning till 0. Efter centrifugeringen, aspirera nästan alla av den översta fasen, var noga med att helt ta bort myelin längst upp (Bild 1).
- Ta bort gränssnittet i ett nytt 15 centrifugrör. Justera volymen till 10 mL med RPMI.
- Centrifugera vid 500 x g i 10 min. Efter centrifugeringen aspirera supernatanten. Resuspend pelleten i ~200 μL av flödescytometri färgning (FSC) buffert. Pelletsen är sedan redo att färga för FACS.
5. Flödescytometrisk analys av enstaka celler från hjärnan
- Använd en hemocytometer och mikroskop för att räkna cellerna. Tillsätt 10 μL av cellerna till 10 μL trypanblått, blanda väl och placera 10 μL på en hemocytometer för att räkna cellerna. Beräkna sedan antalet levande celler per mikroliter under ett inverterat mikroskop (t.ex. Olympus Inverterat mikroskop).
- Aliquot ungefär 2 x 106 av celler i RPMI i en enda brunn av en 96 väl platta.
- Tillsätt 500x cell stimulering cocktail plus proteintransport hämmare till brunnarna.
- Inkubera plattan i inkubatorn vid 37 °C i 4 h.
- Centrifugera cellerna vid 400 x g i 5 min vid RT. Kassera supernatanten och resuspend cellerna i 100 μL FCS Buffert.
- Förincubate cellerna med anti-mus CD16/CD32 Fc block (1:33) för 10 min vid 4 °C innan färgning för att blockera ospecifika Fc-medierad interaktioner.
- Fläck cell ytmarkörer utan tvätt. Lägg till anti-mus-CD45.2 (1:200), anti-mus-CD11b (1:200), anti-mus-CD3 (1:200) och anti-mus-CD4 -antikroppar (1:200).
OBS: För att bestämma positiva och negativa grindar, en fluorescens minus en (FMO) för varje färg och en isotyp kontroll antikropp bör färgas. - Inkubera plattan i minst 30 min vid 4 °C eller på is. Skydda mot ljus.
- Tvätta cellerna genom att lägga fcs buffert. Använd 200 μL/brunn för mikrotiterplattor. Centrifugera vid 400 x g i 5 min vid RT. Kassera supernatanten.
- Tillsätt 200 μL av intracellulär (IC) fixeringsbuffert till varje brunn för att fixera cellerna. Se till att cellerna är helt återanvänds i lösningen.
- Inkubera 30–60 min på RT. Skydda mot ljus.
- Centrifugera proverna vid 400 x g vid RT i 5 min. Kassera supernatanten.
- Tillsätt 200 μL av 1x permeabiliseringsbuffert till varje brunn och centrifugerna proverna vid 400 x g vid RT i 5 min. Kassera supernatanten.
- Resuspend pelleten i restvolym och justera volymen till ca 100 μL med 1x permeabiliseringsbuffert.
- Lägg till anti-mus IL-17A (1:200) och anti-mouse IFN-g (1:200) antikroppar för detektion av intracellulära antigener till celler.
- Inkubera i minst 30 min vid 4 °C. Skydda mot ljus.
- Tillsätt 100 μL av 1x permeabiliseringsbuffert till varje brunn och centrifugerna proverna vid 400 x g vid RT i 5 min. Kassera supernatanten.
- Resuspend de färgade cellerna i 100 μL av flödescytometri färgning buffert.
- Analysera genom flödescytometri.
OBS: Laser- och kompensationsinställningarna på flödescytometern justeras, proverna placeras på cytometern, och alla händelser registreras enligt tillverkarens rekommendationer.
6. Dataanalys
- Gate undertår med hjälp av FSC-A vs. FSC-H och SSC-A vs. SSC-H.
- Gate levande celler med hjälp av FSC-A och SSC-A baserat på storlek.
- Därefter identifiera leukocyterna, exklusive monocyterna, genom att gating på CD45+ CD11b- celler.
- Sedan, identifiera CD4 T-lymfocyter genom gating på CD3 + CD4 + celler.
