Summary
Målet er at fraktionere og isolere bioaktive små molekyler, peptider fra et komplekst planteekstrakt og proteiner fra patogene mikrober ved at anvende isoelektrisk væskefasemålingsmetode (IEF). Endvidere blev de adskilte molekyler identificeret og deres bioaktivitet bekræftet.
Abstract
Naturlige produkter fremstillet af planter og mikrober er en rig kilde til bioaktive molekyler. Før de anvendes, skal de aktive molekyler fra komplekse ekstrakter renses til downstream applikationer. Der er forskellige kromatografiske metoder til rådighed til dette formål, men ikke alle laboratorier har råd til højtydende metoder og isolation fra komplekse biologiske prøver kan være svært. Her viser vi, at prærativ isoelektrisk fokusering i væskefase (IEF) kan adskille molekyler, herunder små molekyler og peptider fra komplekse planteekstrakter, baseret på deres isoelektriske punkter (pI). Vi har brugt metoden til kompleks biologisk prøvefraktionering og karakterisering. Som et proof of concept, vi fraktioneret en Gymnema sylvestre planteekstrakt, isolere en familie af terpenoid saponin små molekyler og et peptid. Vi har også vist effektiv mikrobiel proteinadskillelse ved hjælp af Candida albicans-svampen som modelsystem.
Introduction
Rensning af biomolekyler fra komplekse biologiske prøver er et væsentligt og ofte vanskeligt skridt i biologiske forsøg1. Isoelektrisk fokusering (IEF) er velegnet til høj opløsning adskillelse af komplekse biomolekyler, hvor bæreampholytter rejser i henhold til deres ladning og etablere pH gradient i et elektrisk felt3. Den første kommercielle bærende ampholyte til IEF blev udviklet af Olof Vesterberg i 1964 og patenteret4,5. Carrier ampholytes er alifatiske oligo-amino oligo-carboxylic syre molekyler af varierende længde og forgrening6. Efterfølgende forbedrede Vesterberg og andre bæreampholytterne til deres udvidede anvendelse ved adskillelse af biomolekyler6,7.
Metoder til at adskille biomolekyler omfatter agarose og polyacrylamide gel elektroforese, to-dimensionel gel elektroforese (2-DE), isoelektrisk fokusering, kapillær elektroforese, isotachophoresis og andre kromatografiske teknikker (f.eks TLC, FPLC, HPLC)2. Flydende fase IEF udført i et instrument kaldet en "Rotofor" blev opfundet af Milan Bier8. Han var pioner inden for konceptet og designet af dette instrument og bidrog i udstrakt grad til teorien om elektroforetisk migration. Hans team også udviklet en matematisk model af elektroforetisk adskillelse proces forcomputersimuleringer 9.
IEF-apparatet i væskefasen er en vandret roterende cylindrisk celle bestående af en nylonkerne opdelt i 20 porøse rum og en cirkulerende keramisk jernstang. De porøse kamre gør det muligt for molekyler at migrere gennem den vandige fase mellem elektroderne og tillade indsamling af rensede prøver under vakuum i fraktioner. Dette rensningssystem kan give op til 1000-fold rensning af et bestemt molekyle i <4 timer. Et værdifuldt træk ved dette instrument er, at det kan anvendes som et første skridt til rensning fra en kompleks blanding eller som et sidste skridt for at opnå renhed10. Hvis molekylet af interesse er et protein, en anden fordel er, at dens oprindelige kropsbygning vil blive opretholdt under adskillelsen.
Brugen af væskefase-IEF er blevet rapporteret bredt for proteiner , enzymer og antistofrensning6,10,11,12,13,14. Her beskriver vi brugen af denne fremgangsmåde til adskillelse og rensning af små molekyler og peptider fra den medicinske plante Gymnema sylvestre. Denne protokol vil hjælpe forskere koncentrere og rense aktive små molekyler fra en plante ekstrakt til downstream applikationer til lave omkostninger. Derudover viser vi også, at berigelse af proteiner fra et komplekst proteinekstrakt fra Candida albicans-svampe 15 i dette IEF-baserede system som et andet eksempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opsætning og forudafkørsel af standard ief-enhed for flydende fase
- Samling af væskefase-IEF-elektroderne (anoderød knap og katodesort knap) med deres respektive udvekslingsmembraner i henhold til brugsanvisningen (se Tabel over Materialer). Anionbyttermembranerne ekvilibrer med 0,1 M NaOH og kationbyttermembranerne med 0,1 M H3PO4 i mindst 16 timer, når der anvendes nye membraner.
