تحليل تدفق Cytometric لتسلل الخلايا اللمفاوية في الجهاز العصبي المركزي أثناء التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي
Summary
تقدم هذه المخطوطة بروتوكولاً للحث على التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي النشط (EAE) في الفئران. كما يتم تقديم طريقة لعزل وتوصيف الخلايا الليمفاوية المتسللة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) لإظهار كيفية مشاركة الخلايا الليمفاوية في تطور مرض المناعة الذاتية للجهاز العصبي المركزي.
Abstract
التصلب المتعدد (MS) هو مرض المناعة الذاتية للجهاز العصبي المركزي (CNS) الناجم عن مزيج من العوامل البيئية والخلفية الوراثية المعرضة للخطر. التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج مرض نموذجي من التصلب المتعدد يستخدم على نطاق واسع للتحقيق في التسبب في الأمراض التي تائية الخلايا الليمفاوية محددة لمستضدات المايلين بدء تفاعل التهابي في الجهاز العصبي المركزي. من المهم جدا لتقييم كيفية الخلايا الليمفاوية في الجهاز العصبي المركزي تنظيم تطور المرض. ومع ذلك ، فإن نهج قياس كمية ونوعية الخلايا الليمفاوية المخترقة في الجهاز العصبي المركزي محدودة للغاية بسبب الصعوبات في عزل واكتشاف الخلايا الليمفاوية المتسللة من الدماغ. تقدم هذه المخطوطة بروتوكولاً يفيد في عزل الخلايا اللمفاوية المخترقة من الجهاز العصبي المركزي وتحديدها وتوصيفها، وستكون مفيدة لفهمنا لكيفية مشاركة الخلايا اللمفاوية في تطوير مرض المناعة الذاتية التابع لل CNS.
Introduction
كما مرض مزمن إزالة الغموض من الجهاز العصبي المركزي, التصلب المتعدد يؤثر على حوالي 2.5 مليون شخص في جميع أنحاء العالم، ويفتقر إلى العلاجات العلاجية1. كما يعتبر مرض المناعة الذاتية, التي مستضد الميالين محددة T اللمفاويات بدء رد فعل التهابي ويؤدي إلى إزالة الغموض وإصابة محورية في الجهاز العصبي المركزي2. وقد استخدمت على نطاق واسع اختبارية المناعة الذاتية التهاب الدماغ (EAE) للتحقيق في الآليات المسببة للأمراض من مرض التصلب العصبي المتعدد كنموذج كلاسيكي لمرض المناعة الذاتية في الجهاز العصبي المركزي3. هناك طريقتان للحث EAE: واحدة هو حث EAE بنشاط عن طريق تحصين الحيوانات مع مكونات الميالين، وآخر هو نقل بالتبني عن طريق نقل الخلايا التائية الدماغية إلى مستقبلات2،4،5. وssceptibilities إلى EAE مختلفة في سلالات الحيوانات المختلفة6. في C57BL/6 الفئران، myelin oligodendrocyte الجليكوبروتين (MOG) 35-55 التحدي يدفع مرض أحادي الطور مع إزالة الغموض واسعة والتهاب في الجهاز العصبي المركزي، والذي يستخدم في كثير من الأحيان في التجارب مع الفئران الجينات المستهدفة7.
مطلوب توليد خلايا T التفاعلية الخاصة بالميلين لحدوث المرض وتطوره في EAE وهو علامة مناعية لكل من EAE وMS. الخلايا الليمفاوية التائية النشطة تلقائيًا عبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) في الجهاز العصبي المركزي الصحي وبدء مرض EAE. عندما واجهت MOG 35-55 Ag, هذه الخلايا الليمفاوية T الحث التهاب وتجنيد الخلايا في الجهاز العصبي المركزي, مما أدى إلى إزالة الغموض وتدمير محور عصبي8,9. في نموذج EAE ، هناك أدلة وافرة على أن الخلايا CD4+ T الخاصة بـ neuroantigen يمكن أن تبدأ وتحافظ على التهاب الأعصاب وعلم الأمراض3،10. اعتمادا على السيتوكينات الرئيسية المنتجة، تم تصنيف CD4+ T الخلايا الليمفاوية في مجموعات فرعية مختلفة: Th1 (تتميز بإنتاج الإنترفيرون-γ)، Th2 (تتميز بإنتاج إنترلوكين 4)، و Th17 (تتميز بإنتاج إنترلوكين 17). ويعتقد أن تفعيل Th1 وTh17 الخلايا تسهم في الاستقراء والصيانة والتنظيم من إزالة الغموض الالتهابي في EAE وMS عن طريق إفراز المنشطات cytokines IFN-γ و IL-17، والتي هي قادرة على تفعيل الضامة وتجنيد العدلات للمواقع الالتهابية لتسريع الآفات11.
لأن الخلايا التائية T عبور BBB في الجهاز العصبي المركزي والحث على تطور المرض في مرض التصلب العصبي المتعدد وEAE، من المهم جدا لتحليل الخلايا التائية في الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، هناك عدد قليل جدا من البروتوكولات المنشأة لعزل الخلايا الليمفاوية من الجهاز العصبي المركزي12. لذلك، تم تطوير طريقة محسنة لعزل الخلايا أحادية النوى من الدماغ وتحليل الخلايا الليمفاوية T مع علامات CD45، CD11b، CD3، CD4، INF-g، و IL-17 للمعالجة الخلية تدفق. تستخدم هذه الطريقة MOG35-55 adjuvant Mycobacterium Tuberculoss H37 Ra و Pertussis التكسين حل العمل (PTX) للحث على نموذج التمنيع النشط من EAE في الفئران. ثم يتم استخدام طرق الطرد المركزي للانفصال الميكانيكي والكثافة لعزل خلايا النوى الأحادية في الجهاز العصبي المركزي. وأخيراً، يتم استخدام استراتيجية جسور جسور للخلايا تدفق الأمثل لتحديد الخلايا الليمفاوية T و المجموعات الفرعية من الدماغ عن طريق تلطيخ علامات متعددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا للحث على EAE ومراقبته باستخدام MOG35-55 في فئران C57BL/6 ، والتي تعتبر نموذجًا تجريبيًا نموذجيًا لحيوانات الـ MS. EAE يمكن أن يسببه اختلاف سلالات الفئران أو نوع البروتين المستخدم للحث وفقًا لغرض الدراسة. على سبيل المثال، يمكن استخدام PLP139-151 الببتيد في الفئران SJL الحث على د?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين منحة (31570921 إلى ZJ، 81571533 إلى LS)، لجنة شنغهاي البلدية للصحة، وتنظيم الأسرة (201540206 إلى ZJ)، Ruijin مستشفى الشمال منحة البحوث (2017ZX01 إلى ZJ).
Materials
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
- Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
- Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
- McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
- Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
- Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
- Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
- Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).
- Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).
