Summary
Målet är att fraktionera och isolera bioaktiva små molekyler, peptider från ett komplext växtextrakt och proteiner från patogena mikrober genom att använda ief-metoden (liquid-phase isoelectric focusing). Vidare identifierades de separerade molekylerna och deras bioaktivitet bekräftades.
Abstract
Naturliga produkter som härrör från växter och mikrober är en rik källa till bioaktiva molekyler. Före användningen måste de aktiva molekylerna från komplexa extrakt renas för nedströmsapplikationer. Det finns olika kromatografiska metoder tillgängliga för detta ändamål men inte alla laboratorier har råd med högpresterande metoder och isolering från komplexa biologiska prover kan vara svårt. Här visar vi att preparativ vätskefas isoelektrisk fokusering (IEF) kan separera molekyler, inklusive små molekyler och peptider från komplexa växtextrakt, baserat på deras isoelektriska punkter (pI). Vi har använt metoden för komplexa biologiska provfraktionering och karakterisering. Som ett proof of concept, fraktionerade vi en Gymnema sylvestre växtextrakt, isolera en familj av terpenoid saponin små molekyler och en peptid. Vi visade också effektiv mikrobiell proteinseparation med Candida albicans svamp som modellsystem.
Introduction
Rening av biomolekyler från komplexa biologiska prover är ett viktigt och ofta svårt steg i biologiska experiment1. Isoelektrisk fokusering (IEF) är väl lämpad för högupplöst separation av komplexa biomolekyler där bäraramkulterna färdas enligt deras laddning och upprättar pH-lutningen i ett elektriskt fält3. Den första kommersiella transportören ampholyte för IEF utvecklades av Olof Vesterberg 1964 och patenterade4,5. Bärarens ampholyter är alifatiska oligo-amino oligo-karboxylsyra molekyler av varierande längd och förgrening6. Därefter förbättrade Vesterberg m.fl.6,7
Metoder för att separera biomolekyler inkluderar agaros och polyakrylamid gel elektrofores, tvådimensionell gel elektrofores (2-DE), isoelektrisk fokusering, kapillär elektrofores, isotachophoresis och andra kromatografiska tekniker (t.ex., TLC, FPLC, HPLC)2. IEF i flytande fas som utfördes i ett instrument som kallas "Rotofor" uppfanns av Milan Bier8. Han banade väg för konceptet och designen av detta instrument och bidrog i stor utsträckning till teorin om elektroforesisk migration. Hans team utvecklade också en matematisk modell av elektroforesisk separationsprocess för datorsimuleringar9.
IEF-apparaten i flytande fas är en horisontellt roterande cylindrisk cell bestående av en nylonkärna uppdelad i 20 porösa fack och en cirkulerande vattenkylning keramisk stång. De porösa kamrarna gör det möjligt för molekyler att migrera genom vattenfasen mellan elektroderna och tillåta insamling av renade prover under vakuum i fraktioner. Detta reningssystem kan ge upp till 1000-faldig rening av en specifik molekyl i <4 timmar. Ett värdefullt inslag i detta instrument är att det kan tillämpas som ett första steg för rening från en komplex blandning eller som ett sista steg för att uppnå renhet10. Om molekylen av intresse är ett protein, en annan fördel är att dess inhemska konformation kommer att upprätthållas under separationen.
Användningen av vätskefas IEF har rapporterats i stor utsträckning för proteiner, enzymer och antikroppsrening6,,10,,11,12,13,14. Här beskriver vi användningen av detta tillvägagångssätt för att separera och rena små molekyler och peptider från medicinalväxten Gymnema sylvestre. Detta protokoll kommer att hjälpa forskare att koncentrera och rena aktiva små molekyler från ett växtextrakt för nedströms applikationer till låg kostnad. Dessutom visar vi också att anrikning av proteiner från ett komplext proteinextrakt från Candida albicans svamp15 i detta IEF-baserade system som ett andra exempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Installation och förkörning av standard IEF-enhet i vätskefas
- Montera IEF-elektroderna i vätskefasen (anodröd knapp och katodsvart knapp) med sina respektive utbytesmembran enligt bruksanvisningen (se Tabell över material). Jämvikta anjonbytarmembranen med 0,1 M NaOH och katjonbytesmembranen med 0,1 M H3PO4 minst 16 timmar när nya membran används.