- Membranerne opbevares i elektrolytter (0,1 M NaOH eller 0,1 M H3PO4) mellem kørslerne, og lad dem ikke tørre ud.
- Saml den indre og ydre del af elektroden ved at justere tre aflange huller i ion-udveksling pakninger. Fyld elektroderne med henholdsvis elektrolytter (~25-30 ml) for at forhindre, at membranerne tørrer ud.
- Tilsæt ikke overskydende elektrolyt (mere end 1/3rd elektrodekammervolumen), der kan opbygge tryk inde i elektroden og forårsage lækage.
- Prøveopsamlingsportene dækkes med tætningstape, der følger med instrumentsamlingsdelene(se Tabel over Materialer ). Prøveopsamlingsportene kan identificeres ved de to lodrette metaljusteringsstifter. Alternativt kan du bruge standard tætningstape til at forsegle portene.
- Saml alle dele af fokuskammerets samling i rækkefølge (anodelektrode, nylonmembrankerne, fokuskammer og katodeelektrode) over den keramiske kølefinger.
- Fokuskammeret fyldes med forkølet destilleret vand (et samlet volumen på 60 ml for standard-IEF-cellen) med en 50 ml sprøjte.
- Tilslut det flydende fase-IEF-instrument til et cirkulerende kølevand ved 4 ºC, og enheden forløbes ved 15 W og 3.000 V i 3-5 minutter, eller indtil spændingen stabiliseres.
BEMÆRK: Inden for et minut når spændingen generelt op på de maksimale indstillede værdier. Prerunning med destilleret vand hjælper med at fjerne de resterende ioner fra fokuskammeret og nylonmembrankernen. - Sluk for strømkilden, og fjern vandet fra cellen ved hjælp af fraktionsopsamleren. Forsegle opsamlingsportene igen med tætningstape.
BEMÆRK: Nu er instrumentet klar til brug i trin 2.4.
2. Separation og rensning af små molekyler og peptider fra Gymnema sylvestre ekstrakt
- 0,6 g planteekstrakt måles, og der opløses i destilleret vand (60 ml) ved blanding i et rullerør i 5 min.
BEMÆRK: Enhver biologisk prøve, der er opløselig og fri for salt, kan anvendes til separation og rensning ved hjælp af dette IEF-instrument. Prøver med buffering saltkoncentration op til 10 mM kan anvendes med let nedsat opløsning. Vi er interesseret i saponin familien af triterpenoid forbindelser, gymnemic syrer, fra G. sylvestre plante for deres unikke svampedræbe egenskaber16. - Centrifuger det opløselige planteekstrakt ved 10.000 x g i 5 min for at fjerne uopløselige partikler.
- Overfør supernatanten (~60 ml) til et centrifugerør på 80 ml, og bland det med 0,6 ml ampholyt (pH 3-10) til 1% (v/v).
- Følg trin 1.1 – 1.7 for at klargøre den flydende fase IEF-enhed. Kammeret er nu klar til at lægge prøven i.
- Brug en 50 ml sprøjte med en 1-1/2 tommer 19 G stump endenål (leveres med instrumentet) og læg den forberedte prøve med ampholyte (60 ml total) i cellen gennem prøveopsamlingsportene.
- Fjern luftbobler fra prøvecellen ved at fjerne fokuscellen fra stativet og trykke på elektrodekammeret for at løsne boblerne. Tilstedeværelsen af luftbobler vil forårsage spænding og strømudsving og påvirke kørslen.
- Enheden tilsluttes vandkølevæsken (4 °C) og fraktioneres med strømforsyningen ved konstant 15 W.
- Apparatet køres i 3 timer, eller indtil spændingen når en konstant værdi.
BEMÆRK: Når prøven begynder at fokusere, begynder spændingen at stige gradvist, indtil den når en konstant værdi. - Efter løbet forberedes til at samle fraktionerne i høstboksen (indeholdende 20 plastrør, 12 mm x 75 mm, 5-6 ml volumen) forbundet til vakuumpumpen ved at trykke på høstknappen ON i IEF-enheden.
