Summary
Het doel is om bioactieve kleine moleculen, peptiden uit een complex plantenextract en eiwitten uit pathogene microben te fractioneren en te isoleren door gebruik te maken van de isoelectrische focusmethode (IEF) met vloeibare fase. Verder werden de gescheiden moleculen geïdentificeerd en hun bioactiviteit bevestigd.
Abstract
Natuurlijke producten afkomstig van planten en microben zijn een rijke bron van bioactieve moleculen. Voorafgaand aan het gebruik ervan moeten de actieve moleculen uit complexe extracten worden gezuiverd voor downstreamtoepassingen. Er zijn verschillende chromatografische methoden beschikbaar voor dit doel, maar niet alle laboratoria kunnen zich veroorloven high performance methoden en isolatie van complexe biologische monsters kan moeilijk zijn. Hier tonen we aan dat preparatieve vloeibare fase isoelectrische scherpstelling (IEF) moleculen, waaronder kleine moleculen en peptiden uit complexe plantenextracten, kan scheiden op basis van hun isoelectric points (pI). We hebben de methode gebruikt voor complexe biologische monsterfractionering en karakterisering. Als bewijs van concept, hebben we gefractioneerd een Gymnema sylvestre plantenextract, het isoleren van een familie van terpenoïde saponine kleine moleculen en een peptide. We hebben ook aangetoond effectieve microbiële eiwitscheiding met behulp van de Candida albicans schimmel als een model systeem.
Introduction
De zuivering van biomoleculen uit complexe biologische monsters is een essentiële en vaak moeilijke stap in biologische experimenten1. Isoelectric focus (IEF) is zeer geschikt voor hoge resolutie scheiding van complexe biomoleculen waar drager ampholyten reizen volgens hun lading en de pH gradiënt vast te stellen in een elektrisch veld3. De eerste commerciële carrier ampholyte voor IEF werd ontwikkeld door Olof Vesterberg in 1964 en gepatenteerd4,5. Carrier ampholyten zijn aliphatic oligo-amino oligo-carboxylzuur moleculen van verschillende lengte en vertakking6. Vervolgens verbeterden Vesterberg en anderen de drageramorholyten voor hun uitgebreide gebruik bij het scheiden van biomoleculen6,7.
Methoden om biomoleculen te scheiden omvatten agarose en polyacrylamide gel elektroforese, tweedimensionale gel elektroforese (2-DE), isoelectrische scherpstelling, capillaire elektroforese, isotachophoresis en andere chromatografische technieken (bijvoorbeeld TLC, FPLC, HPLC)2. Vloeibare fase IEF uitgevoerd in een instrument genaamd een "Rotofor" werd uitgevonden door Milan Bier8. Hij was pionier in het concept en ontwerp van dit instrument en droeg uitgebreid bij aan de theorie van elektroforetische migratie. Zijn team ontwikkelde ook een wiskundig model van elektroforetisch scheidingsproces voor computersimulaties9.
Het IEF-apparaat met vloeibare fase is een horizontaal roterende cilindrische cel bestaande uit een nylon kern verdeeld in 20 poreuze compartimenten en een circulerende waterkoelende keramische staaf. De poreuze kamers laten moleculen toe om door de waterige fase tussen de elektroden te migreren en het verzamelen van gezuiverde monsters onder vacuüm in fracties mogelijk te maken. Dit zuiveringssysteem kan tot 1000-voudige zuivering van een specifiek molecuul in <4 uur verstrekken. Een waardevol kenmerk van dit instrument is dat het kan worden toegepast als een eerste stap voor zuivering van een complex mengsel of als een laatste stap om zuiverheid te bereiken10. Als het molecuul van belang is een eiwit, een ander voordeel is dat de inheemse conformatie zal worden gehandhaafd tijdens de scheiding.
