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Immunology and Infection

बायोएक्टिव छोटे अणुओं का पृथक्करण, प्राकृतिक स्रोतों से पेप्टाइड्स और प्रिटोर्स से प्रोटीन प्रेटिव आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग (आईईएफ) विधि द्वारा

Published: June 14, 2020 doi: 10.3791/61101
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Biology, Kansas State University

Summary

इसका उद्देश्य तरल-चरण आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग (आईईएफ) विधि को नियोजित करके बायोएक्टिव छोटे अणुओं, पेप्टाइड्स को एक जटिल संयंत्र निकालने से और रोगजनक रोगाणुओं से प्रोटीन को अलग करना और अलग करना है। इसके अलावा अलग हुए अणुओं की पहचान की गई और उनकी बायोएक्टिविटी की पुष्टि हुई ।

Abstract

पौधों और रोगाणुओं से प्राप्त प्राकृतिक उत्पाद जैव सक्रिय अणुओं का एक समृद्ध स्रोत हैं। उनके उपयोग से पहले, जटिल अर्क से सक्रिय अणुओं को डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए शुद्ध किया जाना चाहिए। इस उद्देश्य के लिए विभिन्न क्रोमेग्राफिक विधियां उपलब्ध हैं फिर भी सभी प्रयोगशालाएं उच्च प्रदर्शन विधियों को बर्दाश्त नहीं कर सकती हैं और जटिल जैविक नमूनों से अलगाव मुश्किल हो सकता है। यहां हम प्रदर्शित करते हैं कि तैयारी तरल-चरण आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग (आईईएफ) अपने आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट्स (पीआई) के आधार पर जटिल पौधे के अर्क से छोटे अणुओं और पेप्टाइड्स सहित अणुओं को अलग कर सकता है। हमने जटिल जैविक नमूना विच्छेदन और लक्षण वर्णन के लिए विधि का उपयोग किया है। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हमने एक जिमनेमा सिल्वेस्टर पौधे निकालने का आंशिक रूप दिया, जो टर्पेनॉइड सैपोनिन छोटे अणुओं और पेप्टाइड के परिवार को अलग करता है। हमने एक मॉडल प्रणाली के रूप में कैंडिडा एल्बिकान कवक का उपयोग करके प्रभावी माइक्रोबियल प्रोटीन सेपरेशन का भी प्रदर्शन किया।

Introduction

जटिल जैविक नमूनों से जैव अणुओं का शुद्धिकरण जैविक प्रयोगों में एक आवश्यक और अक्सर कठिन कदम है1. आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग (आईईएफ) जटिल बायोमॉलिक्यूल्स के उच्च रिज़ॉल्यूशन पृथक्करण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है जहां वाहक ampholytes अपने आरोप के अनुसार यात्रा करते हैं और एक इलेक्ट्रिक क्षेत्र 3 में पीएच ढालस्थापितकरते हैं। आईईएफ के लिए पहला वाणिज्यिक वाहक 1964 में ओलोफ वेस्टरबर्ग द्वारा विकसित किया गया था और4,5का पेटेंट कराया गया था । वाहक एम्बोलाइट्स एलिफेटिक ओलिगो-अमीनो ओलिगो-कार्बोक्सिलिक एसिड अणु हैं जो अलग-अलग लंबाई और ब्रांचिंग6के हैं। इसके बाद, वेस्टरबर्ग और अन्य लोगों ने बायोमॉलिक्यूल्स6,7को अलग करने में अपने विस्तारित उपयोग के लिए वाहक एम्बोलाइट्स में सुधार किया ।

जैव अणुओं को अलग करने के तरीकों में एग्राजॉल्ड और पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस, दो-आयामी जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (2-डीई), आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग, केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस, आइसोटाकोफोरेसिस और अन्य क्रोमेटोग्राफिक तकनीक (जैसे, टीएलसी, एफपीएलसी, एचपीएलसी)2शामिल हैं। "रोटोफॉर" नामक एक उपकरण में किए गए तरल चरण आईईएफ का आविष्कार मिलान बियर8द्वारा किया गया था। उन्होंने इस उपकरण की अवधारणा और डिजाइन का बीड़ा उठाया और इलेक्ट्रोफोरेटिक माइग्रेशन के सिद्धांत में बड़े पैमाने पर योगदान दिया। उनकी टीम ने कंप्यूटर सिमुलेशन9के लिए इलेक्ट्रोफोरेटिक सेपरेशन प्रक्रिया का गणितीय मॉडल भी तैयार किया .