- Juster de 20-samling stifter med 20-indsamling porte fokus celle, der er forseglet med båndet.
- Skub opsamlingsstifterne gennem tætningstapen, og tænd for vakuumpumpen samtidigt (se figur 2B, 2C og 2D).
BEMÆRK: Ca. 3 ml fraktioner fra hvert kammer vil blive opsamlet i rørene for hver gang. Brøker kan anvendes til efterfølgende downstream-applikationer (SDS-PAGE til peptid kvantificering, TLC og bioassay for små molekyler).
3. Adskillelse og rensning af proteiner fra C. albicans
- En enkelt koloni af C. albicans vokse i gær-peptone-dextrose (YPD) bouillon16 ved 30 °C med omrystning (200 rpm) for natten over.
- Gærcellerne opsamles ved centrifugering (10.000 x g i 5 min).
- C. albicans gærceller i ammoniumcarbonat (1,89 g/l) buffer, der indeholder 1% (v/v) beta-mercaptoethanol (β-ME) (1/10th af dyrkningsvolumen) og roteres i et rulleslange i 1 time ved 5 °C15.
- Gærcellerne fjernes ved centrifugering (10.000 x g i 5 min), og proteinekstraktet filtreres gennem et 0,45 μm-filter.
BEMÆRK: Proteinprøver fra C. albicans cytosol, membran eller cellevæg kan fremstilles og anvendes til IEF-fraktionering. På samme måde kan proteiner fra bakterier eller andre biologiske prøver (animalsk vævsekstrakt) anvendes efter fjernelse af salt ved hjælp af passende metoder (f.eks.ved dialyse eller ved hjælp af afsaltningskolonner). - Proteinekstraktet dialyses i en dialyseslange (3.500 MWCO) mod vand i 15 timer ved 4 °C. Proteinkoncentrationen estimeres efter Bradford-farvebindingsmetoden ved hjælp af gammaglobulin som standard17.
- Brug 500 mg totalprotein i 60 ml vand indeholdende 1% (v/v) ampholyt (pH 5-8) til fraktioneringen.
BEMÆRK: Da en bred vifte ampholyte (pH 3-10) ikke berige visse ikke-glucan fastgjortcellevæg proteiner af C. albicans godt, bruge en smal-range (pH 5-8) ampholyt. Der kan anvendes en ampholytkoncentration på op til 2 %, hvis koncentrationen af prøveproteinindhold er på over 2 mg/ml. dette minimerer proteinsammenlægning under fokusering. Opbevar altid prøverne, ampholytter og vand forkølet på is. - Gentag trin 1.1- 1.7 for at klargøre IEF-enheden og bruge proteinopløsningen fra trin 3.6 til at lægge ind i IEF-cellen.
- Efter 4 timer med fokus på en konstant 15 W høstes proteinfraktioner (1-20) som beskrevet ovenfor (trin 2.9-2.11) og analyseres på 12,5% SDS-PAGE efter reduktion og kogning af proteinprøverne18.
- Plette de forløste proteiner ved at farve SDS-PAGE gel med Coomassie blå farvestof (0,01%) opløsning til 2-3 timer ved stuetemperatur på en rocker. Destain gelen og optag gel billedet ved hjælp af en gel imager.
BEMÆRK: Coomassie blå farvestof (0,01%) kan fremstilles ved at blande 0,01 g Coomassie blå pulver i en afstaining opløsning, der indeholder 40% methanol og 10% eddikesyre.
4. Bioaktivitet af renset små molekyler fra planteekstrakt Gymnema sylvestre
- Dyrk C. albicans i gærceller som i trin 3.1.
- For at forberede celle suspension, fortyndes natten kultur C. albicans gær celler (1/1000 fortynding) i en frisk RPMI cellekultur medium suppleret med 50 mM glukose.
BEMÆRK: C. albicans konverterer fra gærvækst til hyphae under hyphal inducerende forhold (RPMI ved 37 °C). Gymnemic syre små molekyler har vist sig at hæmme omdannelsen af gær celler til hyphae under hypha inducerende betingelser16. Vi havde til formål at afgøre, om væske-fase-IEF-adskilt G. sylvestre ekstrakt indeholder disse bioaktive molekyler. - Fra den forberedte cellesuspension tilsættes 90 μL til hver brønd på 96-brøndpladen.