- Förvara membranen i elektrolyter (0,1 M NaOH eller 0,1 M H3PO4) mellan körningarna och låt inte torka ut.
- Montera elektrodens inre och yttre del genom att justera tre avlånga hål i jonväxlingspackningarna. Fyll elektroderna med respektive elektrolyter (~25-30 ml) för att förhindra att deras membran torkar ut.
- Tillsätt inte överskott (mer än 1/3ekret kammare volym) elektrolyt som kan bygga upp trycket inuti elektroden och orsaka läckage.
- Täck provinsamlingsportarna med tätningstejp som medföljer instrumentets monteringsdelar (se Materialförteckning). Sidan med provinsamlingsportar kan identifieras med de två vertikala metalljusteringsstiften. Alternativt kan du använda standardtätningstejp för att täta portarna.
- Montera alla delar av fokuseringskammarens montering i följd (anodelektrod, nylonmembrankärna, fokuseringskammare och katodelektrod) över det keramiska kylfingret.
- Fyll fokuseringskammaren med förkylt destillerat vatten (total volym på 60 ml för standard-IEF-cellen) med en 50 ml-spruta.
- Anslut iEF-instrumentet i vätskefasen till ett cirkulerande kylvatten vid 4°C och kör enheten vid 15 W och 3 000 V i 3-5 min eller tills spänningen stabiliseras.
OBS: I allmänhet, inom en minut, kommer spänningen att nå de högsta inställda värdena. Prerunning med destillerat vatten hjälper till att avlägsna de kvarvarande jonerna från fokuseringskammaren och nylonmembrankärnorna. - Stäng av strömkällan och ta bort vattnet från cellen med hjälp av fraktionsuppsamlaren. Täta uppsamlingsportarna igen med tätningstejp.
OBS: Nu är instrumentet klart för användning i steg 2.4.
2. Separation och rening av små molekyler och peptider från Gymnema sylvestre extrakt
- Mät 0,6 g växtextrakt och lös upp i destillerat vatten (60 ml) genom att blanda i ett rullrör i 5 min.
OBS: Alla biologiska prov som är lösliga och fria från salt kan användas för separation och rening med hjälp av detta IEF-instrument. Prover med buffring saltkoncentration upp till 10 mM kan användas med något minskad upplösning. Vi är intresserade av saponin familjen triterpenoid föreningar, gymnemic syror, från G. sylvestre anläggningen för deras unika svampdödande egenskaper16. - Centrifugera det lösliga växtextraktet vid 10 000 x g i 5 min för att avlägsna olösliga partiklar.
- Överför supernatanten (~60 ml) till ett 80 ml centrifugrör och blanda det med 0,6 ml ampholyt (pH 3-10) till 1% (v/v).
- Följ steg 1.1 –1.7 för att förbereda IEF-enheten i vätskefas. Kammaren är nu redo att lasta provet.
- Använd en 50 ml spruta med en 1-1/2 tum 19 G trubbig ändnål (levereras med instrumentet) och ladda det beredda provet med ampholyt (60 ml totalt) i cellen genom provsamlingsportar.
- Ta bort luftbubblor från provcellen genom att ta bort fokuscellen från stativet och knacka på elektrodkammaren för att lossa bubblorna. Förekomsten av luftbubblor kommer att orsaka spänning och strömfluktuationer och påverka körningen.
- Anslut enheten till vattenkylvätskan (4 °C) och starta fraktionering med strömförsörjningen vid konstant 15 W.
- Kör apparaten i 3 timmar eller tills spänningen når ett konstant värde.
OBS: När provet börjar fokusera börjar spänningen klättra gradvis tills det når ett konstant värde. - Efter körningen, förbered för att samla fraktionerna i skördeboxen (innehållande 20 plaströr, 12 mm x 75 mm, 5-6 ml volym) som är anslutna till vakuumpumpen genom att trycka på skördeknappen PÅ i IEF-enheten.