तरल चरण आईईएफ तंत्र एक क्षैतिज रूप से घूर्णन बेलनाकार कोशिका है जिसमें एक नायलॉन कोर 20 असुरक्षित डिब्बों और एक परिसंचारी पानी ठंडा सिरेमिक रॉड में विभाजित होता है। असुरक्षित कक्ष अणुओं को इलेक्ट्रोड के बीच जलीय चरण के माध्यम से स्थानांतरित करने और अंशों में वैक्यूम के तहत शुद्ध नमूनों के संग्रह की अनुमति देते हैं। यह शुद्धिकरण प्रणाली और 4 घंटे में एक विशिष्ट अणु का 1000 गुना शुद्धिकरण प्रदान कर सकती है। इस यंत्र की एक मूल्यवान विशेषता यह है कि इसे जटिल मिश्रण से शुद्धि के लिए पहले कदम के रूप में या शुद्धता प्राप्त करने के लिए अंतिम चरण के रूप में लागू किया जा सकता है10. यदि ब्याज का अणु प्रोटीन है, तो एक और लाभ यह है कि अलगाव के दौरान इसकी मूल संरचना को बनाए रखा जाएगा।

तरल चरण आईईएफ के उपयोग की व्यापक रूप से प्रोटीन, एंजाइम और एंटीबॉडी शुद्धि6,10, 11,,12,,13,,1413केलिए सूचित किया गया है।, यहां हम औषधीय पौधे जिमनेमा सिल्वेस्टरसे छोटे अणुओं और पेप्टाइड्स को अलग करने और शुद्ध करने के लिए इस दृष्टिकोण के उपयोग का वर्णन करते हैं । यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को कम लागत पर डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए एक संयंत्र निकालने से सक्रिय छोटे अणुओं को ध्यान केंद्रित करने और शुद्ध करने में मदद करेगा। इसके अलावा, हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि एक दूसरे उदाहरण के रूप में इस आईईएफ-आधारित प्रणाली में कैंडिडा एल्बिकान कवक15 से एक जटिल प्रोटीन निकालने से प्रोटीन का संवर्धन।

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Protocol

1. मानक तरल चरण आईईएफ इकाई का सेटअप और प्रीरनिंग

  1. अनुदेश मैनुअल (सामग्रीकी तालिका देखें) के अनुसार तरल चरण आईईएफ इलेक्ट्रोड (एनोड-रेड बटन और कैथोड-ब्लैक बटन) को उनके संबंधित एक्सचेंज झिल्ली के साथ इकट्ठा करें। 0.1 एम नाओएच के साथ एनियन एक्सचेंज झिल्ली को बराबर करें और नई झिल्ली का उपयोग किए जाने पर कम से कम 16 घंटे के लिए 0.1 एम एच3पीओ4 के साथ आयन एक्सचेंज झिल्ली।
    1. इलेक्ट्रोलाइट्स (0.1 एम नाओएच या 0.1 एम एच3पीओ4)में झिल्ली को रन के बीच स्टोर करें और सूखने की अनुमति न दें।
  2. आयन-एक्सचेंज गैसकेट में तीन आयताकार छेद को संरेखित करके इलेक्ट्रोड के भीतरी और बाहरी हिस्से को इकट्ठा करें। इलेक्ट्रोड को संबंधित इलेक्ट्रोलाइट्स (~ 25-30 एमएल) के साथ भरें ताकि उनकी झिल्ली को सूखने से रोका जा सके।
    1. अधिक मात्रा (इलेक्ट्रोड चैंबर वॉल्यूम के 1/3से अधिक) इलेक्ट्रोलाइट न जोड़ें जो इलेक्ट्रोड के अंदर दबाव का निर्माण कर सकता है और रिसाव का कारण बन सकता है।
  3. सीलिंग टेप के साथ नमूना संग्रह बंदरगाहों को कवर करें जो उपकरण असेंबली भागों (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ आता है। नमूना संग्रह बंदरगाहों की ओर से दो ऊर्ध्वाधर धातु संरेखण पिन द्वारा पहचाना जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, बंदरगाहों को सील करने के लिए मानक सीलिंग टेप का उपयोग करें।
  4. सिरेमिक कूलिंग फिंगर पर फोकसिंग चैंबर असेंबली के सभी हिस्सों को सीक्वेंस (एनोड इलेक्ट्रोड, नायलॉन झिल्ली कोर, फोकसिंग चैंबर और कैथोड इलेक्ट्रोड) में इकट्ठा करें।
  5. 50 एमएल सिरिंज का उपयोग करके प्रीकूल्ड डिस्टिल्ड पानी (मानक आईईएफ सेल के लिए 60 एमएल की कुल मात्रा) के साथ फोकसिंग चैंबर भरें।
  6. तरल चरण आईईएफ उपकरण को 4 डिग्री पर परिसंचारी ठंडा पानी से कनेक्ट करें और 3-5 मिनट के लिए 15 डब्ल्यू और 3,000 वी पर इकाई को प्रीरन करें या जब तक वोल्टेज स्थिर न हो जाए।
    नोट: आम तौर पर, एक मिनट के भीतर, वोल्टेज अधिकतम निर्धारित मूल्यों तक पहुंच जाएगा। आसुत पानी के साथ प्रीरनिंग फोकसिंग चैंबर और नायलॉन झिल्ली कोर से अवशिष्ट आयनों को हटाने में मदद करता है।
  7. बिजली स्रोत को बंद करें और अंश कलेक्टर का उपयोग करके सेल से पानी निकालें। सीलिंग टेप के साथ संग्रह बंदरगाहों को फिर से सील करें।
    नोट: अब उपकरण चरण 2.4 में उपयोग के लिए तैयार है।