- Fra hver fraktion (1-20 høstede fraktioner af G. sylvestreekstrakt fra flydende fase IEF, figur 4), tilsættes 10 μL i brøndene med 90 μL af ovennævnte cellesuspension (trin 4.2). Udfør analysen i tre eksemplarer.
- Tilsæt 10 μL vand, der indeholder ampholyt (1%) i separate brønde med 90 μL C. albicans gærcellesuspension som en negativ kontrol.
BEMÆRK: Ampholytes har bioaktivitet potentiale, og så er det vigtigt at medtage en ampholyte kontrol, mens du udfører en bioassay19. - 96-brøndpladen inkuberes ved 37 °C i 12 timer, og hæmning af C. albicans gær-til-hypha-omdannelse under mikroskop16. Også bestemme procentdelen af hæmning af gær-til-hypha konvertering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Separation og rensning af små molekyler og peptider fra Gymnema sylvestre planteekstrakt
Ved hjælp af den præformative væskefase IEF-metode fraktionerede vi lægemiddelplanteekstrakter og celleoverfladeproteiner fra en human patogen svamp, C. albicans. Der vises en skematisk af disse fraktioneringsprotokoller i figur 1.
Fra 20 fraktioner af G. sylvestre ekstrakt fremstillet af flydende fase IEF, de mørke-farvede molekyler (terpenoide saponiner) blev fundet at migrere og blive beriget i anode ende (pH 2-3) og lys-gul klare fraktioner blev observeret i katode ende (pH 8-9) (Figur 2). Aliquots (20 μL) fra hver fraktion (1-20) blev forã ̧rt udstà ̧rt på 15% SDS-PAGE efter at have reduceret og kogt prøverne. En Coomassie blå-farvede gel viser den spredte polypeptid bånd på omkring 5 kDa, der er beriget i fraktioner 16-19 (Figur 3). Det er blevet rapporteret, at G. sylvestre planten indeholder en 35 aminosyre gurmarin grundlæggende polypeptid med den forventede molekylvægt på 4,209 Da20. Bakterier, planter og dyr indeholder peptider; mange af dem er cirkulære (knudiner) og stabile med en bred vifte af biologiske aktiviteter såsom insektdræbende og antimikrobielle egenskaber21,22.
Biologisk aktivitet af separerede gymnemiske syrer
G. sylvestre-anlægget indeholder også gymnemiske syrer (terpenoide saponiner) som hovedbestanddele16,23,24. Som forventet blev disse små molekyler i fraktion 1 og de næste par fraktioner ikke opdaget af SDS-PAGE og Coomassie farvning (Figur 3),da de er ikke-proteinholdige. Men disse små molekyler kan adskilles af TLC og detekteres under UV-lys (Figur 4A, lane F1). Fraktion 10 indeholdt ikke en påviselig mængde af disse små molekyler på TLC, hvilket tyder på, at de fleste af de organiske små molekyler blev beriget i fraktioner 1-3. Gymnemic syrer (GAs) molekyler viste sig at hæmme C. albicans gær-til-hypha overgang16,25. Vi assayed alle 20 fraktioner indsamlet i denne undersøgelse for deres hæmmende aktivitet mod C. albicans gær-til-hypha konvertering og hyphal vækst16. Resultaterne er vist i figur 4B,4C. Den højeste aktivitet observeres i fraktion 1, som er i overensstemmelse med TLC-resultaterne, hvor der kan ses flere pletter. Isomerer af gymnemic syrer findes, og alle har lignende biologiske aktiviteter10. Disse isomerer blev adskilt i fraktion 1-3 og viser hæmning af C. albicans hyphal vækst (Figur 4A,4C, fraktion 1). Graden af hyphal hæmning blev gradvist nedsat, da det går fra 1 til 10. Der blev kun opnået ringe eller ingen aktivitet i 10 og derover.
Adskillelse af celleoverfladeproteiner fra patogen svamp, C. albicans
Resultater fra væskefase-IEF-fraktionering af C. albicanscelleoverfladeproteiner er vist i figur 5. Disse celleoverfladeproteiner spiller en vigtig rolle i C. albicansadhæsion og patogenese26. Flere berigede proteiner (pile) i forskellige fraktioner blev observeret. Dette kan gøre det muligt at identificere deres immunologiske reaktioner med Candida-inficeret humant serum og/eller deres identifikation ved massespektrometri. På samme måde kan proteiner fra andre cellulære fraktioner (f.eks. cytoplasma og cellevæg) fraktioneres ved hjælp af denne IEF-metode. Den væskefasende IEF-baserede rensning vil gøre det muligt at identificere proteiner med lav forekomst fra komplekse biologiske prøver, når den kombineres med massespektrometrianalyse.