Het gebruik van vloeibare fase IEF is op grote schaal gemeld voor eiwitten, enzymen en antilichaamzuivering6,10,11,12,13,14. Hier beschrijven we het gebruik van deze aanpak voor het scheiden en zuiveren van kleine moleculen en peptiden van de medicinale plant Gymnema sylvestre. Dit protocol zal onderzoekers helpen zich te concentreren en te zuiveren actieve kleine moleculen uit een plantenextract voor downstream-toepassingen tegen lage kosten. Daarnaast tonen we ook aan dat verrijking van eiwitten uit een complex eiwitextract uit Candida albicans schimmel15 in dit IEF-gebaseerde systeem als tweede voorbeeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Installatie en voorbehandeling van de standaard IEF-eenheid met vloeibare fase
- Monteer de vloeistof-fase IEF-elektroden (anode-rode knop en kathode-zwarte knop) met hun respectieve uitwisselingsmembranen volgens de gebruiksaanwijzing (zie Tabel van Materialen). Equilibrate de anion uitwisseling membranen met 0,1 M NaOH en de kation uitwisseling membranen met 0,1 M H3PO4 ten minste voor 16 uur wanneer nieuwe membranen worden gebruikt.
- Bewaar de membranen in elektrolyten (0,1 M NaOH of 0,1 M H3PO4) tussen de pistes en laat niet uitdrogen.
- Monteer het binnenste en buitenste gedeelte van de elektrode door drie langwerpige gaten in de ionenuitwisselingspakkingen uit te lijnen. Vul de elektroden met respectievelijke elektrolyten (~ 25-30 mL) om te voorkomen dat hun membranen uitdrogen.
- Voeg geen overtollige (meer dan 1/3rd elektrodekamervolume) elektrolyt toe dat druk in de elektrode kan opbouwen en lekkage kan veroorzaken.
- Bedek de monsterophaalpoorten met afdichtingstape die bij de onderdelen van de instrumentenassemblage wordt geleverd (zie Tabel met materialen). De monsterverzamelingspoorten kunnen worden geïdentificeerd door de twee verticale metalen uitlijnende pinnen. U ook standaard afdichtingstape gebruiken om de poorten te verzegelen.
- Monteer alle delen van de scherpstelkamerassemblage achter elkaar (anodelektrode, nylon membraankern, scherpstelkamer en kathodeelektrode) over de keramische koelvinger.
- Vul de scherpstelkamer met voorgekoeld gedestilleerd water (totaal volume van 60 mL voor de standaard IEF-cel) met behulp van een spuit van 50 mL.
- Sluit het vloeistoffase IEF-instrument aan op een circulerend koelwater op 4 ºC en pre-stel het apparaat op 15 W en 3.000 V gedurende 3-5 min of totdat de spanning stabiliseert.
OPMERKING: Over het algemeen bereikt de spanning binnen een minuut de maximale ingestelde waarden. Voorlopen met gedestilleerd water helpt om de resterende ionen uit de scherpstelkamer en de nylon membraankern te verwijderen. - Schakel de energiebron uit en verwijder het water uit de cel met behulp van de fractiecollector. Sluit de opvangpoorten opnieuw af met afdichtingstape.
LET OP: Nu is het instrument klaar voor gebruik in stap 2.4.
2. Scheiding en zuivering van kleine moleculen en peptiden uit Gymnema sylvestre extract
- Meet 0,6 g plantenextract en los op in gedestilleerd water (60 mL) door 5 min in een rolbuis te mengen.
OPMERKING: Elk biologisch monster dat oplosbaar en vrij van zout is, kan worden gebruikt voor scheiding en zuivering met behulp van dit IEF-instrument. Monsters met buffering zoutconcentratie tot 10 mM kunnen worden gebruikt met een licht verlaagde resolutie. Wij zijn geïnteresseerd in de saponine familie van triterpenoïde verbindingen, de gymnemic zuren, van G. sylvestre plant voor hun unieke schimmeldodende eigenschappen16. - Centrifugeer het oplosbare plantenextract op 10.000 x g gedurende 5 minuten om onoplosbare deeltjes te verwijderen.
