प्रायोगिक ऑटोइम्यून एंसेफेलोयलाइटिस के दौरान केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में लिम्फोसाइट घुसपैठ का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण
Summary
यह पांडुलिपि चूहों में सक्रिय प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस (ईएई) को प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में घुसपैठ किए गए लिम्फोसाइट्स के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए एक विधि यह दिखाने के लिए भी प्रस्तुत की जाती है कि सीएनएस ऑटोइम्यून रोग के विकास में लिम्फोसाइट्स कैसे शामिल हैं।
Abstract
मल्टीपल स्क्लेरोसिस (एमएस) पर्यावरणीय कारकों और अतिसंवेदनशील आनुवंशिक पृष्ठभूमि के संयोजन के कारण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का एक ऑटोइम्यून रोग है। प्रायोगिक ऑटोइम्यून एंसेफेलोमाइलाइटिस (ईएई) एमएस का एक विशिष्ट रोग मॉडल है जिसका व्यापक रूप से रोगजनकता की जांच के लिए उपयोग किया जाता है जिसमें माइलिन एंटीजन के लिए विशिष्ट टी लिम्फोसाइट्स सीएनएस में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया शुरू करते हैं। यह आकलन करना बहुत महत्वपूर्ण है कि सीएनएस में लिम्फोसाइट्स रोग के विकास को कैसे विनियमित करते हैं। हालांकि, सीएनएस में घुसपैठ किए गए लिम्फोसाइट्स की मात्रा और गुणवत्ता को मापने के लिए दृष्टिकोण मस्तिष्क से घुसपैठ किए गए लिम्फोसाइट्स को अलग करने और उनका पता लगाने में कठिनाइयों के कारण बहुत सीमित है। यह पांडुलिपि सीएनएस से घुसपैठ किए गए लिम्फोसाइट्स के अलगाव, पहचान और लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी है और सीएनएस ऑटोइम्यून रोग के विकास में लिम्फोसाइट्स कैसे शामिल हैं, इसकी हमारी समझ के लिए उपयोगी होगी।
Introduction
सीएनएस की एक पुरानी डिमीलिनिंग बीमारी के रूप में, एमएस दुनिया भर में लगभग 2.5 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है और उपचारात्मक उपचार1का अभाव है। इसे एक ऑटोइम्यून बीमारी भी माना जाता है, जिसमें मायलिन एंटीजन विशिष्ट टी लिम्फोसाइट्स एक भड़काऊ प्रतिक्रिया शुरू करते हैं और सीएनएस 2 में डिमाइलेशन और एक्सोनल चोट का कारणबनतेहैं। प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस (ईएई) का व्यापक रूप से सीएनएस3में एक क्लासिक ऑटोइम्यून डेमिलेशन रोग मॉडल के रूप में एमएस के रोगजनक तंत्र की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है। ईएई को प्रेरित करने के दो तरीके हैं: एक यह है कि एनीमलिन घटकों के साथ जानवरों को प्रतिरक्षित करके सक्रिय रूप से ईएई को प्रेरित किया जाए, दूसरा एंसेप्लिनिक टी कोशिकाओं को,रिसेप्टर2,,4,5में स्थानांतरित करके दत्तक अंतरण है। ईएई के लिए संवेदनशीलता विभिन्न जानवरों के उपभेदों में भिन्न होती है6. C57BL/6 चूहों में, मायलिन ओलिगोडेन्ड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) 35-55 चैलेंज सीएनएस में व्यापक जनसांख्यिकी और सूजन के साथ एक मोनोफैसिक रोग को प्रेरित करता है, जो अक्सर जीन-लक्षित चूहों 7 के साथ प्रयोगों में उपयोग कियाजाताहै।