- Justera 20-samlingsstiften med 20-uppsamlingsportarna i fokuscellen som är förseglad med tejpen.
- Tryck in uppsamlingsstiften genom tätningstejpen och slå på vakuumpumpen samtidigt (se bild 2B, 2C och 2D).
OBS: Ca 3 ml fraktioner från varje kammare kommer att samlas in i rören för varje gång. Fraktioner kan användas för efterföljande nedströmsapplikationer (SDS-PAGE för peptidkvantifiering, TLC och bioassay för små molekyler).
3. Separation och rening av proteiner från C. albicans
- Odla en lig koloni av C. albicans i jäst-pepton-dextros (YPD)buljong 16 vid 30 °C med skakningar (200 rpm) för över natten.
- Samla jästcellerna genom centrifugering (10.000 x g i 5 min).
- Suspend C. albicans jästceller i ammoniumkarbonat (1,89 g/L) buffert som innehåller 1% (v/v) beta-mercaptoetanol (β-ME) (1/10 av kulturvolymen) och rotera i ett rullrör för 1 h vid 5 °C15.
- Ta bort jästcellerna genom centrifugering (10 000 x g i 5 min) och filtrera proteinextraktet genom ett 0,45 μm filter.
OBS: Proteinprover från C. albicans cytosol, membran eller cellvägg kan beredas och användas för IEF-fraktionering. På samma sätt kan proteiner från bakterier eller andra biologiska prover (animaliskt vävnadsextrakt) användas efter avlägsnande av salt med lämpliga metoder(t.ex.genom dialys eller med hjälp av avsaltningskolonner). - Dialysera proteinextraktet i en dialysslang (3 500 MWCO) mot vatten i 15 timmar vid 4 °C. Uppskatta proteinkoncentrationen med Bradford färgbindningsmetod med gammaglobulin som standard17.
- Använd 500 mg totalt protein i 60 ml vatten som innehåller 1% (v/v) ampholyt (pH 5-8) för fraktioneringen.
OBS: Eftersom en bred förstärkare (pH 3-10) inte berikar vissa non-glukan fäst cellvägg proteiner av C. albicans väl, använd en smal-range (pH 5-8) ampholyte. En ampholytkoncentration på upp till 2 % kan användas om provproteinkoncentrationen är mer än 2 mg/ml. Detta minimerar proteinaggregering under fokusering. Håll alltid proverna, ampholyterna och vattnet förkylda på is. - Upprepa steg 1.1- 1.7 för att förbereda IEF-enheten och använd proteinlösningen från steg 3.6 för att ladda in i IEF-cellen.
- Efter 4 h fokusering vid en konstant 15 W, skörda proteinfraktioner (1-20) som beskrivs ovan (steg 2,9-2,11) och analysera på 12,5% SDS-PAGE efter att minska och koka proteinproverna18.
- Färga de lösta proteinerna genom att färga SDS-PAGE gelen med Coomassie blå färgämne (0,01%) lösning för 2-3 h vid rumstemperatur på en vipp. Avhålla gelen och spela in gelbilden med hjälp av en gelbildare.
OBS: Coomassie blå färgämne (0,01%) kan beredas genom att blanda 0,01 g Coomassie blått pulver i en avbehållningslösning som innehåller 40% metanol och 10% ättiksyra.
4. Bioaktivitet av renade små molekyler från växtextrakt Gymnema sylvestre
- Odla C. albicaner i jästceller som i steg 3.1.
- För att förbereda cellupphängning, späd över natten kultur C. albicans jästceller (1/1000 utspädning) till en ny RPMI cell odling medium kompletteras med 50 mM glukos.
OBS: C. albicaner omvandlar från jästtillväxt till hyfas under hyphal inducerande förhållanden (RPMI vid 37 °C). Gymnemiska syra små molekyler har visat sig hämma omvandlingen av jästceller till hyfas under hypha inducerande förhållanden16. Vi syftade till att avgöra om vätskefas-IEF-separerade G. sylvestre extrakt innehåller dessa bioaktiva molekyler. - Från den beredda cellfjädringen, tillsätt 90 μL till varje brunn på 96-brunnsplattan.