2. जिमेनेमा सिल्वेस्टर निकालने से छोटे अणुओं और पेप्टाइड्स का पृथक्करण और शुद्धिकरण

  1. पौधे निकालने के 0.6 ग्राम को मापें और 5 मिनट के लिए रोलर ट्यूब में मिलाकर आसुत पानी (60 एमएल) में भंग करें।
    नोट: किसी भी जैविक नमूना है कि घुलनशील और नमक से मुक्त है जुदाई और शुद्धिकरण के लिए इस IEF उपकरण का उपयोग कर इस्तेमाल किया जा सकता है । 10 mm तक बफरिंग नमक एकाग्रता वाले नमूनों का उपयोग थोड़ा कम संकल्प के साथ किया जा सकता है। हम अपने अद्वितीय एंटीफंगल गुणों के लिए जी सिल्वेस्टर संयंत्र से ट्राइटरपेनॉइड यौगिकों, जिमनेमिक एसिड के सपोनिन परिवार में रुचि रखते हैं16।
  2. अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर घुलनशील संयंत्र निकालने अघुलनशील कणों को दूर करने के लिए।
  3. सुपरनेट (~ 60 एमएल) को 80 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसे 0.6 एमएल एम्फोलाइट (पीएच 3-10) से 1% (v/v) के साथ मिलाएं।
  4. लिक्विड-फेज आईईएफ यूनिट तैयार करने के लिए स्टेप्स 1.1 - 1.7 का पालन करें। अब चैंबर सैंपल लोड करने की तैयारी में है।
  5. 1-1/2 इंच 19 जी कुंद अंत सुई के साथ एक 50 मिलीएल सिरिंज का उपयोग करें (उपकरण के साथ आता है) और नमूना संग्रह बंदरगाहों के माध्यम से सेल में ampholyte (60 एमएल कुल) के साथ तैयार नमूना लोड।
  6. स्टैंड से फोकसिंग सेल को हटाकर और बुलबुले को उखाड़ फेंकने के लिए इलेक्ट्रोड चैंबर को टैप करके सैंपल सेल से हवा के बुलबुले निकालें। हवा के बुलबुले की उपस्थिति वोल्टेज और वर्तमान उतार चढ़ाव का कारण बनेगी और रन को प्रभावित करेगी।
  7. यूनिट को वाटर कूलेंट (4 डिग्री सेल्सियस) से कनेक्ट करें और लगातार 15 डब्ल्यू पर बिजली आपूर्ति के साथ अंश शुरू करें।
  8. उपकरण को 3 घंटे के लिए चलाएं या जब तक वोल्टेज निरंतर मूल्य तक न पहुंच जाए।
    नोट: जैसे ही नमूना ध्यान केंद्रित करना शुरू करता है, वोल्टेज धीरे-धीरे चढ़ना शुरू कर देगा जब तक कि यह निरंतर मूल्य तक नहीं पहुंच जाता।
  9. रन के बाद, आईईएफ इकाई में हार्वेस्ट बटन को दबाकर वैक्यूम पंप से जुड़े हार्वेस्ट बॉक्स (जिसमें 20 प्लास्टिक ट्यूब, 12 मिमी x 75 मिमी, 5-6 एमएल वॉल्यूम) में अंश एकत्र करने के लिए तैयार करें।
  10. टेप के साथ सील किए गए फोकसिंग सेल के 20-संग्रह बंदरगाहों के साथ 20-संग्रह पिनों को संरेखित करें।
  11. सीलिंग टेप के माध्यम से संग्रह पिन पुश करें और वैक्यूम पंप को एक साथ चालू करें (चित्रा 2बी, 2 सी और 2डीदेखें)।
    नोट: प्रत्येक कक्ष से लगभग 3 एमएल अंश हर बार ट्यूबों में एकत्र किए जाएंगे। अंशों का उपयोग बाद के डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों (पेप्टाइड क्वांटिफिकेशन, टीएलसी और छोटे अणुओं के लिए बायोसे के लिए एसडीएस-पेज) के लिए किया जा सकता है।