ईएई में रोग की घटना और विकास के लिए मायलिन-विशिष्ट प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं की पीढ़ी आवश्यक है और ईएई और एमएस दोनों का एक इम्यूनोलॉजिकल संकेत है। सक्रिय ऑटोरिएक्टिव टी लिम्फोसाइट्स स्वस्थ सीएनएस में रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) को पार करते हैं और ईएई रोग शुरू करते हैं। जब एमओजी 35-55 एजी का सामना करना पड़ता है, तो ये टी लिम्फोसाइट्स सूजन और सीएनएस में प्रभावक कोशिकाओं की भर्ती को प्रेरित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप डिमाइलेशन और एक्सोन विनाश8,,9होता है। ईएई मॉडल में, इस बात के पर्याप्त सबूत हैं कि न्यूरोएंटीजेन-विशिष्ट सीडी 4+ टी कोशिकाएं न्यूरोइंफ्लेमेशन और पैथोलॉजी3,,10को शुरू और बनाए रख सकती हैं। उत्पादित प्रमुख साइटोकिन्स के आधार पर, सीडी 4+ टी लिम्फोसाइट्स को विभिन्न सबसेट में वर्गीकृत किया गया है: Th1 (इंटरफेरॉन-γ के उत्पादन की विशेषता), Th2 (इंटरल्यूकिन 4 के उत्पादन की विशेषता), और Th17 (इंटरल्यूकिन 17 के उत्पादन की विशेषता)। यह माना जाता है कि Th1 और Th17 कोशिकाओं की सक्रियता 11 घावों में तेजी लाने के लिए मैक्रोफेज को सक्रिय करने और भड़काऊ साइटों पर न्यूट्रोफिल की भर्ती करने में सक्षम हैं, जो प्रभावक साइटोकिन्स आईएफएन-γ और आईएल-17 को स्रावित करके ईएई और एमएस में भड़काऊ डिमिटिलेशन के प्रेरण, रखरखाव और विनियमन में योगदान देतीहै।
क्योंकि ऑटोरेक्टिव टी कोशिकाएं बीबीबी को सीएनएस में पार करती हैं और एमएस और ईएई में बीमारी के विकास को प्रेरित करती हैं, इसलिए सीएनएस में टी कोशिकाओं का विश्लेषण करना बहुत महत्वपूर्ण है। हालांकि, सीएनएस12से लिम्फोसाइट्स के अलगाव के लिए बहुत कम स्थापित प्रोटोकॉल हैं। इसलिए, मस्तिष्क से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग करने और प्रवाह साइटोमेट्री के लिए मार्कर सीडी 45, सीडी 11बी, सीडी 3, सीडी 4, आईएनएफ-जी और आईएल-17 के साथ टी लिम्फोसाइट्स का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित एक विधि विकसित की गई थी। इस विधि में चूहों में ईएई के सक्रिय प्रतिरक्षण मॉडल को प्रेरित करने के लिए MOG35-55 adjuvant Mycobacterium तपेदिक H37 Ra और Pertussis विष कार्य समाधान (PTX) का उपयोग करता है । फिर, सीएनएस मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अलगाव के लिए यांत्रिक पृथक्करण और घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र विधियों का उपयोग किया जाता है। अंत में, एक अनुकूलित प्रवाह साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति का उपयोग कई मार्कर को धुंधला करके मस्तिष्क से टी लिम्फोसाइट्स और सबसेट की पहचान करने के लिए किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह अध्ययन C57BL/6 चूहों में MOG35-55 का उपयोग करके EAE को प्रेरित करने और निगरानी करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसे एमएस के एक विशिष्ट न्यूरोइम्यूनोलॉजिकल प्रायोगिक पशु मॉडल माना जाता है। EAE को चूहों ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना ग्रांट (31570921 से जेडजे, 81571533 को एलएस), शंघाई म्यूनिसिपल कमीशन ऑफ हेल्थ, एंड फैमिली प्लानिंग (201540206 से जेडजे), रुइजिन हॉस्पिटल नॉर्थ रिसर्च ग्रांट (2017ZX01 से जेडजे) को सपोर्ट मिला।
Materials
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
- Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
- Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
- McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
- Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
- Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
- Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
- Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).
- Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).