- Breng de supernatant (~60 mL) over naar een centrifugebuis van 80 mL en meng deze met 0,6 mL ampholyt (pH 3-10) tot 1% (v/v).
- Volg de stappen 1.1 – 1.7 om de vloeibare fase IEF-eenheid voor te bereiden. De kamer is nu klaar om het monster te laden.
- Gebruik een 50 mL spuit met een 1-1/2 inch 19 G stompe eindnaald (wordt geleverd met het instrument) en laad het bereide monster met ampholyte (60 mL totaal) in de cel via monster verzameling poorten.
- Verwijder luchtbellen uit de monstercel door de scherpstelcel van de standaard te verwijderen en op de elektrodekamer te tikken om de bellen los te maken. De aanwezigheid van luchtbellen zal spanning en stroomschommelingen veroorzaken en de run beïnvloeden.
- Sluit het apparaat aan op het waterkoelmiddel (4 °C) en start breuk met de voeding bij een constante 15 W.
- Voer het apparaat 3 uur uit of tot de spanning een constante waarde heeft bereikt.
LET OP: Als het monster begint te concentreren, zal de spanning geleidelijk beginnen te klimmen totdat het een constante waarde bereikt. - Bereid u na de run voor op het verzamelen van de fracties in de oogstbox (met 20 kunststof buizen, 12 mm x 75 mm, 5-6 mL volume) aangesloten op de vacuümpomp door op de oogstknop AAN in de IEF-eenheid te drukken.
- Lijn de 20-collectie pinnen af met de 20-collectie poorten van de focuscel die is verzegeld met de tape.
- Duw de inzamelpennen door de afdichtingstape en zet de vacuümpomp tegelijkertijd aan (zie figuur 2B, 2C & 2D).
LET OP: Ongeveer 3 mL fracties van elke kamer zal worden verzameld in de buizen voor elke keer. Breuken kunnen worden gebruikt voor latere downstream toepassingen (SDS-PAGE voor peptide kwantificering, TLC en bioassay voor kleine moleculen).
3. Scheiding en zuivering van eiwitten uit C. albicans
- Kweek enkele kolonie C. albicans in gist-peptone-dextrose (YPD) bouillon16 bij 30 °C met schudden (200 rpm) voor 's nachts.
- Verzamel de gistcellen door centrifugatie (10.000 x g gedurende 5 minuten).
- Sceno. albicans gistcellen in ammoniumcarbonaat (1,89 g/L) met 1% (v/v) bèta-mercaptoethanol (β-ME) (1/10e van het kweekvolume) en draai 1 uur in een rolbuis bij 5 °C15.
- Verwijder de gistcellen door centrifugatie (10.000 x g gedurende 5 minuten) en filtreer het eiwitextract door een filter van 0,45 μm.
OPMERKING: Eiwitmonsters van C. albicans cytosol, membraan of celwand kunnen worden voorbereid en gebruikt voor IEF-fractionatie. Op dezelfde manier kunnen eiwitten uit bacteriën of andere biologische monsters (extract van dierlijk weefsel) worden gebruikt na het verwijderen van zout met behulp van geschikte methoden(bijvoorbeelddoor dialyse of het gebruik van ontziltingskolommen). - Dialyseert het eiwitextract in een dialysebuis (3.500 MWCO) tegen water gedurende 15 uur bij 4 °C. Schat de eiwitconcentratie door de Bradford kleurstofbindende methode met behulp van gamma globulin als een standaard17.
- Gebruik 500 mg totaal eiwit in 60 mL water dat 1% (v/v) ampholyt (pH 5-8) bevat voor de fractionatie.
OPMERKING: Aangezien een breed scala ampholyte (pH 3-10) bepaalde niet-glucan aangesloten celwandeiwitten van C. albicans goed verrijkt, gebruik dan een smal bereik (pH 5-8) ampholyt. Een ampholytconcentratie tot 2% kan worden gebruikt als de eiwitconcentratie van het monster meer dan 2 mg/mL bedraagt; dit minimaliseert eiwitaggregatie tijdens het scherpstellen. Bewaar altijd de monsters, ampholyten en water voorgekoeld op ijs. - Herhaal stap 1.1- 1.7 om de IEF-eenheid voor te bereiden en gebruik de eiwitoplossing van stap 3.6 om in de IEF-cel te laden.