- Från varje fraktion (1-20 skördade fraktioner av G. sylvestre extrakt från vätskefas IEF, figur 4), tillsätt 10 μL i brunnarna med 90 μl av ovanstående cellfjädring (steg 4.2). Utför analysen i tre exemplar.
- Tillsätt 10 μl vatten som innehåller ampholyt (1%) i separata brunnar med 90 μL C. albicans jästcell suspension som en negativ kontroll.
OBS: Ampholytes har bioaktivitetspotential och därför är det viktigt att inkludera en ampholytkontroll när du utför någon bioassay19. - Inkubera 96-brunnsplattan vid 37 °C i 12 timmar och observera hämningen av C. albicans jäst-till-hypha-omvandling undermikroskopet 16. Också, bestämma andelen hämning av jäst-till-hypha konvertering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Separation och rening av små molekyler och peptider från Gymnema sylvestre växtextrakt
Med hjälp av den förberedande vätskefasen IEF-metoden fraktionerade vi medicinska växtextrakt och cellytproteiner från en human patogen svamp, C. albicans. Ett schema för dessa fraktioneringsprotokoll visas i figur 1.
Från 20 fraktioner av G. sylvestre extrakt som erhållits från flytande fas IEF, de mörkfärgade molekyler (terpenoid saponiner) befanns migrera och berikas vid anod slutet (pH 2-3) och ljusgula klara fraktioner observerades vid katodänden (pH 8-9) (figur 2). Alikvoter (20 μL) från varje fraktion (1-20) löstes på 15% SDS-PAGE efter att ha minskat och kokat proverna. En Coomassie blå-färgade gel visar diffusa polypeptid band på ca 5 kDa som är berikad i fraktioner 16-19 (Figur 3). Det har rapporterats att G. sylvestre anläggningen innehåller en 35 aminosyra gurmarin grundläggande polypeptid med den förväntade molekylvikten på 4.209 Da20. Bakterier, växter och djur innehåller peptider; många av dem är cirkulära (knottins) och stabila med ett brett utbud av biologiska aktiviteter såsom insekticida och antimikrobiella egenskaper21,22.
Biologisk aktivitet av separerade gymneminska syror
G. sylvestre anläggningen innehåller också gymnemic syror (terpenoid saponiner) som viktigaste beståndsdelar16,23,24. Som väntat upptäcktes inte dessa små molekyler i fraktion 1 och de närmaste fraktionerna av SDS-PAGE och Coomassie-färgning (figur 3) eftersom de inte är proteinhaltiga. Dessa små molekyler kan dock separeras med TLC och detekteras under UV-ljus (figur 4A, lane F1). Fraktion 10 innehöll inte en detekterbar mängd av dessa små molekyler på TLC tyder de flesta organiska små molekyler berikades i fraktioner 1-3. Gymnemiska syror (GA) molekyler visade sig hämma C. albicans jäst-till-hypha övergång16,25. Vi analyserade alla 20 fraktioner som samlats in i denna studie för deras hämmande aktivitet mot C. albicans jäst-till-hypha konvertering och hyphal tillväxt16. Resultaten visas i figur 4B,4C. Den högsta aktiviteten observeras i fraktion 1, vilket håller med TLC-resultaten där flera fläckar kan ses. Isomerer av gymnemic syror finns och alla har liknande biologiska aktiviteter10. Dessa isomers separerades i fraktion 1-3 och visar hämning av C. albicans hyphal tillväxt (Figur 4A,4C, fraktion 1). Graden av hyphal hämning minskade gradvis eftersom det går från 1 till 10. Liten eller ingen aktivitet erhölls i fraktioner 10 och uppåt.
Separation av cellytproteiner från patogen svamp, C. albicans
Resultat från ief-fraktionering av C. albicans cellyta visas i figur 5. Dessa cellytproteiner spelar viktiga roller i C. albicans vidhäftning och patogenes26. Flera berikade proteiner (pilar) i olika fraktioner observerades. Detta kan göra det möjligt att identifiera deras immunologiska reaktioner med Candida-infekterat humant serum och/eller deras identifiering genom masspektrometri. På samma sätt kan proteiner från andra cellulära fraktioner (t.ex. cytoplasma och cellvägg) fraktioneras med denna IEF-metod. Den IEF-baserade reningsgraden i flytande fas gör det möjligt att identifiera proteiner med lågt förekomst från komplexa biologiska prover, i kombination med masspektrometrianalys.
