Summary
目标是通过使用液相同电聚焦（IEF）方法，分馏和分离生物活性小分子、复杂植物提取物中的肽和致病微生物中的蛋白质。此外，分离的分子被识别，其生物活性得到确认。
Abstract
植物和微生物的天然产物是生物活性分子的丰富来源。在使用之前，复杂提取物中的活性分子必须纯化，以便下游应用。有多种色谱方法可用于此目的，但并非所有实验室都能提供高性能方法，与复杂的生物样品隔离可能很困难。在这里，我们演示了预置液相异电对焦（IEF）可以根据复杂的植物提取物（pI）分离分子，包括小分子和肽。我们采用了该方法进行复杂的生物样品分馏和表征。作为概念的证明，我们分馏了一种Gymnema sylvestre植物提取物，分离出一系列二苯丙酮皂素小分子和肽。我们还演示了使用念珠菌藻菌作为模型系统的有效微生物蛋白分离。
Introduction
从复杂的生物样品中纯化生物分子是生物实验中必不可少的一步，而且往往是困难的步骤。同电对焦（IEF）非常适合复杂生物分子的高分辨率分离，其中载体放大物根据其电荷移动，并在电场3中建立pH梯度。IEF的第一个商业载体安培利特于1964年由奥洛夫·韦斯特伯格开发，并申请了44，5的专利。载体安皮质是脂肪寡聚-氨基-碳水化合物酸分子，长度不同，分支6。随后，韦斯特伯格等人改进了载体增强剂，以扩大在分离生物分子66、77中的用途。
分离生物分子的方法包括阿甘丝和多丙烯酰胺凝胶电泳、二维凝胶电泳（2-DE）、异电聚焦、毛细血管电泳、异丙三酚酶和其他色谱技术（如TLC、FPLC、HPLC）2。2液体相IEF在一种叫做"罗托福"的仪器中执行，是由米兰比尔8发明的。他开创了该仪器的概念和设计，为电泳迁移理论做出了广泛贡献。他的研究小组还开发了一个用于计算机模拟的电泳分离过程数学模型。
液相IEF装置是一种水平旋转圆柱形电池，由尼龙芯组成，分为20个多孔隔间和一个循环水冷却陶瓷棒。多孔腔允许分子在电极之间的水相中迁移，并允许在真空下以分数收集纯化样品。此净化系统可在 <4 小时内提供高达 1000 倍的特定分子纯化。该仪器的一个有价值的特点是，它可以作为从复杂混合物中纯化的第一步，或作为实现纯度10的最后一步。如果感兴趣的分子是蛋白质，另一个好处是其原生构象将在分离过程中保持。
液体相IEF的使用被广泛报道用于蛋白质、酶和抗体纯化66、10、11、12、13、14。,10,11,12,13,14在这里，我们描述了这种方法用于分离和纯化小分子和肽从药用植物Gymnema sylvestre。该协议将帮助研究人员集中和纯化活性小分子从植物提取物下游应用低成本。此外，我们还演示了从这个基于IEF的系统中从念珠菌藻真菌中提取的复杂蛋白质中提取的蛋白质富集15作为第二个例子。
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Protocol
1. 标准液相 IEF 单元的设置和预运行
- 根据说明手册（参见材料表），将液相 IEF 电极（阳极红色按钮和阴极黑色按钮）与各自的交换膜组装。使用 0.1 M NaOH 对离子交换膜进行平衡，在使用新膜时，阳离子交换膜与 0.1 M H3PO4交换膜至少 16 小时。
- 在运行之间将膜存放在电解质中（0.1 M NaOH 或 0.1 M H3PO4），不允许干燥。
- 通过在电离交换垫片上对齐三个长孔，组装电极的内部和外部。向电极加注相应的电解质（±25-30 mL），以防止其膜干燥。
- 不要添加多余的（超过电极室体积的1/3）电解质，因为电解质可能会积聚电极内的压力并导致泄漏。
- 使用仪器装配部件附带的密封胶带盖住样品采集端口（参见材料表）。样品采集端口侧可以通过两个垂直金属对齐引脚进行标识。或者，使用标准密封胶带密封端口。
- 按顺序将对焦室组件的所有部件（阳极电极、尼龙膜芯、对焦室和阴极电极）组装在陶瓷冷却手指上。
- 使用 50 mL 注射器向对焦室加注预冷却蒸馏水（标准 IEF 电池的总体积为 60 mL）。
- 将液相 IEF 仪器连接到 4 oC 的循环冷却水，并在 15 W 和 3，000 V 下预置装置 3-5 分钟，或直到电压稳定。
注：通常，在一分钟内，电压将达到最大设定值。使用蒸馏水预运行有助于去除对焦室和尼龙膜芯中的残余离子。 - 关闭电源并使用分数收集器从电池中取出水。使用密封胶带重新密封收集端口。
注：现在仪器已准备就绪，可于步骤 2.4 中使用。
2. 从Gymnema sylvestre提取物分离和纯化小分子和肽
- 通过在滚筒管中混合 5 分钟，测量 0.6 克植物提取物，溶解在蒸馏水中 （60 mL）。
