Summary

Flöde Cytometric Analys av lymfocyt infiltration i centrala nervsystemet under experimentell autoimmun encefalomyelit

Published: November 17, 2020
doi:

Summary

Detta manuskript presenterar ett protokoll för att inducera aktiva experimentella autoimmuna encefalomyelit (EAE) i möss. En metod för isolering och karakterisering av de infiltrerade lymfocyterna i centrala nervsystemet (CNS) presenteras också för att visa hur lymfocyter är involverade i utvecklingen av CNS autoimmun sjukdom.

Abstract

Multipel skleros (MS) är en autoimmun sjukdom i centrala nervsystemet (CNS) som orsakas av kombinationen av miljöfaktorer och mottaglig genetisk bakgrund. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en typisk sjukdom modell av MS används allmänt för att undersöka patogenesen i vilka T-lymfocyter specifika för myelin antigener initiera en inflammatorisk reaktion i CNS. Det är mycket viktigt att bedöma hur lymfocyter i CNS reglerar utvecklingen av sjukdom. Men tillvägagångssättet för att mäta kvantitet och kvalitet av infiltrerade lymfocyter i CNS är mycket begränsad på grund av svårigheterna att isolera och upptäcka infiltrerade lymfocyter från hjärnan. Detta manuskript presenterar ett protokoll för som är användbart för isolering, identifiering och karakterisering av infiltrerade lymfocyter från CNS och kommer att vara till hjälp för vår förståelse av hur lymfocyter är inblandade i utvecklingen av CNS autoimmun sjukdom.

Introduction

Som en kronisk demyelinating sjukdom i CNS, MS drabbar cirka 2,5 miljoner människor över hela världen och saknar botande behandlingar1. Det anses också vara en autoimmun sjukdom, där myelin antigen specifika T-lymfocyter initiera en inflammatorisk reaktion och leda till demyelination och axonal skada i CNS2. Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) har använts i stor utsträckning för att undersöka patogena mekanismer av MS som en klassisk autoimmun demyelination sjukdom modell i CNS3. Det finns två sätt att inducera EAE: ett är att inducera EAE aktivt genom att immunisera djur med myelinkomponenter, en annan är adoptivöverföring genom att överföra encefalitogena T-celler till receptor2,4,5. Mottagligheterna för EAE är olika i olika djurstammar6. Hos C57BL/6-möss inducerar myelinoligodendrocyte glykoprotein (MOG) 35–55-utmaning en monofasisk sjukdom med omfattande demyelination och inflammation i CNS, som ofta används i försök med geninriktade möss7.

Genereringen av myelinspecifika reaktiva T-celler krävs för förekomst och utveckling av sjukdom i EAE och är ett immunologiskt tecken på både EAE och MS. Aktiverade autoreaktiva T-lymfocyter korsar blodhjärnbarriären (BBB) i den friska CNS och initierar EAE-sjukdomen. När MOG 35–55 Ag påträffas framkallar dessa T-lymfocyter inflammation och rekrytering av effektorceller till CNS, vilket resulterar i demyelination och axonförstörelse8,9. I EAE-modellen finns det gott om bevis för att neuroantigenspecifika CD4+ T-celler kan initiera och upprätthålla neuroinflammation och patologi3,10. Beroende på de stora cytokiner som produceras, CD4+ T-lymfocyter har klassificerats i olika delmängder: Th1 (kännetecknas av produktion av interferon-γ), Th2 (kännetecknas av produktion av interleukin 4), och Th17 (kännetecknas av produktion av interleukin 17). Man tror att aktivering av Th1 och Th17 celler bidrar till induktion, underhåll, och reglering av inflammatorisk demyelination i EAE och MS genom att utsöndra effektor cytokiner IFN-γ och IL-17, som är i stånd att aktivera makrofager och rekrytera neutrofiler till de inflammatoriska platserna för att påskynda de skador11.

