Analisi citometrica del flusso dell'infiltrazione di linfociti nel sistema nervoso centrale durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale
Summary
Questo manoscritto presenta un protocollo per indurre l’encefalomielite autoimmune sperimentale attiva (EAE) nei topi. Viene inoltre presentato un metodo per l’isolamento e la caratterizzazione dei linfociti infiltrati nel sistema nervoso centrale (CNS) per mostrare come i linfociti siano coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del SNC.
Abstract
La sclerosi multipla (MS) è una malattia autoimmune del sistema nervoso centrale (SNC) causata dalla combinazione di fattori ambientali e background genetico suscettibile. L’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello tipico di malattia della SM ampiamente utilizzato per studiare la patogenesi in cui i linfociti T specifici per gli antigeni della mielina avviano una reazione infiammatoria nel SNC. È molto importante valutare come i linfociti nel SNC regolano lo sviluppo della malattia. Tuttavia, l’approccio per misurare la quantità e la qualità dei linfociti infiltrati nel SNC è molto limitato a causa delle difficoltà nell’isolare e rilevare i linfociti infiltrati dal cervello. Questo manoscritto presenta un protocollo per che è utile per l’isolamento, l’identificazione e la caratterizzazione dei linfociti infiltrati dal SNC e sarà utile per la nostra comprensione di come i linfociti sono coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del SNC.
Introduction
Come una malattia cronica demistelinating del SNC, MS colpisce circa 2,5 milioni di persone in tutto il mondo e manca di trattamenti curativi1. È anche considerata una malattia autoimmune, in cui i linfociti T specifici dell’antigene mielina avviano una reazione infiammatoria e portano alla demelinazione e alle lesioni assonali nel SNC2. L’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è stata ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi patogeni della SM come un classico modello di malattia di demyelination autoimmune in CNS3. Ci sono due modi per indurre EAE: uno è quello di indurre EAE attivamente immunizzando gli animali con componenti mielin, un altro è il trasferimento adottivo trasferendo le cellule T encefalogeniche nelrecettore 2,4,5. Le suscettibilità a EAE sono diverse in diversi ceppi animali6. Nei topi C57BL/6, la glicoproteina mielina oligodendrocite (MOG) 35-55 induce una malattia monofasica con estatissima demelinazione e infiammazione nel SNC, che viene spesso utilizzata negli esperimenti con topi gene-mirati7.
La generazione di cellule T reattive specifiche della mielina è necessaria per l’insorgenza e lo sviluppo della malattia nell’EAE ed è un segno immunologico sia di EAE che di SM. I linfociti T autoreattivi attivati attraversano la barriera ematica del cervello (BBB) nel SNC sano e avviano la malattia EAE. Quando si incontra MOG 35-55 Ag, questi linfociti T inducono infiammazione e il reclutamento di cellule estruse nel SNC, con conseguente demielinazione e distruzione dell’assone8,9. Nel modello EAE, ci sono ampie prove che le cellule CD4 specifiche del neuroantigenopossono avviare e sostenere la neuroinfiammazione e lapatologia 3,10. A seconda delle principali citochine prodotte, i linfocitiCD4 e T sono stati classificati in diversi sottoinsiemi: Th1 (caratterizzato dalla produzione di interferone-γ), Th2 (caratterizzato dalla produzione di interleuchina 4) e Th17 (caratterizzato dalla produzione di interleuchina 17). Si ritiene che l’attivazione delle cellule Th1 e Th17 contribuisca all’induzione, al mantenimento e alla regolazione della demistelinazione infiammatoria in EAE e MS secernendo le citochine effettore IFN-γ e IL-17, che sono in grado di attivare macrofagi e reclutare neutroni nei siti infiammatori per accelerare le lesioni11.
Poiché le cellule T autoreattive attraversano il BBB nel SNC e inducono lo sviluppo della malattia nella SM e nell’EAE, è molto importante analizzare le cellule T nel SNC. Tuttavia, ci sono pochissimi protocolli stabiliti per l’isolamento dei linfociti dal CNS12. Pertanto, è stato sviluppato un metodo ottimizzato per isolare le cellule mononucleari dal cervello e analizzare i linfociti T con marcatori CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g e IL-17 per la citometria di flusso. Il metodo utilizza MOG35-55 adiuvante Mycobacterium tuberculosis H37 Ra e Pertussis Toxin Working Solution (PTX) per indurre un modello di immunizzazione attiva di EAE nei topi. Quindi, i metodi di separazione meccanica e di centrifugazione del gradiente di densità vengono utilizzati per l’isolamento delle cellule mononucleari CNS. Infine, viene utilizzata una strategia ottimizzata di gating della citometria del flusso per identificare i linfociti T e i sottoinsiemi dal cervello colorando più marcatori.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio presenta un protocollo per indurre e monitorare l’EAE utilizzando MOG35-55 nei topi C57BL/6, che sono considerati un tipico modello animale sperimentale neuroimmunico della MS. Ad esempio, l’uso di peptidi PLP139–151 nei topi SJL può indurre un corso di malattia EAE recidivante che è particolarmente adatto per valutare gli effetti terapeutici sulle ricadute15. La procedura sperimentale qui descritta può essere applicata anche ad altri protocolli EAE7. In …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dalla sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (31570921 a ,J, 81571533 a LS), dalla Commissione Municipale di Pianificazione Della Salute di Shanghai e dalla Pianificazione Familiare (201540206 a J), dalla sovvenzione per la ricerca del Ruijin Hospital North (dal 2017 alla J).
Materials
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
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