3. सी एल्बिकान से प्रोटीन का पृथक्करण और शुद्धिकरण

  1. रात भर के लिए मिलाते हुए (200 आरपीएम) के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर खमीर-पेप्टोन-डेक्सट्रोस (वाईपीडी) शोरबा16 में सी एल्बिकान की एकल कॉलोनी बढ़ाएं।
  2. अपकेंद्रित्र (5 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम) द्वारा खमीर कोशिकाओं को ले लीजिए।
  3. अमोनियम कार्बोनेट (1.89 ग्राम/एल) बफर में सी एल्बिकान यीस्ट कोशिकाओं को निलंबित करें जिसमें 1% (v/v) बीटा-मर्केप्टोएथेन (एमई) (संस्कृति की मात्रा का 1/10वां) होता है और 5 डिग्री सेल्सियस 15 पर 1 घंटे के लिए रोलर ट्यूब में घुमाते हैं।15
  4. अपकेंद्रित्र (5 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम) द्वारा खमीर कोशिकाओं को हटा दें और 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से प्रोटीन निकालने को फ़िल्टर करें।
    नोट: सी एल्बिकान साइटोसोल, झिल्ली या सेल दीवार से प्रोटीन नमूने तैयार किए जा सकते हैं और आईईएफ अंश के लिए उपयोग किए जा सकते हैं। इसी तरह, बैक्टीरिया या अन्य जैविक नमूनों (पशु ऊतक निकालने) से प्रोटीन का उपयोग उचित तरीकों से किसी भी नमक को हटाने के बाद किया जा सकता है(उदाहरण के लिए,डायलिसिस द्वारा या डीसाल्टिंग कॉलम का उपयोग करके)।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 घंटे के लिए पानी के खिलाफ डायलिसिस ट्यूबिंग (3,500 MWCO) में प्रोटीन निकालने को डायलाइज करें। एक मानक17के रूप में गामा ग्लोबुलिन का उपयोग कर ब्रैडफोर्ड डाई बाध्यकारी विधि द्वारा प्रोटीन एकाग्रता का अनुमान है ।
  6. अंश के लिए 1% (v/v) ampholyte (पीएच 5-8) युक्त पानी के 60 मिलीग्राम पानी में कुल प्रोटीन के 500 मिलीग्राम का उपयोग करें।
    नोट: चूंकि एक व्यापक दूरी के ampholyte (पीएच 3-10) सी एल्बिकान के कुछ गैर-ग्लूकन संलग्न सेल वॉल प्रोटीन को अच्छी तरह से समृद्ध नहीं करता है, इसलिए एक संकीर्ण-रेंज (पीएच 5-8) ampholyte का उपयोग करें। यदि नमूना प्रोटीन एकाग्रता 2 मिलीग्राम/एमएल से अधिक है तो 2% तक की एक एम्बोलिट एकाग्रता का उपयोग किया जा सकता है; यह ध्यान केंद्रित करने के दौरान प्रोटीन एकत्रीकरण को कम करता है। हमेशा नमूने, ampholytes, और पानी बर्फ पर precooled रखें ।
  7. आईईएफ इकाई तैयार करने और आईईएफ सेल में लोड करने के लिए चरण 3.6 से प्रोटीन समाधान का उपयोग करने के लिए चरण 1.1-1-7 दोहराएं।
  8. एक निरंतर 15 डब्ल्यू पर ध्यान केंद्रित करने के 4 घंटे के बाद, फसल प्रोटीन अंश (1-20) के रूप में ऊपर वर्णित (कदम 2.9-2.11) और कम करने और प्रोटीन के नमूनों को उबलते के बाद १२.५% SDS-पृष्ठ पर विश्लेषण18।
  9. Coomassie ब्लू डाई (0.01%) एक घुमाव पर कमरे के तापमान पर 2-3 घंटे के लिए समाधान। जेल को डिटेन करें और जेल इमेजर का उपयोग करके जेल छवि रिकॉर्ड करें।
    नोट: Coomassie ब्लू डाई (0.01%) 40% मेथनॉल और 10% एसिटिक एसिड वाले एक डिटेनिंग समाधान में 0.01 ग्राम कूमासी ब्लू पाउडर मिलाकर तैयार किया जा सकता है।