- Slutligen identifiera delmängderna Th1 och Th17 genom gating på IFN-γ + celler och IL-17 + celler separat, och bestämma de positiva och negativa populationer med hjälp av isotype kontroller och FMO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter immunisering av C57BL/6 möss, var alla möss vägas, undersökts och graderas dagligen för neurologiska tecken. Den representativa kliniska kursen för EAE bör resultera i en sjukdomskurva som presenteras i figur 2A och en förändring av kroppsvikten i musen som presenteras i figur 2B. C57BL/6-möss som immuniserats med MOG35-55 började vanligtvis utveckla sjukdomssymptom runt dag 10–12 och uppnådde toppen av sjukdom omkring dag 15–21 efter aktiv immunisering (Figur 2A). Viktförändring var en värdefull indikator i EAE-modellen. Före sjukdomsuppsatt ökade kroppsvikten av immuniserade möss gradvis, sedan minskade vanligtvis korrelerar till de ökande sjukdomssymtomen. Vid eae-toppen visade möss också den lägsta kroppsvikten (Figur 2B). Då kroppsvikt återhämtade sig något som kliniska symtom minskade. Mössen återhämtade sig dock vanligtvis inte helt. C57BL/6 möss utvecklade en monofasisk kronisk sjukdom patologi vid MOG35–55 utmaning (Figur 2A).
Den kliniska svårighetsgraden av EAE är direkt förknippad med autoreaktiv T-cell aktivering14. Neuroantigenspecifika CD4+ T-celler kan initiera och upprätthålla neuroinflammation och patologi i EAE3. De typiska egenskaperna hos CD4+T-celler i eaes topp visas i figur 3. Vidare analyserades andelen undergrupper av Th1 och Th17 i encefalitogena celler, som är de större patogena cellerna som medlar EAE, av flödescytometri. Efter separationen av en encellig suspension från hjärnan, cellerna var färgas med CD45, CD11b, CD3, CD4, IFN-γ och IL-17 antikroppar, som uttrycks av T-lymfocyter. FSC-A vs. FSC-H och SSC-A vs. SSC-H användes för att grinda singlets (Figur 3A, B), då användes FSC-A vs. SSC-A för att gate levande celler baserat på storlek och granularitet (Figur 3C). Efter, CD45+ CD11b- celler var gated att identifiera leukocyter exklusive monocyter (Figur 3D). Sedan, var gate inställd på CD3+CD4+ att identifiera CD4+ T-lymfocyter (Bild 3E). Slutligen användes IFN-γ och IL-17 för att identifiera Th1 och Th17-delmängder och bedöma den funktionella effekten enligt effektorcytokiner (figur 3F). Enligt den kliniska svårighetsgraden av sjukdomen, representativa resultat visade att IFN-γ–producerar Th1 och IL-17–producerar Th17 celler avsevärt ökat i de encefalitogena cellerna från EAE möss.
| Klass | Kliniskt tecken |
| 0 | ingen sjukdom |
| 1 | minskad stjärtton eller lätt klumpig gång |
| 2 | svansens betonde och måttligt klumpiga gång och/eller dålig rättningsförmåga |
| 3 | lem svaghet |
| 4 | lem förlamning |
| 5 | döende stat. |
Tabell 1: Kliniskt poängsystem. C57BL/6-möss immuniserades med mog35–55-peptiden. Sedan registrerades neurologiska tecken. Ett poängsystem med 5 poäng användes för att bedöma hur allvarlig EAE är.
Bild 1: Schematisk för percoll-gradientsuppställningen för isolering av mononukleära celler. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Diagram 2: Representativ kurs för EAE. EAE var inducerad i C57BL/6 möss genom injektion av MOG35 – 55 som beskrivs i protokollet. Den kliniska poängen (A) och förändring av kroppsvikt (B) fastställdes i dessa möss. Data presenteras som medelvärde ± SEM; n = 8 för varje grupp. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Representativ flödescytometrianalys av lymfocyter i hjärnan. En encellig suspension isolerades från hjärnan i toppen av EAE. Den gating strategi av T-lymfocyter visas. Singlets var gated som FSC-A vs FSC-H och SSC-A vs SSC-H (A,B). Levande celler var gated som FSC-A vs. SSC-A (C). Leukocyter exklusive monocyter var gated som CD45+ CD11b- (D). CD4+ T-lymfocyter var gated som CD3+CD4+ (E). Th1 och Th17 delmängder var gated som IFN-γ+ och IL-17+ (F). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie presenterar ett protokoll för att inducera och övervaka EAE med hjälp av MOG35-55 i C57BL/6 möss, som anses vara en typisk neuroimmunological experimentella djur modell av MS. EAE kan induceras varierande möss stammar eller vilken typ av protein som används för induktion enligt syftet med studien. Till exempel, med hjälp av PLP139–151 peptid i SJL möss kan framkalla en skovledslöpande EAE sjukdomsförloppet som är särskilt väl lämpad för att bedöma terapeutiska effekter på skov15. Det experimentella förfarande som skisseras här kan också tillämpas på andra EAE-protokoll7. I denna modell immuniseras C57BL/6-möss med MOG35–55 peptid och utvecklar en monofasisk sjukdom. Ett poängsystem med 5 poäng används för att bedöma hur allvarlig EAE är. Även om flera poängsystem från 0–3 poäng eller 0–10 poäng är anställda för att göra mål på sjukdomensallvarlighetsgrad 7,16,17, visar dessa resultat att ett poängsystem med 5 poäng klarar av att fastställa statistiskt signifikanta skillnader i sjukdomspoäng mellan grupper och andra EAE-poängsystem leder inte till någon uppenbar förbättring.