- Na 4 uur focus op een constante 15 W, oogst eiwitfracties (1-20) zoals hierboven beschreven (stappen 2.9-2.11) en analyseer op 12,5% SDS-PAGE na het verminderen en koken van de eiwitmonsters18.
- Bevlek de opgeloste eiwitten door de SDS-PAGE gel te bevlekken met de Coomassie blauwe kleurstof (0,01%) oplossing voor 2-3 uur bij kamertemperatuur op een tuimelschakelaar. Houd de gel vast en neem het gelbeeld op met behulp van een gelafbeelding.
LET OP: Coomassie blauwe kleurstof (0,01%) kan worden bereid door 0,01 g Coomassie blauw poeder te mengen in een destaining oplossing met 40% methanol en 10% azijnzuur.
4. Bioactiviteit van gezuiverde kleine moleculen uit plantenextract Gymnema sylvestre
- Kweek C. albicans in gistcellen zoals in stap 3.1.
- Om celsuspensie voor te bereiden, verdun 's nachts de cultuur van C. albicans gistcellen (1/1000 verdunning) tot een vers RPMI-celkweekmedium aangevuld met 50 mM glucose.
OPMERKING: C. albicans zet van gistgroei naar hyphae onder hyphal inducerende omstandigheden (RPMI bij 37 °C). Gymnemic zuur kleine moleculen worden aangetoond dat de omzetting van gistcellen remmen in hyphae onder hypha inducerende voorwaarden16. We wilden bepalen of vloeistof-fase-IEF-gescheiden G. sylvestre extract deze bioactieve moleculen bevat. - Voeg van de geprepareerde celsuspensie 90 μL toe aan elke put van de 96-putplaat.
- Van elke fractie (1-20 geoogste fracties van G. sylvestre extract verkregen uit vloeibare fase IEF, figuur 4), voeg 10 μL in de putten met 90 μL van de bovenstaande cel suspensie (stap 4.2). Voer de test in drievoud uit.
- Voeg 10 μL water toe dat ampholyt (1%) bevat in afzonderlijke putten met 90 μL C. albicans gistcelsuspensie als negatieve controle.
OPMERKING: Ampholyten hebben bioactiviteitspotentieel en daarom is het essentieel om een ampholyte-controle op te nemen tijdens het uitvoeren van een bioassay19. - Incubeer de 96-put plaat bij 37 °C gedurende 12 uur en observeer de remming van C. albicans gist-op-hypha conversie onder de microscoop16. Bepaal ook het percentage remming van gist-naar-hypha conversie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Scheiding en zuivering van kleine moleculen en peptiden uit Gymnema sylvestre plantenextract
Met behulp van de preparative liquid-phase IEF-methode hebben we medicinale plantenextracten en celoppervlakte-eiwitten gefractioneerd uit een menselijke pathogene schimmel, C. albicans. Een schema van deze fractioneringsprotocollen wordt weergegeven in figuur 1.
Uit 20 fracties van G. sylvestre-extract verkregen uit vloeibare fase IEF bleken de donkergekleurde moleculen (terpenoïde saponines) te migreren en te worden verrijkt aan het anodeeinde (pH 2-3) en werden de lichtgele heldere breuken waargenomen aan het kathodeeinde (pH 8-9) (Figuur 2). Aliquots (20 μL) van elke fractie (1-20) werden opgelost op 15% SDS-PAGE na het verminderen en koken van de monsters. Een Coomassie blauw-gekleurde gel toont de diffuus polypeptide band van ongeveer 5 kDa die is verrijkt met fracties 16-19 (Figuur 3). Er is gemeld dat de G. sylvestre plant bevat een 35 aminozuur gurmarin basis polypeptide met de voorspelde moleculaire gewicht van 4.209 Da20. Bacteriën, planten en dieren bevatten peptiden; velen van hen zijn circulair (knottins) en stabiel met een breed scala aan biologische activiteiten zoals insecticide en antimicrobiële eigenschappen21,22.