4. पौधे निकालने जिमनेमा सिल्वेस्टर से शुद्ध छोटे अणुओं की जैव सक्रियता

  1. चरण 3.1 के रूप में खमीर कोशिकाओं में सी एल्बिकान बढ़ो।
  2. सेल निलंबन तैयार करने के लिए, सी एल्बिकान खमीर कोशिकाओं (1/1000 कमजोर पड़ने) की रातोंरात संस्कृति को 50 एमएम ग्लूकोज के साथ पूरक एक ताजा आरपीएमआई सेल संस्कृति माध्यम में पतला करें।
    नोट: सी एल्बिकन हाइफाल उत्प्रेरण स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस पर आरपीएमआई) के तहत खमीर विकास से हाइफाई में परिवर्तित होता है। जिमनेमिक एसिड छोटे अणुओं को हाइफा उत्प्रेरण स्थितियों के तहत खमीर कोशिकाओं के प्रचार को हाइफा में बाधित करने के लिए दिखाया गया है16. हम यह निर्धारित करने के उद्देश्य से कि क्या तरल चरण-IEF-अलग जी सिल्वेस्टर अर्क में ये जैव सक्रिय अणु होते हैं।
  3. तैयार सेल निलंबन से, 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 90 माइक्रोन जोड़ें।
  4. प्रत्येक अंश से (तरल चरण आईईएफ, चित्रा 4 से प्राप्त जी सिल्वेस्टर अर्क के 1-20काटे गए अंश), उपरोक्त सेल निलंबन (चरण 4.2) के 90 माइक्रोन के साथ कुओं में 10 माइक्रोन जोड़ें। त्रिपाल में परख करें।
  5. 10 माइक्रोल पानी जोड़ें जिसमें ampholyte (1%) एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सी एल्बिकन्स खमीर सेल निलंबन के 90 माइक्रोन के साथ अलग कुओं में।
    नोट: Ampholytes जैव सक्रियता क्षमता है और इसलिए यह एक ampholyte नियंत्रण शामिल करने के लिए आवश्यक है, जबकि किसी भी bioassay19प्रदर्शन ।
  6. 12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 96-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें और माइक्रोस्कोप16के तहत सी एल्बिकान यीस्ट-टू-हाइफा रूपांतरण के अवरोध का निरीक्षण करें। इसके अलावा, खमीर से हाइफा रूपांतरण के अवरोध का प्रतिशत निर्धारित करें।

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Representative Results

जिंटेमा सिल्वेस्टर पौधे के अर्क से छोटे अणुओं और पेप्टाइड्स का पृथक्करण और शुद्धिकरण
तैयारी तरल चरण आईईएफ विधि का उपयोग करके, हमने मानव रोगजनक कवक, सी एल्बिकनसे औषधीय पौधे के अर्क और सेल सतह प्रोटीन को अलग किया। चित्र 1में इन अंश प्रोटोकॉलों का एक योजनाबद्ध दिखाया गया है ।

तरल-चरण आईईएफ से प्राप्त जी सिल्वेस्टर अर्क के 20 अंशों से, काले रंग के अणुओं (टर्पेनॉइड सैपोनिन) को एनोड एंड (पीएच 2-3) में माइग्रेट और समृद्ध होने के लिए पाया गया और कैथोड एंड (पीएच 8-9)(चित्र 2)में हल्के-पीले स्पष्ट अंश देखे गए। प्रत्येक अंश (1-20) से Aliquots (20 μL) को कम करने और नमूनों उबलते के बाद 15% SDS-पृष्ठ पर हल किया गया । एक कूमासी नीले रंग का जेल लगभग 5 केडीए के डिफ्यूज्ड पॉलीपेप्टाइड बैंड को दिखाता है जो 16-19(चित्रा 3)के अंशों में समृद्ध होता है। यह बताया गया है कि जी सिल्वेस्टर संयंत्र में 35 अमीनो एसिड गुरमारिन मूल पॉलीपेप्टाइड होता है जिसमें 4,209 डीए20का अनुमानित आणविक वजन होता है। बैक्टीरिया, पौधों और जानवरों में पेप्टाइड्स होते हैं; उनमें से कई परिपत्र (नॉटटिन) और जैविक गतिविधियों की विस्तृत श्रृंखला के साथ स्थिर हैं जैसे कीटनाशक और रोगाणुरोधी गुण21,22.

अलग जिमनेमिक एसिड की जैविक गतिविधि
जी सिल्वेस्टर के पौधे में16,23, 24,24प्रमुख घटकों के रूप में जिमनेमिक एसिड (टर्पेनॉइड सैपोनिन) भी होता है।, जैसा कि अपेक्षित था, अंश 1 और अगले कुछ अंशों में इन छोटे अणुओं का पता एसडीएस-पेज और कूमासी स्टेनिंग(चित्रा 3)द्वारा नहीं लगाया गया था क्योंकि वे गैर-प्रोटीनसियस हैं। हालांकि, इन छोटे अणुओं को टीएलसी द्वारा अलग किया जा सकता है और यूवी लाइट(चित्रा 4A,लेन एफ 1) के तहत पता लगाया जा सकता है। अंश 10 टीएलसी पर इन छोटे अणुओं की एक पता लगाने योग्य राशि शामिल नहीं था कार्बनिक छोटे अणुओं के अधिकांश सुझाव अंशों में समृद्ध थे 1-3 । जिमनेमिक एसिड (जीएएस) अणुओं को सी एल्बिकन यीस्ट-टू-हाइफा संक्रमण16,,25को बाधित करने के लिए दिखाया गया था । हमने सी एल्बिकन्स यीस्ट-टू-हाइफा रूपांतरण और हाइफाल विकास16के खिलाफ उनकी निरोधात्मक गतिविधि के लिए इस अध्ययन में एकत्र किए गए सभी 20 अंशों को बताता है। परिणाम चित्रा 4बी, 4Cमें दिखाए गए हैं । उच्चतम गतिविधि अंश 1 में देखी जाती है, जो टीएलसी परिणामों से सहमत है जहां कई धब्बे देखे जा सकते हैं। जिमनेमिक एसिड के आइसोमर मौजूद हैं और सभी में समान जैविक गतिविधियां हैं10. इन आइसोमर्स को अंश 1-3 में अलग किया गया था और सी एल्बिकान हाइफाल विकास(चित्रा 4ए, 4 सी, अंश 1) का अवरोध दिखाता है। हाइफाल अवरोध की डिग्री धीरे-धीरे कम हो गई क्योंकि यह 1 से 10 तक जाती है। 10 और उससे अधिक अंशों में कम या कोई गतिविधि प्राप्त नहीं की गई थी।

