Summary
Målet er å fraksjonere og isolere bioaktive små molekyler, peptider fra et komplekst planteekstrakt og proteiner fra patogene mikrober ved å bruke væskefase isoelektrisk fokusering (IEF) metode. Videre ble de separerte molekylene identifisert og deres bioaktivitet bekreftet.
Abstract
Naturlige produkter avledet fra planter og mikrober er en rik kilde til bioaktive molekyler. Før bruk må de aktive molekylene fra komplekse ekstrakter renses for nedstrøms applikasjoner. Det finnes ulike kromatografiske metoder tilgjengelig for dette formålet, men ikke alle laboratorier har råd til høy ytelse metoder og isolasjon fra komplekse biologiske prøver kan være vanskelig. Her viser vi at forberedende væskefase isoelektrisk fokus (IEF) kan skille molekyler, inkludert små molekyler og peptider fra komplekse planteekstrakter, basert på deres isoelektriske punkter (pI). Vi har brukt metoden for kompleks biologisk prøvefraksjonering og karakterisering. Som et konseptbevis fraksjonerte vi et Gymnema sylvestre planteekstrakt, isolerer en familie av terpenoid saponin små molekyler og et peptid. Vi demonstrerte også effektiv mikrobiell proteinseparasjon ved hjelp av Candida albicans-soppen som et modellsystem.
Introduction
Rensing av biomolekyler fra komplekse biologiske prøver er et viktig og ofte vanskelig skritt i biologiske eksperimenter1. Isoelektrisk fokus (IEF) er godt egnet for høyoppløselig separasjon av komplekse biomolekyler der transportør amfolytter reiser i henhold til deres kostnad og etablere pH gradient i et elektrisk felt3. Den første kommersielle transportøren ampholyte for IEF ble utviklet av Olof Vesterberg i 1964 og patentert4,5. Bærer amfolytter er alifatiske oligo-amino oligo-karboksylsyre molekyler av varierende lengde og forgrening6. Deretter forbedret Vesterberg og andre transportøren amfolytter for deres utvidede bruk i å skille biomolekyler6,7.
Metoder for å skille biomolekyler inkluderer agarose og polyakrylamid gel elektroforese, todimensjonal gel elektroforese (2-DE), isoelektrisk fokusering, kapillær elektroforese, isotachophoresis og andre kromatografiske teknikker (f.eks TLC, FPLC, HPLC)2. Flytende fase IEF utført i et instrument kalt en "Rotofor" ble oppfunnet av Milan Bier8. Han var en pioner innen konseptet og utformingen av dette instrumentet og bidro mye til teorien om elektroforetisk migrasjon. Hans team utviklet også en matematisk modell av elektroforetisk separasjonsprosess for datasimuleringer9.
IEF-apparatet i væskefase er en horisontalt roterende sylindrisk celle som består av en nylonkjerne delt inn i 20 porøse rom og en sirkulerende vannkjølende keramisk stang. De porøse kamrene tillater molekyler å migrere gjennom den vandige fasen mellom elektrodene og tillate innsamling av rensede prøver under vakuum i fraksjoner. Dette rensesystemet kan gi opptil 1000 ganger rensing av et bestemt molekyl i <4 timer. Et verdifullt trekk ved dette instrumentet er at det kan brukes som et første skritt for rensing fra en kompleks blanding eller som et siste skritt for å oppnå renhet10. Hvis molekylet av interesse er et protein, er en annen fordel at dens opprinnelige konformasjon vil bli opprettholdt under separasjonen.
Bruken av flytende fase IEF er rapportert mye for proteiner, enzymer og antistoffrensing6,,10,,11,,12,,13,,14. Her beskriver vi bruken av denne tilnærmingen for å skille og rense små molekyler og peptider fra den medisinske planten Gymnema sylvestre. Denne protokollen vil hjelpe forskere konsentrere og rense aktive små molekyler fra et planteekstrakt for nedstrøms applikasjoner til lave kostnader. I tillegg viser vi også at berikelse av proteiner fra et komplekst proteinekstrakt fra Candida albicans sopp15 i dette IEF-baserte systemet som et annet eksempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oppsett og forhåndskjøring av standard IEF-enhet i væskefase
- Monter iefelektrodene i væskefase (anoderød knapp og katode-svart knapp) med sine respektive utvekslingsmembraner i henhold til bruksanvisningen (se Materialbord). Likevekt anionutvekslingsmembranene med 0,1 M NaOH og kationutvekslingsmembranene med 0,1 M H3PO4 minst i 16 timer når nye membraner brukes.