Biologische activiteit van gescheiden gymnemic zuren
De G. sylvestre plant bevat ook gymnemic zuren (terpenoïde saponinen) als belangrijke bestanddelen16,23,24. Zoals verwacht, deze kleine moleculen in fractie 1 en de volgende paar fracties werden niet gedetecteerd door SDS-PAGE en Coomassie kleuring (Figuur 3) omdat ze niet-eiwitachtig. Deze kleine moleculen kunnen echter worden gescheiden door TLC en gedetecteerd onder UV-licht(figuur 4A, baan F1). Fractie 10 bevatte geen detecteerbare hoeveelheid van deze kleine moleculen op TLC die suggereerden dat de meeste organische kleine moleculen werden verrijkt in fracties 1-3. Gymnemic zuren (GI's) moleculen bleken te remmen C. albicans gist-naar-hypha overgang16,25. We onderzochten alle 20 fracties verzameld in deze studie voor hun remmende activiteit tegen C. albicans gist-naar-hypha conversie en hyphal groei16. De resultaten worden weergegeven in figuur 4B,4C. De hoogste activiteit wordt waargenomen in fractie 1, die overeenkomt met de TLC-resultaten waar verschillende vlekken kunnen worden gezien. Isomeren van gymnemic zuren bestaan en hebben allemaal soortgelijke biologische activiteiten10. Deze isomeren werden gescheiden in fractie 1-3 en vertonen remming van C. albicans hyphal groei(Figuur 4A,4C, fractie 1). De mate van hyphal remming werd geleidelijk afgenomen als het gaat van 1 tot 10. Weinig of geen activiteit werd verkregen in fracties 10 en hoger.
Scheiding van celoppervlakteeiwitten van pathogene schimmel, C. albicans
Resultaten van vloeibare fase IEF-fractionering van C. albicans celoppervlaktewitten worden weergegeven in figuur 5. Deze celoppervlakte-eiwitten spelen een belangrijke rol bij C. albicans adhesie en pathogenese26. Verschillende verrijkte eiwitten (pijlen) in verschillende fracties werden waargenomen. Dit kan het mogelijk maken hun immunologische reacties te identificeren met candida-geïnfecteerd menselijk serum en/of de identificatie ervan door massaspectrometrie. Op dezelfde manier kunnen eiwitten uit andere cellulaire breuken (bijvoorbeeld cytoplasma en celwand) worden gefractioneerd met behulp van deze IEF-methode. De vloeibare fase IEF-gebaseerde zuivering zal het mogelijk maken identificatie van lage overvloed eiwitten uit complexe biologische monsters, in combinatie met massaspectrometrie analyse.