रोगजनक कवक, सी एल्बिकान से सेल सतह प्रोटीन का पृथक्करण
सी एल्बिकन सेल सरफेस प्रोटीन के तरल चरण आईईएफ अंश से परिणाम चित्र 5में दिखाए जाते हैं। ये कोशिका सतह प्रोटीन सी एल्बिकान आसंजन और रोगजनन26में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । विभिन्न अंशों में कई समृद्ध प्रोटीन (तीर) देखे गए। यह कैंडिडा संक्रमित मानव सीरम और/या बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा उनकी पहचान के साथ उनकी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की पहचान की अनुमति दे सकता है । इसी तरह, इस आईईएफ विधि का उपयोग करके अन्य सेलुलर अंशों (जैसे, साइटोप्लाज्म और सेल वॉल) से प्रोटीन का आंशिक किया जा सकता है। तरल चरण आईईएफ आधारित शुद्धिकरण जटिल जैविक नमूनों से कम बहुतायत प्रोटीन की पहचान की अनुमति देगा, जब बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ मिलकर ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह दिखा प्रवाह चार्ट। स्टेपवाइज लिक्विड-फेज आईईएफ आंशिक प्रक्रियाओं और बाद में डाउनस्ट्रीम परख को दर्शाया गया है। नमूनों में जिमनेमा सिल्वेस्टर लीफ एक्सट्रैक्ट (नमूना 1) और कैंडिडा एल्बिकान गैर-ग्लूकन संलग्न खमीर प्रोटीन (नमूना 2) शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: तरल चरण आईईएफ उपकरण सेटअप और जी सिल्वेस्टर संयंत्र निकालने का अंश। (A)रन के दौरान,(बी)अंश संग्रह के दौरान,(C)अंश संग्रह के बाद, और(D)तरल चरण आईईएफ उपकरण भागों, 1) आयन विनिमय झिल्ली, 2) ध्यान केंद्रित चैंबर और झिल्ली कोर, 3) इलेक्ट्रोड विधानसभा (नकारात्मक), 4) इलेक्ट्रोड विधानसभा (सकारात्मक) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: आईईएफ केंद्रित संयंत्र निकालने के अंशों के एसडीएस-पेज अलगाव। एल- सीढ़ी, पीसी- पॉजिटिव कंट्रोल (पेप्टाइड), 0 - इनपुट नमूना, 1-20 अलग अंश। एसडीएस-पेज (15% हल करने वाले जेल) को 1-20 अंशों से हल किए गए पेप्टाइड्स (~ 5 केडीए) की कल्पना करने के लिए कूमासी ब्लू डाई द्वारा दाग दिया गया था। अंश 1-3 में छोटे अणु होते हैं (अंश 1 में समृद्ध यौगिकों का संकेत देने वाला गहरा रंग होता है) जिसे कूमासी ब्लू डाई द्वारा दाग/पता नहीं लगाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: आईईएफ का विश्लेषण टीएलसी द्वारा छोटे अणुओं का विश्लेषण और सी एल्बिकानके खिलाफ जैव गतिविधि का निर्धारण । (क)अंश #1 और #10 से छोटे अणुओं का टीएलसी विश्लेषण दिखाता है । सक्रिय सिलिका जेल प्लेट का उपयोग ~ 5 माइक्रोन नमूनों को स्पॉट करने और टोल्यून के साथ भागने के लिए किया गया था: क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल सॉल्वेंट (5:8:3 अनुपात) जब तक सॉल्वेंट फ्रंट मार्जिन तक नहीं पहुंच गया। एक एपिफ्लोरेसेंस यूवी लाइट (310 एनएम) के तहत टीएलसी अलग यौगिकों का पता लगाया गया। (ख)विभिन्न अंशों द्वारा सी एल्बिकन यीस्ट-टू-हाइफा रूपांतरण के% अवरोध को दर्शाता है। (ग)हाइफा उत्प्रेरण स्थितियों के तहत सी एल्बिकन की कोशिका आकृति विज्ञान को दर्शाता है। अंश #1 अधिकतम (98%) खमीर से हाइफा रूपांतरण का अवरोध। अन्य अंशों और नियंत्रणों में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के 12 घंटे के बाद सी एल्बिकान हाइफाल विकास का कोई अवरोध नहीं दिखाई देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: सी एल्बिकन सेल सरफेस प्रोटीन (गैर-ग्लूकन संलग्न) का एसडीएस-पेज विश्लेषण। एल-सीढ़ी, 0 - इनपुट नमूना, एक संकीर्ण सीमा (पीएच 5-8) ampholyte का उपयोग कर एक मानक तरल चरण IEF सेल में आईईएफ के बाद एकत्र 1-18 अंश। छवि SDS-पेज से पता चलता है (१२.५%) Coomassie नीले रंग के साथ धुंधला करने के बाद प्रोटीन का समाधान किया। कई प्रोटीन कुछ अंशों (तीर) में समृद्ध थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्राकृतिक उत्पाद स्रोतों (जैसे, पौधों) से छोटे अणुओं में जटिल माध्यमिक मेटाबोलाइट्स शामिल हैं जो रासायनिक संरचना में अत्यधिक विविध हैं। माना जा रहा है कि वे प्लांट डिफेंस मैकेनिज्म में शामिल हैं । इसके अलावा, पौधों के ऊतकों में पॉलीपेप्टाइड्स भी मौजूद हैं22। ये प्राकृतिक उत्पाद छोटे अणु दवा की खोज और विकास के लिए परीक्षण अणुओं के समृद्ध स्रोत हैं। हालांकि, उनके अलगाव और शुद्धिकरण के लिए आवश्यक कठिन और थकाऊ तरीके चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए उनके उपयोग को सीमित करते हैं। इस रिपोर्ट में उपयोग किए जाने वाले तरल चरण आईईएफ दृष्टिकोण में इन छोटे अणुओं और पॉलीपेप्टाइड्स को उनकी जैव गतिविधियों से समझौता किए बिना अलग करने की क्षमता पर प्रकाश डाला गया है ।