- Oppbevar membranene i elektrolytter (0,1 M NaOH eller 0,1 M H3PO4) mellom løypene og ikke la tørke ut.
- Monter den indre og ytre delen av elektroden ved å justere tre avlange hull i ionutvekslingspakningene. Fyll elektrodene med respektive elektrolytter (~ 25-30 ml) for å hindre at membranene tørker ut.
- Ikke tilsett overflødig (mer enn 1/3rd elektrodekammervolum) elektrolytt som kan bygge opp trykket inne i elektroden og forårsake lekkasje.
- Dekk prøvesamlingsportene med tetningstape som følger med instrumentenhetens deler (se Materialersbord). Prøvesamlingsportsiden kan identifiseres med de to vertikale metallinnrettingspinnene. Alternativt kan du bruke standard tetningstape for å forsegle portene.
- Monter alle deler av fokuseringskammerenheten i rekkefølge (anodeelektrode, nylonmembrankjerne, fokuseringskammer og katodeelektrode) over den keramiske kjølefingeren.
- Fyll fokuskammeret med forkjølet destillert vann (totalt volum på 60 ml for standard IEF-celle) ved hjelp av en 50 ml sprøyte.
- Koble iEF-apparatet i væskefase til et sirkulerende kjølevann ved 4 ºC og forløp enheten ved 15 W og 3000 V i 3-5 min eller til spenningen stabiliserer seg.
MERK: Vanligvis, innen ett minutt, vil spenningen nå de maksimale innstilte verdiene. Prerunning med destillert vann bidrar til å fjerne restioner fra fokuskammeret og nylonmembrankjernen. - Slå av strømkilden og fjern vannet fra cellen ved hjelp av brøksamleren. Forsegle oppsamlingsportene på nytt med tetningstape.
MERK: Nå er instrumentet klart til bruk i trinn 2.4.
2. Separasjon og rensing av små molekyler og peptider fra Gymnema sylvestre ekstrakt
- Mål 0,6 g planteekstrakt og oppløs i destillert vann (60 ml) ved å blande i et rullerør i 5 min.
MERK: Enhver biologisk prøve som er løselig og fri for salt kan brukes til separasjon og rensing ved hjelp av dette IEF-instrumentet. Prøver med bufring saltkonsentrasjon opp til 10 mM kan brukes med litt redusert oppløsning. Vi er interessert i saponin familien av triterpenoid forbindelser, gymnemiske syrer, fra G. sylvestre plante for sine unike antifungale egenskaper16. - Sentrifuger det sålubiliserte planteekstraktet ved 10.000 x g i 5 min for å fjerne uoppløselige partikler.
- Overfør supernatanten (~ 60 ml) til et 80 ml sentrifugerør, og bland det med 0,6 ml amfolytt (pH 3-10) til 1 % (v/v).
- Følg trinn 1.1 – 1.7 for å klargjøre IEF-enheten i væskefase. Kammeret er nå klart til å laste prøven.
- Bruk en 50 ml sprøyte med en 1-1/2 tomme 19 G stump kanyle (leveres med instrumentet) og legg den tilberedte prøven med ampholytt (60 ml totalt) i cellen gjennom prøveinnsamlingsporter.
- Fjern luftbobler fra prøvecellen ved å fjerne fokuscellen fra stativet og trykke på elektrodekammeret for å løsne boblene. Tilstedeværelsen av luftbobler vil forårsake spenning og strømsvingninger og påvirke løpet.
- Koble enheten til vannkjølevæsken (4 °C) og start fraksjoneringen med strømforsyningen med konstant 15 W.
- Kjør apparatet i 3 timer eller til spenningen når en konstant verdi.
MERK: Når prøven begynner å fokusere, vil spenningen begynne å klatre gradvis til den når en konstant verdi. - Etter løpet, forberede å samle brøkene i innhøstingsboksen (som inneholder 20 plastrør, 12 mm x 75 mm, 5-6 ml volum) koblet til vakuumpumpen ved å trykke på innhøstingsknappen PÅ i IEF-enheten.
- Juster 20-innsamlingspinnene med 20-oppsamlingsportene i fokuseringscellen som er forseglet med båndet.
- Skyv oppsamlingspinnene gjennom tetningstapen og slå vakuumpumpen PÅ samtidig (se figur 2B, 2C og 2D).
MERK: Omtrent 3 ml brøker fra hvert kammer vil bli samlet inn i rørene for hver gang. Fraksjoner kan brukes til etterfølgende nedstrøms applikasjoner (SDS-PAGE for peptid kvantifisering, TLC og bioanalyse for små molekyler).