EAE-allvarlighetsgraden utvärderas i allmänhet genom en EAE-klinisk poäng med hänsyn till hur allvarlig neurologisk dysfunktion11,13. För att säkerställa jämförbarheten av experimentet för alla möss är det viktigt att hålla dem under samma förhållanden, inklusive byten av bur, administrering av mat och vatten, och särskilt mushusförhållanden. Dessutom ska korsimmunisering utföras också för att undvika burspecifika fenomen som framkallas av prövaren.
Denna studie ger en metod för att separera mononukleära celler från CNS som är lämplig för FACS analys eller funktionell studie. För att säkerställa att blodet avlägsnas från CNS-vävnaden ska mössen perfunderas innan vävnaden separeras. Reningen av de mononukleära cellerna på en densitetsgradientcentrifugation är ett nyckelsteg i isoleringen. För att säkerställa en avskiljande effekt bör accelerationen och inbromsningen av centrifugen sättas till 1 respektive 0. Med denna metod är de enda cellen avkastningen vanligtvis låg från normal hjärna, men högre från sjuka hjärnan med EAE. Representativa resultat visar att det finns en uppenbar ökning av CD3+CD4+ T-lymfocyter, särskilt IFN-γ producerar celler och IL-17 producerar celler, som anses bidra till den förvärrade sjukdomen.
Det finns vissa begränsningar i det här protokollet. EAE-modellen framkallad med MOG35–55 visar främst ett CD4+ T-celldrivet immunologiskt svar. Om rollen av CD8+ T-celler och B-celler behöver analyseras, bör alternativa protokoll övervägas. Som en CNS inflammatorisk sjukdom, en allvarlig patologisk fenotyp finns också i ryggmärgen i EAE-modellen. Men på grund av förekomsten av stora mängder av myelin, är det svårt att få tillräckligt med enstaka celler från ryggmärgen för FACS analys. I så fall, med hjälp av immunohistokemi eller immunofluorescens att analysera ryggmärg vävnad behövs. Det finns också forskare som sätter hjärnan och ryggmärgen tillsammans för att separera mononukleära celler för FACS analys12. Detta protokoll separerar enstaka celler från hjärnan för FACS analys och ryggmärgsvävnad för immunohistokemi och immunofluorescens analys.
Vikten av T-lymfocyter i immunreglering av MS och EAE har fått mer och mer uppmärksamhet nyligen. Mycket av den publicerade litteraturen fokuserar på mjälte och lymfkörtlar11; emellertid, lymfocyter finns i hela CNS av EAE möss och, därmed, den karakteristiska analysen av T-lymfocyter i CNS är nödvändig. Immunohistological färgning av sektioner kan identifiera infiltrerande celler i CNS. Fenotypisk och funktionell analys är dock begränsad. Efter isolering av immuncellerna från CNS av normala eller sjuka möss, blir analysen av mer detaljerade fenotyper möjliga. Med denna metod kan T-lymfocyter i hjärnan studeras på cell-för-cell-basis, och uttrycket av olika ytmarkörer, cytokiner, kemokiner, och transkriptionsfaktorer (t.ex. intracellulära proteiner) kan analyseras bättre. Protokollet kommer att vara användbart för framtida studier för att bedöma fenotyp och funktion av T-lymfocyter i hjärnan under loppet av MS och EAE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av National Natural Science Foundation of China grant (31570921 till ZJ, 81571533 till LS), Shanghai Municipal Commission of Health, and Family Planning (201540206 till ZJ), Ruijin Hospital North research grant (2017ZX01 till ZJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
- Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
- Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R.
- McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
- Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
- Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
- Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
- Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Miller, S. D., Karpus, W. J.
- Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).