यह आईईएफ आधारित विधि जैविक अणुओं को अलग करने में कई फायदे प्रदान करती है जिसमें एक जटिल मिश्रण से शुद्ध प्रोटीन की एकाग्रता, उनके ध्यान केंद्रित करने के दौरान और बाद में देशी संरचना का रखरखाव, और क्रॉस-संदूषण के बिना व्यक्तिगत शुद्ध अंशों के रूप में नमूनों का संग्रह शामिल है। जब आवश्यक हो, तो नमूनों को प्रोटीन आइसोफॉर्म को शुद्ध करने के लिए एक संकीर्ण पीएच रेंज के साथ फिर से केंद्रित किया जा सकता है। चूंकि एक लघु आईईएफ फोकसिंग सेल (~ 15 एमएल) उपलब्ध है, इसलिए इसका उपयोग नमूनों की छोटी मात्रा के लिए भी किया जा सकता है। इस रिपोर्ट से नया निष्कर्ष यह है कि कार्बनिक छोटे अणुओं और पेप्टाइड्स को एक जटिल पौधे के निकालने से अलग किया जा सकता है । हालांकि यह सहमत होना मुश्किल है कि छोटे अणुओं को आईईएफ द्वारा प्राकृतिक उत्पाद अर्क से अलग किया जा सकता है, यह उन यौगिकों के लिए प्रशंसनीय है जो एम्फोटिक हैं। जी सिल्वेस्टर एक्सट्रैक्ट में गुरमारिन पेप्टाइड से अलग किए गए जिमनेमिक एसिड एम्फोटीबैस दिखाई देते हैं क्योंकि उनमें कार्बोक्सिलिक एसिड समूह होता है या वे कम से कम इस्तेमाल किए गए एम्बोलाइट की उपस्थिति में ऐसा व्यवहार करते हैं। चूंकि ग्लाइकोसाइड्स बायोएक्टिव प्राकृतिक अणु हैं जो जिमनेमिक एसिड के समान हैं, इसलिए आईईएफ विधि का उपयोग उन्हें जटिल प्राकृतिक स्रोतों से अलग करने के लिए किया जा सकता है। इसी तरह, प्राकृतिक उत्पादों से पेप्टाइड्स को भी इस तरल चरण आईईएफ दृष्टिकोण का उपयोग करके अलग किया जा सकता है।

इस दृष्टिकोण में कुछ सीमाएं यह हैं कि सभी छोटे अणुओं को आईईएफ विधि द्वारा नहीं किया जा सकता है क्योंकि उन्हें कम से कम पानी में घुलनशील और कमजोर रूप से उत्साही होना चाहिए। यहां इस्तेमाल किया निकालने सूखे संयंत्र सामग्री के एक ५०% मेथनॉल निकासी द्वारा तैयार किया गया था, लेकिन पानी में घुलनशील है । विलायक-घुलनशील और एम्फोटेरिक यौगिकों के लिए आईईएफ विधि का उपयोग देखा जाना बाकी है क्योंकि कुछ कार्बनिक सॉल्वैंट्स तरल-चरण आईईएफ उपकरण घटकों के साथ असंगत हैं। प्रोटीन की प्रवृत्ति कम आयनिक शक्ति समाधान में अपने आइसोइलेक्ट्रिक बिंदुओं (पीआई) पर उपजी करने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है । हालांकि, एक घूर्णन आईईएफ प्रणाली में, प्रोटीन वर्षा कम हो जाती है क्योंकि केंद्रित प्रोटीन अपने पीआई बिंदु पर प्रचलन में रहते हैं।