注：任何可溶性和无盐的生物样品都可用于使用本IEF仪器进行分离和纯化。缓冲盐浓度高达10 mM的样品可用于分辨率略有下降。我们感兴趣的皂素系列三联苯化合物，健身房酸，从G.sylvestre植物其独特的抗真菌特性16。 - 将溶解植物提取物在 10，000 x g下离心 5 分钟，以去除不溶性颗粒。
- 将上清液 （±60 mL） 转移到 80 mL 离心管中，并将其与 0.6 mL 的 ampholte （pH 3-10） 混合到 1% （v/v）。
- 按照步骤 1.1 + 1.7 准备液相 IEF 单元。造型室现已准备好装载样品。
- 使用带 1-1/2 英寸 19 G 钝端针（随仪器附带）的 50 mL 注射器，并通过样品采集端口将制备的样品与 ampholte（共 60 mL）一起装载到细胞中。
- 通过从支架上取下对焦单元并点击电极室来去除气泡，从而去除样品单元中的气泡。气泡的存在将导致电压和电流波动，并影响运行。
- 将装置连接到水冷却液 （4 °C），并在恒定 15 W 的电源下开始分馏。
- 运行设备 3 小时或直到电压达到恒定值。
注：当样品开始聚焦时，电压将开始逐渐攀升，直到达到恒定值。 - 运行后，通过按下 IEF 单元中的收获按钮ON，准备收集与真空泵相连的收获箱中的零度（包含 20 根塑料管，12 mm x 75 mm，5-6 mL 体积）。
- 将 20 个集合引脚与用胶带密封的对焦单元的 20 个集合端口对齐。
- 将收集销推入密封胶带，同时打开真空泵（参见图 2 Figure 2B、2C 和 2D）。
注：每次从每个腔室收集约3 mL分数到管中。分数可用于后续的下游应用（用于肽定量的SDS-PAGE、TLC和小分子的生物测定）。
3.从C.白化藻分离和纯化蛋白质
- 在30°C下在酵母-肽-德克斯（YPD）肉汤中生长单个C.藻类，一夜之间摇动（200 rpm）。
- 通过离心收集酵母细胞（10，000 x g，5分钟）。
- 悬浮碳酸铵（1.89克/升）缓冲液中的C.藻化酵母细胞，含有1%（v/v）β-甲醇（β-ME）（培养体积的1/10），并在滚管中旋转1小时，在5°C15。
- 通过离心去除酵母细胞（10，000 x g，5分钟），并通过 0.45 μm 过滤器过滤蛋白质提取物。
注：来自C.白化藻细胞溶质、膜或细胞壁的蛋白质样本可以制备并用于IEF分馏。同样，细菌或其他生物样本（动物组织提取物）中的蛋白质在通过适当的方法（例如透析或使用脱盐柱）去除盐后可以使用。 - 在4°C下，将透析管中的蛋白质提取物（3，500 MWCO）与水进行15小时透析。用伽马球蛋白作为标准17的布拉德福德染料结合法估计蛋白质浓度。
- 在含有1%（v/v）的60 mL水中使用500毫克的总蛋白质（pH 5-8）进行分馏。
注：由于广范围安培（pH 3-10）不能丰富某些非葡甘附着的细胞壁蛋白的C.白化剂，使用窄范围（pH 5-8）安培。如果样品蛋白浓度超过2mg/mL，可以使用高达2%的ampholyte浓度;这样可以最大限度地减少聚焦期间的蛋白质聚集。始终将样品、amp;amp; - 重复步骤 1.1- 1.7 准备 IEF 单元，并使用步骤 3.6 中的蛋白质溶液加载到 IEF 细胞中。
- 在恒定15W的聚焦4小时后，如上文所述，采集蛋白质分数（1-20），在减少和沸腾蛋白质样本18后分析12.5%SDS-PAGE。
- 用库马西蓝色染料染色 SDS-PAGE 凝胶，染色已解决的蛋白质 （0.01%）在摇臂室温下2-3小时的解决方案。使用凝胶成像器对凝胶进行染色并记录凝胶图像。
注： 库马西蓝色染料 （0.01%）通过将0.01克的库马西蓝粉混合在含有40%甲醇和10%醋酸的脱染色溶液中制备。
4.植物提取物中纯化小分子的生物活性
- 生长在酵母细胞中的C.白化藻，如步骤3.1。
- 为了制备细胞悬浮液，将C.白化糖酵母细胞（1/1000稀释）的过夜培养稀释成一个新鲜的RPMI细胞培养基，补充50mM葡萄糖。
注：C. 白化病在催眠诱导条件下从酵母生长转化为催眠剂（37°C的RPMI）。在催眠诱导条件下，证明金内酸小分子能抑制酵母细胞转化为催眠剂。我们的目标是确定液相-IEF分离的G.西尔维斯特提取物是否含有这些生物活性分子。 - 从制备的细胞悬浮液中，在96孔板的每个孔中加入90μL。
- 从每个分数（从液相IEF获得的G.sylvestre提取物的1-20个收获分数，图4），在孔中加入10μL，上面90μL的细胞悬浮液（步骤4.2）。以三联执行测定。