Bild 1: Flödesschema som visar det experimentella arbetsflödet. Stegvis vätskefas IEF-fraktioneringsprocedurer och efterföljande nedströmsanalyser avbildas. Proverna inkluderar Gymnema sylvestre blad extrakt (prov 1) och Candida albicans non-glucan bifogade jästproteiner (prov 2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Inställning av IEF-apparater i flytande fas och fraktionering av G. sylvestre växtextrakt. (A)Under körningen (B) under fraktioneringsuppsamling,(C)efter fraktioneringsuppsamling, och(D)delar av vätskefasen i IEF-apparater, 1) jonbytesmembran, 2) med fokusering av kammare och membrankärna, 3) elektrodenhet (negativ), 4) elektrodenhet (positiv). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: SDS-PAGE-separationer av IEF-fokuserade växtextraktfraktioner. L- stege, PC- Positiv kontroll (peptid), 0 - ingångsprov, 1-20 separerade fraktioner. SDS-PAGE (15% lösa gel) var färgas av Coomassie blå färgämne för att visualisera löst peptider (~ 5 kDa) från fraktioner 1-20. Fraktioner 1-3 innehåller små molekyler (fraktion 1 har mörkare färg som indikerar berikade föreningar) som inte kan färgas / detekteras av Coomassie blå färgämne. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Analys av IEF-fraktionerade små molekyler med TLC och bestämning av bioaktivitet mot C. albicaner. (A)Visar TLC-analys av små molekyler från fraktion #1 och #10. Aktiverad kiselgelplatta användes för att upptäcka ~5 μL av prover och sprang med toluen: kloroform: metanollösningsmedel (förhållandet 5:8:3) tills lösningsmedlet fronten nådde marginalen. TLC separerade föreningar upptäcktes under en epifluorescens UV-ljus (310 nm). (B)Visar % hämning av C. albicans jäst-till-hypha omvandling av olika fraktioner. C)Visar cellmorfologi av C. albicans under hypha inducerande förhållanden. Bråk #1 visar maximalt (98%) hämning av omvandling mellan jäst och hyfas. Andra fraktioner och kontroller visar ingen hämning av C. albicans hyphal tillväxt efter 12 timmars inkubation vid 37 °C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: SDS-PAGE-analys av C. albicans cellyteproteiner (non-glukan fäst). L- stege, 0 - ingångsprov, 1-18 fraktioner som samlats in efter IEF i en vanlig ief-cell med flytande fas med ett smalt intervall (pH 5-8) ampholyt. Bilden visar SDS-PAGE (12,5%) proteiner efter färgning med Coomassie blå färgämne. Flera proteiner berikades i vissa fraktioner (pilar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Små molekyler från naturliga produktkällor (t.ex. växter) inkluderar komplexa sekundära metaboliter som är mycket olika i kemisk struktur. De tros vara inblandade i växtförsvarsmekanismer. Dessutom finns polypeptider också iväxtvävnader 22. Dessa naturliga produkt små molekyler är rika källor till testmolekyler för läkemedelsupptäckt och utveckling. De svåra och tråkiga metoder som krävs för deras isolering och rening begränsar dock deras användning för terapeutiska tillämpningar. Den ief-metod i flytande fas som används i denna rapport belyser förmågan att separera dessa små molekyler och polypeptider utan att kompromissa med deras bioaktiviteter.