यदि कोई इस आईईएफ पृथक्करण में प्रोटीन की उच्च एकाग्रता का उपयोग करता है, तो वर्षा हो सकती है। प्रोटीन वर्षा को कम करने और प्रोटीन फोकसिंग में सुधार करने के लिए, यूरिया का उपयोग 3-5 एम नॉनियोनिक डिटर्जेंट जैसे चैप्स, डिजिकॉनिन और डिटर्जेंट की कम एकाग्रता (0.1-1%) आईईएफ के दौरान प्रोटीन एकत्रीकरण को कम करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, यूरिया और डिटर्जेंट को उनकी गतिविधि के लिए प्रोटीन का विश्लेषण करने से पहले हटाने की जरूरत है और कुछ मामलों में, ये एजेंट प्रोटीन कार्यों को प्रभावित कर सकते हैं। तरल चरण IEF रन के दौरान विचार करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदमों में आईईएफ फोकसिंग सेल को हवा के बुलबुले के बिना लोड करना, आयन एक्सचेंज झिल्ली को बदलना शामिल है, अगर वे क्षतिग्रस्त हो गए थे, और एक निश्चित संख्या में दोहराया उपयोग के बाद वेंट बटन की जगह।

अंत में, तरल चरण आईईएफ विधि का उपयोग करके, हमने जी सिल्वेस्टर लीफ एक्सट्रैक्ट से बायोएक्टिव जिम्नेमिक एसिड और गुरमारिन पॉलीपेप्टाइड को अलग दिखाया है। इसके अलावा, रोगजनक रोगाणुओं के जटिल कच्चे तेल के अर्क से चयनात्मक प्रोटीन को समृद्ध करने के लिए तरल चरण आईईएफ उपयोगी हो सकता है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करना चाहते हैं ।

Acknowledgments

हम जीवी के लिए क्रमशः संक्षिप्त और इरा पुरस्कार के लिए जीव विज्ञान और जॉनसन कैंसर अनुसंधान केंद्र के प्रभाग से धन स्रोतों के लिए आभारी हैं । हम आरवी को के-इनब्रे पोस्टडॉक्टोरल अवार्ड का भी शुक्रिया अदा करते हैं । इस कार्य को अनुदान संख्या P20 GM103418 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान से संस्थागत विकास पुरस्कार (आईडीईए) द्वारा भाग में समर्थन दिया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है । हम गुमनाम समीक्षकों को उनकी मददगार टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm syringe filter Fisher scientfic 09-720-004
2-Mercaptoethanol Sigma M3148
Ammonium carbonate Sigma-Aldrich 207861-500
Bio-Lyte 3/10 Ampholyte Bio-Rad 163-1113
Bio-Lyte 5/8 Ampholyte Bio-Rad 163-1192
Compact low temperature thermostat Lauda -Brinkmann RM 6T Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage.
Coomassie Brilliant Blue R Sigma-Aldrich B7920
Dialysis tubing (3,500 MWCO) Spectrum Spectra/Por 132112T
Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) Suan Farma, NJ USA
Incubator Lab companion SI 300R
Microscope Leica DM 6B
Mini protean electrophoresis Bio-Rad
pH meter Mettler Toledo S20 Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions
Rotofor Bio-Rad 170-2972 http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit)
RPMI-1640 Medium HyClone DH30255.01
Sealing tape Bio-Rad 170-2960 Scotch tape may also be used.
Sorvall legend micro 17 centrifuge Thermo scientific 75002432
TPP tissue culture plate -96 well flat bottom TPP TP92696

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 160 कैंडिडा एल्बिकान,छोटे अणु गुरमरीन पेप्टाइड जिमनेमा सिल्वेस्टर,प्राकृतिक उत्पाद शुद्धिकरण बायोमॉलिक्यूल्स सेपरेशन आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग (आईईएफ) पतली परत क्रोमेटोग्राफी
बायोएक्टिव छोटे अणुओं का पृथक्करण, प्राकृतिक स्रोतों से पेप्टाइड्स और प्रिटोर्स से प्रोटीन प्रेटिव आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग (आईईएफ) विधि द्वारा
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Veerapandian, R., Paudyal, A., Chang, A., Vediyappan, G. Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Method. J. Vis. Exp. (160), e61101, doi:10.3791/61101 (2020).

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