Figuur 1: Stroomdiagram met de experimentele werkstroom. Stapsgewijze IEF-fractioneringsprocedures voor de vloeibare fase en de daaropvolgende downstreamtesten worden afgebeeld. Monsters omvatten Gymnema sylvestre bladextract (monster 1) en Candida albicans niet-glucan bijgevoegde gisteiwitten (monster 2). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Vloeibare fase IEF-apparaatopstelling en fractionatie van G. sylvestre plantenextract. (A) Tijdens de run, (B) tijdens fractieverzameling, (C) na fractieverzameling, en (D)vloeibare fase IEF-apparaten delen, 1) ionenuitwisselingsmembranen, 2) scherpstelkamer en membraankern, 3) elektrodeassemblage (negatief), 4) elektrodeassemblage (positief). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: SDS-PAGE scheidingen van de IEF gerichte plantenextractfracties. L- ladder, PC- Positieve controle (peptide), 0 - input monster, 1-20 gescheiden fracties. SDS-PAGE (15% oplossen gel) werd gekleurd door Coomassie blauwe kleurstof om de opgeloste peptiden (~ 5 kDa) van fracties 1-20 visualiseren. Breuken 1-3 bevatten kleine moleculen (fractie 1 heeft een donkerdere kleur die wijst op verrijkte verbindingen) die niet kunnen worden vastgehouden / gedetecteerd door Coomassie blauwe kleurstof. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Analyse van IEF gefractioneerde kleine moleculen door TLC en bepaling van de bioactiviteit tegen C. albicans. (A) Toont TLC-analyse van kleine moleculen uit fractie #1 en #10. Geactiveerde silicagelplaat werd gebruikt om ~5 μL monsters te spotten en liep met tolueen: chloroform: methanoloplosmiddel (5:8:3 ratio) totdat het oplosmiddelfront de marge bereikte. TLC gescheiden verbindingen werden gedetecteerd onder een epifluorescentie UV-licht (310 nm). (B) Toont de % remming van C. albicans gist-op-hypha conversie door verschillende fracties. (C) Toont de celmorfologie van C. albicans onder hypha inducerende omstandigheden. Fractie #1 toont maximum (98%) remming van gist-op-hypha conversie. Andere breuken en controles vertonen geen remming van C. albicans hyphal groei na 12 uur incubatie bij 37 °C. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: SDS-PAGINA analyse van C. albicans celoppervlaktewitten (niet-glucan bevestigd). L- ladder, 0 - input monster, 1-18 fracties verzameld na IEF in een standaard vloeibare fase IEF cel met behulp van een smal bereik (pH 5-8) ampholyt. De afbeelding toont SDS-PAGE (12,5%) opgelost eiwitten na het bevlekken met Coomassie blauwe kleurstof. Verschillende eiwitten werden verrijkt in bepaalde breuken (pijlen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kleine moleculen uit natuurlijke productbronnen (bijvoorbeeld planten) bevatten complexe secundaire metabolieten die zeer divers zijn in chemische structuur. Ze worden verondersteld te worden betrokken bij de afweermechanismen van planten. Daarnaast zijn polypeptiden ook aanwezig in plantenweefsels22. Deze natuurlijke product kleine moleculen zijn rijke bronnen van testmoleculen voor drug ontdekking en ontwikkeling. Echter, de moeilijke en vervelende methoden die nodig zijn voor hun isolatie en zuivering beperken het gebruik ervan voor therapeutische toepassingen. De vloeibare fase IEF aanpak die in dit rapport wordt gebruikt benadrukt de mogelijkheid om deze kleine moleculen en polypeptiden te scheiden zonder afbreuk te doen aan hun bioactiviteit.
Deze IEF gebaseerde methode biedt verschillende voordelen bij het scheiden van biologische moleculen, waaronder de concentratie van gezuiverde eiwitten uit een complex mengsel, het behoud van inheemse conformatie tijdens en na hun focus, en het verzamelen van monsters als individuele gezuiverde breuken zonder kruisbesmetting. Indien nodig kunnen monsters opnieuw worden gericht met een smal pH-bereik om eiwit-isovormen te zuiveren. Aangezien een miniatuur IEF focuscel (~ 15 mL) beschikbaar is, kan het ook worden gebruikt voor kleinere hoeveelheden monsters. De nieuwe bevinding uit dit rapport is dat organische kleine moleculen en peptiden kunnen worden gescheiden van een complex plantenextract. Hoewel het moeilijk is om het erover eens dat kleine moleculen kunnen worden gescheiden van natuurlijke product extracten door IEF, is het plausibel voor die verbindingen die amphoterisch zijn. De gymnemic zuren die werden gescheiden van de gurmarin peptide in de G. sylvestre extract lijken te zijn amphoterische als ze bevatten een carboxylylzuur groep of ze gedragen zich zo op zijn minst in de aanwezigheid van de ampholyt gebruikt. Aangezien glycosides bioactieve natuurlijke moleculen zijn die vergelijkbaar zijn met gymnemische zuren, kan de IEF-methode worden gebruikt om ze te scheiden van complexe natuurlijke bronnen. Op dezelfde manier kunnen peptiden van natuurlijke producten ook worden geïsoleerd met behulp van deze vloeibare fase IEF-aanpak.