Eftersom autoreaktiva T-celler korsar BBB i CNS och inducerar utvecklingen av sjukdom i MS och EAE, är det mycket viktigt att analysera T-celler i CNS. Det finns dock mycket få etablerade protokoll för isolering av lymfocyter från CNS12. Därför utvecklades en metod som är optimerad för att isolera mononukleära celler från hjärnan och analysera T-lymfocyter med markörerna CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g och IL-17 för flödescytometri. Metoden använder MOG35– 55 adjuvant Mycobacterium tuberculosis H37 Ra och Pertussis Toxin Working Solution (PTX) för att inducera en aktiv immuniseringsmodell av EAE hos möss. Därefter används mekaniska separations- och densitetsgradientcentrifugationsmetoder för isolering av CNS mononukleära celler. Slutligen används en optimerad flödescytometri gating strategi för att identifiera T-lymfocyter och delmängder från hjärnan genom färgning av flera markörer.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av djurkommittén vid School of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University. 1. Beredning av materialen Använd MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK-sekvensen av MOG35–55 för att erhålla den lyofilaterade peptiden från kommersiella källor. Se till att peptidens renhet är >95%. Bered 10 mg/mL MOG-stamlösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och förvara vid -20 °C. Bered en 4 mg/mL stamlösning av M. tuberkulos H37 …

Representative Results

Efter immunisering av C57BL/6 möss, var alla möss vägas, undersökts och graderas dagligen för neurologiska tecken. Den representativa kliniska kursen för EAE bör resultera i en sjukdomskurva som presenteras i figur 2A och en förändring av kroppsvikten i musen som presenteras i figur 2B. C57BL/6-möss som immuniserats med MOG35-55 började vanligtvis utveckla sjukdomssymptom runt dag 10–12 och uppnådde toppen av sjukdom omkring dag 15–21 efter aktiv…

Discussion

Denna studie presenterar ett protokoll för att inducera och övervaka EAE med hjälp av MOG35-55 i C57BL/6 möss, som anses vara en typisk neuroimmunological experimentella djur modell av MS. EAE kan induceras varierande möss stammar eller vilken typ av protein som används för induktion enligt syftet med studien. Till exempel, med hjälp av PLP139–151 peptid i SJL möss kan framkalla en skovledslöpande EAE sjukdomsförloppet som är särskilt väl lämpad för att bedöma terapeutiska effekter på skov<sup class="…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning stöddes av National Natural Science Foundation of China grant (31570921 till ZJ, 81571533 till LS), Shanghai Municipal Commission of Health, and Family Planning (201540206 till ZJ), Ruijin Hospital North research grant (2017ZX01 till ZJ).

Materials

Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 eBioscience 56-0454-82
Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block BioLegend 101302
APC anti-mouse IFN-g eBioscience 17-7311-82
BD LSRFortessa X-20 BD
Dounce homogenizer Wheaton 353107542
eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) eBioscience 00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set eBioscience 88-8824-00
FITC anti-mouse CD3 BioLegend 100203
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400605
Freund's Adjuvant Complete (CFA) Sigma-Aldrich F5881
Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience eBioscience 56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra Difco Laboratories 231141
PE anti-mouse IL-17A eBioscience 12-7177-81
PE/Cy7 anti-mouse CD4 BioLegend 100422
PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400617
Percoll GE 17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b BioLegend 101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400631
pertussis toxin (PTX) Sigma-Aldrich P-2980
Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience eBioscience 17-4301-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience eBioscience 12-4321-80
Rat MOG35–55 peptides Biosynth International MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

References

  1. Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
  2. Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
  3. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
  4. Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
  5. Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
  6. Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
  7. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  8. Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
  9. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
  10. McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
  11. Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
  12. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
  13. Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
  14. Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
  15. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
  16. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).
  17. Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).

Play Video

Cite This Article
Ji, Z., Zhou, C., Niu, H., Wang, J., Shen, L. Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (165), e61050, doi:10.3791/61050 (2020).

View Video