- 加入10 μL含有ampholyte的水 （1%）进入单独的井与90μL的C.白化藻酵母细胞悬浮作为负控制。
注：安培具有生物活性潜力，因此在进行任何生物测定19时，必须包括安培菌控制。 - 在37°C下孵育96孔板12小时，并在显微镜16下观察C.藻菌酵母对hypha转换的抑制。此外，确定酵母到hypha转化的抑制百分比。
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Representative Results
从Gymnema sylvestre植物提取物分离和纯化小分子和肽
采用预选液相IEF方法，从人类致病性真菌C.白化病菌中分馏药用植物提取物和细胞表面蛋白。图 1显示了这些分馏协议的原理图。
从液相IEF获得的G.sylvestre提取物的20个分数中，发现暗色分子（二烯类皂苷）在阳极端（pH 2-3）迁移和浓缩，在阴极端（pH 8-9）观察到浅黄色清除分数（图2）。在减少和煮沸样品后，每个分数（1-20）的等号（20 μL）在15%SDS-PAGE上得到解决。库马西蓝染色凝胶显示约5 kDa的漫射多肽带，以分数16-19的丰富度（图3）。据报道，G.sylvestre植物含有35个氨基酸高马林基础多肽，预测分子量为4，209Da20。细菌、植物和动物含有肽;其中许多是圆形（结核），具有广泛的生物活性，如杀虫和抗菌特性21，22。21,
分离的体液酸的生物活性
G. sylvestre植物还含有以体素皂素为主要成分16、23、2423,2416的主要成分。不出所料，SDS-PAGE和库马西染色（图3）没有检测到这些小分子在部分1和随后几个部分，因为它们是非蛋白质的。然而，这些小分子可以通过TLC分离，并在紫外光下检测到（图4A，车道F1）。分数10在TLC上不含可检测的这些小分子，这表明大多数有机小分子在分数1-3中富集。健美酸（GAs）分子被证明能抑制C.白化体酵母到hypha的过渡16，25。,25我们测定了在这项研究中收集的20个分数，用于抑制对C.白化体酵母到hypha的转化和催眠生长16的抑制活性。结果如图 4 Figure 4B，4C所示。最高活性在分数 1 中观察到，这与可以看到多个点的 TLC 结果一致。体液酸的异构体存在，并且都有类似的生物活性10。这些等构体分在1-3分数中，并显示出抑制C.白化剂海噬生长（图4A，4C，分数1）。催眠抑制的程度逐渐下降，因为它从1到10。分数10及以上鲜有或没有活动。
细胞表面蛋白质与致病性真菌分离，C.白化病
图5显示了C.白化生物细胞表面蛋白的液相IEF分馏的结果。这些细胞表面蛋白在C.白化病粘附和发病机制26中起重要作用。观察到几种不同分数的富集蛋白（箭头）。这可能允许识别其免疫反应与念珠菌感染的人类血清和/或他们的识别通过质谱。同样，来自其他细胞分数（如细胞质和细胞壁）的蛋白质也可以使用此IEF方法进行分馏。液相IEF的纯化将允许从复杂的生物样品中识别低丰度蛋白质，同时进行质谱分析。
图 1：显示实验工作流的流程图。描述了逐步液相 IEF 分馏程序以及随后的下游检测。样品包括健体西尔维斯特叶提取物（样品1）和念珠菌藻非胶糖附酵母蛋白（样本2）。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：液相IEF装置的设置和G.sylvestre植物提取物的分馏。（A） 在运行过程中， （B） 在分数收集过程中， （C） 分数收集后， 和 （D） 液相 IEF 设备部件， 1） 电子交换膜， 2） 对焦室和膜芯， 3） 电极组件 （负）， 4） 电极组件 （正）。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：以 IEF 为重点的植物提取物分数的 SDS-PAGE 分离。L-梯子，PC-正控制（肽），0 - 输入样本，1-20分离分数。SDS-PAGE （15% 的溶解凝胶） 被库马西蓝色染料染色，以可视化从分数 1-20 的解析肽 （±5 kDa）。分数 1-3 包含小分子（分数 1 具有较深的颜色表示富集化合物），这些分子不能被库马西蓝色染料染色/检测。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：TLC对IEF分馏小分子的分析，确定对C.白化生物的活性。（A） 显示从分数#1和#10小分子的 TLC 分析。活性硅胶板用于发现 +5 μL 的样品，并与甲苯一起运行：氯仿：甲醇溶剂（5：8：3 比），直到溶剂前部达到裕度。