Figur 1: Rutediagram, der viser den eksperimentelle arbejdsproces. Trinvise procedurer for iefraktioner i fase og efterfølgende downstream-analyser er afbildet. Prøverne omfatter Gymnema sylvestre bladekstrakt (prøve 1) og Candida albicans non-glucan vedhæftet gær proteiner (prøve 2). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Opsætning og fraktionering af G. sylvestre planteekstrakt i flydende fase. (A) Under kørslen (B) under opsamling af fraktioner , (C) efter opsamling af fraktioner og (D)dele af IEF-apparater i flydende fase, 1) ionbyttermembraner, 2) fokuskammer og membrankerne, 3) elektrodesamling (negativ), 4) elektrodesamling (positiv). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: SDS-PAGE-separationer af de IEF-fokuserede planteekstraktfraktioner. L- stige, PC- Positiv kontrol (peptid), 0 - input prøve, 1-20 adskilte fraktioner. SDS-PAGE (15% opløsning gel) blev plettet af Coomassie blå farvestof til at visualisere de forløste peptider (~ 5 kDa) fra fraktioner 1-20. Fraktioner 1-3 indeholder små molekyler (fraktion 1 har mørkere farve, der angiver berigede forbindelser), som ikke kan farves / detekteres af Coomassie blå farvestof. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Analyse af IEF fraktioneret små molekyler ved TLC og bestemmelse af bioaktivitet mod C. albicans. (A) Viser TLC-analyse af små molekyler fra fraktioneret #1 og #10. Aktiveret silicagelplade blev brugt til at spotte ~5 μL prøver og løb med toluen: chloroform: methanolopløsningsmiddel (forholdet 5:8:3), indtil opløsningsmiddelfronten nåede margenen. TLC adskilte forbindelser blev påvist under en epifluorescence UV-lys (310 nm). (B) Viser % hæmning af C. albicans gær-til-hypha konvertering af forskellige fraktioner. (C) Demonstrerer celle morfologi af C. albicans under hypha inducerende betingelser. Brøk #1 viser maksimum (98%) hæmning af gær-til-hypha konvertering. Andre fraktioner og kontroller viser ingen hæmning af C. albicans hyphal vækst efter 12 timers inkubation ved 37 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: SDS-PAGE analyse af C. albicans celleoverflade proteiner (ikke-glucan fastgjort). L- stige, 0 - input prøve, 1-18 fraktioner indsamlet efter IEF i en standard flydende fase IEF celle ved hjælp af et smalt område (pH 5-8) ampholyt. Billedet viser SDS-PAGE (12.5%) forsvandt proteiner efter farvning med Coomassie blå farvestof. Flere proteiner blev beriget i visse fraktioner (pile). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Små molekyler fra naturlige produktkilder (f.eks. planter) omfatter komplekse sekundære metabolitter, der er meget forskellige i kemisk struktur. De menes at være involveret i anlægget forsvarsmekanismer. Desuden er polypeptider også til stede i plantevæv22. Disse naturlige produkt små molekyler er rige kilder til test molekyler til opdagelse og udvikling af lægemidler. Men de vanskelige og kedelige metoder, der kræves for deres isolation og rensning begrænse deres anvendelse til terapeutiske anvendelser. Den væskefase-IEF-tilgang, der anvendes i denne rapport, fremhæver evnen til at adskille disse små molekyler og polypeptider uden at gå på kompromis med deres bioaktiviteter.