Enkele van de beperkingen in deze aanpak zijn dat niet alle kleine moleculen kunnen worden gefractioneerd door de IEF-methode als ze moeten in water oplosbaar en zwak amphoterisch, althans. Het extract dat hier werd gebruikt werd bereid door een 50% methanolwinning van gedroogd plantaardig materiaal, maar is in water oplosbaar. Het gebruik van de IEF-methode voor oplosmiddel-oplosbare en amphoterische verbindingen moet nog worden gezien, aangezien sommige organische oplosmiddelen onverenigbaar zijn met de componenten van het IEF-instrument met vloeibare fase. De neiging van eiwitten om te neerslaan op hun isoelectric points (pI) in oplossingen met een lage ionische sterkte is bekend. Echter, in een roterend IEF-systeem, eiwit neerslag wordt verminderd als de gerichte eiwitten blijven in omloop op hun pI-punt.
Als men een hoge concentratie van proteïnen in deze iefscheiding gebruikt, kan de precipitatie voorkomen. Om eiwitnecipitatie te minimaliseren en de eiwitconcentratie te verbeteren, kan ureum worden gebruikt tot 3-5 M. Niet-banionische detergenten zoals CHAPS, digitonine en lage concentratie detergenten (0,1-1%) kan ook worden gebruikt om eiwitaggregatie tijdens IEF te verminderen. Ureum en detergenten moeten echter worden verwijderd voordat de eiwitten worden geanalyseerd op hun activiteit en in sommige gevallen kunnen deze middelen de eiwitfuncties beïnvloeden. Een paar kritieke stappen te overwegen tijdens een vloeibare fase IEF run omvatten het laden van de IEF focuscel zonder luchtbellen, het vervangen van de ionenuitwisseling membranen als ze beschadigd waren, en het vervangen van de ontluchting knoppen na een bepaald aantal herhaalde toepassingen.
Tot slot, met behulp van de vloeibare fase IEF methode, hebben we aangetoond dat de scheiding van bioactieve gymnemische zuren en gurmarin polypeptide uit de G. sylvestre blad extract. Verder kan IEF met vloeibare fase nuttig zijn om selectieve eiwitten te verrijken uit de complexe ruwe extracten van pathogene microben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs willen geen concurrerende financiële belangen verklaren.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de financiering bronnen van de afdeling Biologie en Johnson Cancer Research Center voor BRIEF en IRA awards, respectievelijk aan GV. We danken ook de K-INBRE postdoctorale award aan RV. Dit werk werd mede ondersteund door de Institutional Development Award (IDeA) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder subsidienummer P20 GM103418. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van het National Institute of General Medical Sciences of de National Institutes of Health. Wij danken de anonieme reviewers voor hun nuttige opmerkingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
References
- Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
- Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins. Proteomes. 5 (1), (2017).
- Stoyanov, A. IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution. Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).
- Vesterberg, O. A. Y. Method of Isoelectric Fractionation. , US3485736A (1964).
- Vesterberg, O., Svensson, H. Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins. Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).
- Righetti, P. G. Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , Elsevier Science. 1 (1983).
- Vesterberg, O. Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes. Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).
- Bier, M. Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis. Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).
- Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation. Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).
- Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure. Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).
- Wagner, L., et al. Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization. Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).
- Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing. Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).
- Yu, J. J., et al. Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice. Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).
- Riyong, D., et al. Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).
- Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins. Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).
- Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans. PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides. Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).
- Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre. Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).
- Craik, D. J. Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends. Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).
- Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).
- Stoecklin, W. Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).
- Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).
- Veerapandian, R., Vediyappan, G. Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms. Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).
- Chaffin, W. L. Candida albicans cell wall proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).