Denna IEF-baserade metod erbjuder flera fördelar med att separera biologiska molekyler, inklusive koncentration av renade proteiner från en komplex blandning, underhåll av inhemska konformationer under och efter deras fokusering, och insamling av prover som enskilda renade fraktioner utan korskontaminering. Vid behov kan proverna återfokuseras med ett smalt pH-intervall för att rena proteinisoformer. Eftersom en miniatyr IEF fokus cell (~ 15 ml) är tillgänglig, kan den användas för mindre volymer av prover också. Det nya konstaterandet från denna rapport är att organiska små molekyler och peptider kan separeras från ett komplext växtextrakt. Även om det är svårt att komma överens om att små molekyler kan separeras från naturliga produktextrakt av IEF, Det är rimligt för de föreningar som är amphoteric. Den gymnemic syror som separerades från gurmarin peptid i G. sylvestre extrakt verkar vara amphoteric eftersom de innehåller en karboxylsyra grupp eller de beter sig så åtminstone i närvaro av ampholyt används. Eftersom glykosider är bioaktiva naturliga molekyler som liknar gymnemic syror, IEF-metoden kan användas för att skilja dem från komplexa naturliga källor. På samma sätt kan peptider från naturliga produkter också isoleras med hjälp av denna ief-metod i flytande fas.
Några av begränsningarna i detta tillvägagångssätt är att inte alla små molekyler kan fraktioneras av IEF-metoden eftersom de måste vara vattenlösliga och svagt amphoteric, åtminstone. Extraktet som används här har framställts av en 50% metanol utvinning av torkat växtmaterial men är vattenlösligt. Användningen av IEF-metoden för lösningsmedelslösliga och amphoteriska föreningar återstår att se, eftersom vissa organiska lösningsmedel är oförenliga med ief-instrumentkomponenterna i vätskefas. Tendensen av proteiner att fälla ut vid sina isoelektriska punkter (pI) i låg jonisk styrka lösningar är väl känt. I ett roterande IEF-system reduceras dock proteinutfällningen eftersom de fokuserade proteinerna fortsätter att vara i omlopp vid sin pI-punkt.
Om man använder en kickkoncentration av proteiner i denna IEF-separation, kan nederbörd uppstå. För att minimera proteinnederbörden och för att förbättra proteinfokus kan urea användas upp till 3-5 M. Nonionic tvättmedel som CHAPS, digitonin och låg koncentration av rengöringsmedel (0,1-1%) kan också användas för att minska proteinaggregering under IEF. Urea och tvättmedel måste dock avlägsnas innan proteinerna analyseras för sin aktivitet och i vissa fall kan dessa medel påverka proteinfunktionerna. Några kritiska steg att tänka på under en vätskefas IEF-körning inkluderar lastning av IEF-fokuseringscellen utan luftbubblor, ersätter jonbytsmembranen om de skadades och ersätter ventilationsknapparna efter ett visst antal upprepade användningsområden.
Sammanfattningsvis, med hjälp av flytande-fas IEF-metoden, har vi visat separation av bioaktiva gymnemic syror och gurmarin polypeptid från G. sylvestre blad extrakt. Vidare kan vätskefas IEF vara användbart för att berika selektiva proteiner från komplexa råextrakt av patogena mikrober.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna vill inte redovisa några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för finansieringskällorna från Avdelningen för biologi och Johnson Cancer Research Center för BRIEF och IRA utmärkelser, respektive till GV. Vi tackar också K-INBRE postdoc award till RV. Detta arbete stöddes delvis av Institutional Development Award (IDeA) från National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health under bidragsnummer P20 GM103418. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna hos National Institute of General Medical Sciences eller National Institutes of Health. Vi tackar anonyma granskare för deras hjälpsamma kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
References
- Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
- Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins. Proteomes. 5 (1), (2017).
- Stoyanov, A. IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution. Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).
- Vesterberg, O. A. Y. Method of Isoelectric Fractionation. , US3485736A (1964).
- Vesterberg, O., Svensson, H. Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins. Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).
- Righetti, P. G. Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , Elsevier Science. 1 (1983).
- Vesterberg, O. Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes. Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).
- Bier, M. Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis. Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).
- Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation. Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).
- Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure. Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).
- Wagner, L., et al. Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization. Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).
- Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing. Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).
- Yu, J. J., et al. Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice. Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).
- Riyong, D., et al. Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).
- Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins. Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).
- Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans. PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides. Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).
- Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre. Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).
- Craik, D. J. Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends. Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).
- Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).
- Stoecklin, W. Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).
- Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).
- Veerapandian, R., Vediyappan, G. Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms. Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).
- Chaffin, W. L. Candida albicans cell wall proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).