在外发紫外线（310 nm）下检测到TLC分离化合物。（B） 显示不同分数的C.白化藻酵母到hypha转换的百分比抑制。（C） 在催眠诱导条件下演示C.白化病的细胞形态。分数#1显示最大值 （98%）抑制酵母到hypha转换。其他分数和对照显示，在37°C孵育12小时后，没有抑制C.白化藻海藻的生长。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：SDS-PAGE分析C.白化藻细胞表面蛋白（非粘附）。L-梯，0 - 输入样品，1-18个分数收集后IEF在标准液相IEF细胞使用窄范围（pH 5-8）安培。图片显示 SDS-PAGE （12.5%）用库马西蓝色染料染色后解决蛋白质。几种蛋白质在某些分数（箭头）中富含。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
来自天然产品来源（如植物）的小分子包括复杂的二次代谢物，在化学结构上差异很大。据信，他们参与了植物防御机制。此外，多肽也存在于植物组织22。这些天然产物小分子是药物发现和开发测试分子的丰富来源。然而，其隔离和纯化所需的困难和繁琐的方法限制了它们用于治疗应用。本报告中使用的液相IEF方法强调了在不损害其生物活性的情况下分离这些小分子和多肽的能力。
该基于 IEF 的方法在分离生物分子方面具有多种优点，包括从复杂混合物中浓缩纯化蛋白质，在聚焦期间和之后保持原生构形，以及收集样品作为单个纯化分数，无需交叉污染。必要时，样品可以重新聚焦，pH范围缩小，以纯化蛋白质等样。由于微型 IEF 对焦单元 （±15 mL） 可用，因此也可用于较小的样品体积。这份报告的新发现是有机小分子和肽可以从复杂的植物提取物中分离出来。虽然很难同意小分子可以通过IEF从天然产物提取物中分离出来，但对于那些对二聚二恶英的化合物来说，这是合理的。与G.sylvestre提取物中的高马林肽分离的体液酸看起来是两聚二烯，因为它们含有一个碳水化合物酸组，或者至少在使用的ampholte存在的情况下，它们表现得如此。由于糖苷是生物活性天然分子，类似于健美酸，IEF方法可用于将它们从复杂的天然来源中分离出来。同样，天然产物的肽也可以使用这种液相IEF方法进行分离。
这种方法的一些局限性是，并非所有的小分子都可以通过IEF方法分馏，因为它们必须是水溶性的和弱的两栖分子，至少。这里使用的提取物是由干植物材料50%甲醇提取，但水溶性。使用IEF方法进行溶剂溶性和两聚聚物化合物仍有待观察，因为一些有机溶剂与液相IEF仪器部件不相容。蛋白质在低离子强度溶液中沉淀在等电点（pI）的倾向是众所周知的。然而，在旋转的IEF系统中，蛋白质沉淀减少，因为聚焦蛋白在其pI点保持循环。
如果在这个IEF分离中使用高浓度的蛋白质，可能会出现沉淀。为了尽量减少蛋白质沉淀和改善蛋白质聚焦，尿素可以使用高达3-5M的非离子洗涤剂，如CHAPS、Digitonin和低浓度的洗涤剂（0.1-1%）也可用于减少IEF期间的蛋白质聚集。然而，在分析蛋白质的活动之前，需要去除尿素和洗涤剂，在某些情况下，这些制剂可能会影响蛋白质功能。在液相 IEF 运行期间需要考虑的几个关键步骤包括装载 IEF 对焦电池，无气泡，在电子交换膜损坏时更换，并在一定数量的重复使用后更换通风按钮。
最后，采用液相IEF方法，从G.sylvestre叶提取物中分离出生物活性体氨酸和高马林多肽的分离。此外，液相IEF可用于丰富病原微生物复杂粗提取物中的选择性蛋白质。
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Disclosures
作者希望宣布没有相互竞争的财务利益。
Acknowledgments
我们感谢生物学司和强生癌症研究中心分别为GV颁发BRIEF和IRA奖的资金来源。我们还感谢K-INBRE博士后奖RV。这项工作得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所的机构发展奖（IDeA）的部分支持，该奖授予P20 GM103418。内容完全由作者负责，不一定代表国家普通医学研究所或国家卫生研究院的官方观点。我们感谢匿名评论者提供的有用意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
References
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