Denne IEF-baserede metode giver flere fordele ved at adskille biologiske molekyler, herunder koncentration af rensede proteiner fra en kompleks blanding, vedligeholdelse af native conformation under og efter deres fokusering og indsamling af prøver som individuelle rensede fraktioner uden krydskontaminering. Når det er nødvendigt, kan prøverne re-fokuseres med et smalt pH-område for at rense proteinisoformer. Da en miniature IEF fokus celle (~ 15 ml) er tilgængelig, kan det bruges til mindre mængder af prøver samt. Det nye resultat af denne rapport er, at organiske små molekyler og peptider kan adskilles fra et komplekst planteekstrakt. Selv om det er vanskeligt at blive enige om, at små molekyler kan adskilles fra naturlige produktekstrakter af IEF, det er plausibelt for de forbindelser, der er amphoteric. De gymnemiske syrer, der blev adskilt fra gurmarin peptid i G. sylvestre ekstrakt synes at være amphoteric som de indeholder en carboxylic syre gruppe eller de opfører sig så i det mindste i overværelse af ampholyt anvendes. Da glycosider er bioaktive naturlige molekyler, der ligner gymnemic syrer, kan IEF-metoden bruges til at adskille dem fra komplekse naturlige kilder. På samme måde kan peptider fra naturlige produkter også isoleres ved hjælp af denne væskefase-IEF-tilgang.
Nogle af begrænsningerne i denne fremgangsmåde er, at ikke alle små molekyler kan fraktioneres ved IEF-metoden, da de skal være vandopløselige og svagt amphoteric, i det mindste. Ekstraktet, der anvendes her, blev fremstillet af en 50% methanolekstraktion af tørret plantemateriale, men er vandopløseligt. Anvendelsen af IEF-metoden til opløsningsmiddelopløselige og amphoteriske forbindelser er endnu ikke blevet set, da nogle af de organiske opløsningsmidler er uforenelige med ief-instrumentkomponenterne i væskefasen. Tendensen af proteiner til at udfælde på deres isoelektriske punkter (pI) i lav ionstyrke løsninger er velkendt. I et roterende IEF-system reduceres proteinnedfældningen imidlertid, da de fokuserede proteiner forbliver i omløb på deres pI-punkt.
Hvis man bruger en høj koncentration af proteiner i denne IEF-adskillelse, kan der forekomme udfældning. For at minimere proteinudfældning og forbedre proteinmåletilstanden kan urinstof bruges op til 3-5 M. Nonioniske rengøringsmidler såsom CHAPS, digitonin og lav koncentration af vaskemidler (0,1-1%) kan også bruges til at reducere proteinsammenlægning under IEF. Urinstof og rengøringsmidler skal dog fjernes, før proteinerne analyseres for deres aktivitet, og i nogle tilfælde kan disse stoffer påvirke proteinfunktionerne. Et par kritiske trin til at overveje i løbet af en flydende fase IEF køre omfatter lastning IEF fokus celle uden luftbobler, udskiftning af ion udveksling membraner, hvis de blev beskadiget, og udskiftning af udluftningsknapper efter et vist antal gentagne anvendelser.
Afslutningsvis, ved hjælp af den flydende fase IEF metode, har vi vist adskillelse af bioaktive gymnemic syrer og gurmarin polypeptid fra G. sylvestre blad ekstrakt. Endvidere kan flydende fase IEF være nyttigt at berige selektive proteiner fra de komplekse rå ekstrakter af patogene mikrober.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne vil gerne erklære ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for de finansieringskilder fra Afdelingen for Biologi og Johnson Cancer Research Center for BRIEF og IRA awards, henholdsvis til GV. Vi takker også K-INBRE postdoc-prisen til RV. Dette arbejde blev delvist støttet af Institutional Development Award (IDeA) fra National Institute of General Medical Sciences ved National Institutes of Health under tilskudsnummer P20 GM103418. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institute of General Medical Sciences eller National Institutes of Health. Vi takker de anonyme korrekturlæsere for deres nyttige kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
References
- Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
- Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins. Proteomes. 5 (1), (2017).
- Stoyanov, A. IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution. Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).
- Vesterberg, O. A. Y. Method of Isoelectric Fractionation. , US3485736A (1964).
- Vesterberg, O., Svensson, H. Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins. Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).
- Righetti, P. G. Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , Elsevier Science. 1 (1983).
- Vesterberg, O. Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes. Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).
- Bier, M. Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis. Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).
- Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation. Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).
- Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure. Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).
- Wagner, L., et al. Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization. Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).
- Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing. Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).
- Yu, J. J., et al. Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice. Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).
- Riyong, D., et al. Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).
- Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins. Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).
- Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans. PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides. Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).
- Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre. Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).
- Craik, D. J. Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends. Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).
- Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).
- Stoecklin, W. Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).
- Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).
- Veerapandian, R., Vediyappan, G. Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms. Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).
- Chaffin, W. L. Candida albicans cell wall proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).