3. Separasjon og rensing av proteiner fra C. albicans
- Vokse enkelt koloni av C. albicans i gjær-pepton-dextrose (YPD) kjøttkraft16 ved 30 ° C med risting (200 rpm) for over natten.
- Samle gjærcellene ved sentrifugering (10.000 x g i 5 min).
- Suspend C. albicans gjærceller i ammoniumkarbonat (1,89 g/l) buffer som inneholder 1% (v/ v) beta-mercaptoethanol (β-ME) (1/10th av kulturvolumet) og roter i et rullerør i 1 timer ved 5 °C15.
- Fjern gjærcellene ved sentrifugering (10 000 x g i 5 min) og filtrer proteinekstraktet gjennom et 0,45 μm filter.
MERK: Proteinprøver fra C. albicans cytosol, membran eller cellevegg kan tilberedes og brukes til IEF-fraksjonering. På samme måte kan proteiner fra bakterier eller andre biologiske prøver (animalsk vevsekstrakt) brukes etter å ha fjernet salt ved egnede metoder (f.eks.ved dialyse eller bruk av avsaltingskolonner). - Dialyser proteinekstraktet i en dialyserør (3500 MWCO) mot vann i 15 timer ved 4 °C. Anslå proteinkonsentrasjonen ved Bradford fargestoffbindende metode ved hjelp av gamma globulin som standard17.
- Bruk 500 mg totalt protein i 60 ml vann som inneholder 1 % (v/v) ampholytt (pH 5-8) for fraksjoneringen.
MERK: Siden en bredskive ampholytt (pH 3-10) ikke beriker visse ikke-glukanerte celleveggproteiner av C. albicans godt, bruk et smalområde (pH 5-8) amfolytt. En amfolytkonsentrasjon på opptil 2 % kan brukes hvis proteinkonsentrasjonen av prøven er mer enn 2 mg/ml; Dette minimerer proteinaggregasjon under fokusering. Hold alltid prøvene, amfolytene og vannet forkjølt på is. - Gjenta trinn 1.1- 1.7 for å klargjøre IEF-enheten og bruk proteinoppløsningen fra trinn 3.6 til å lastes inn i IEF-cellen.
- Etter 4 timer med fokus på en konstant 15 W, høste proteinfraksjoner (1-20) som beskrevet ovenfor (trinn 2,9-2,11) og analysere på 12,5% SDS-PAGE etter å ha redusert og kokt proteinprøvene18.
- Flekk de løste proteinene ved å farge SDS-PAGE gelen med Coomassie blå fargestoff (0,01%) oppløsning for 2-3 timer ved romtemperatur på en vippe. Destain gelen og ta opp gelbildet ved hjelp av en gel imager.
MERK: Coomassie blå fargestoff (0,01%) kan tilberedes ved å blande 0,01 g Coomassie blått pulver i en avslutningsløsning som inneholder 40% metanol og 10% eddiksyre.
4. Bioaktivitet av renset små molekyler fra planteekstrakt Gymnema sylvestre
- Grow C. albicans i gjærceller som i trinn 3.1.
- For å forberede cellesuspensjon, fortynne over natten kultur av C. albicans gjær celler (1/1000 fortynning) i en frisk RPMI celle kultur medium supplert med 50 mM glukose.
MERK: C. albicans konverterer fra gjærvekst til hyphae under hyphal inducing conditions (RPMI ved 37 °C). Gymnemisk syre små molekyler er vist å hemme konvertering av gjærceller til hyphae under hypha induserende forhold16. Vi hadde som mål å avgjøre om væskefase-IEF-separert G. sylvestre ekstrakt inneholder disse bioaktive molekyler. - Fra den tilberedte cellefjæringen legger du til 90 μL til hver brønn av 96-brønnplaten.
- Fra hver brøkdel (1-20 høstede fraksjoner av G. sylvestre ekstrakt hentet fra flytende fase IEF, Figur 4), tilsett 10 μL i brønnene med 90 μL av den ovennevnte celleoppheng (trinn 4.2). Utfør analysen i triplicate.
- Tilsett 10 μL vann som inneholder ampholytt (1 %) i separate brønner med 90 μL C. albicans gjærcellesuspensjon som en negativ kontroll.
MERK: Ampholytter har bioaktivitetspotensial, og derfor er det viktig å inkludere en amfolytskontroll mens du utfører bioanalyse19. - Inkuber 96-brønnplaten ved 37 °C i 12 timer og følg hemmingen av C. albicans gjær-til-hypha konvertering under mikroskopet16. Også bestemme prosentandelen av hemming av gjær-til-hypha konvertering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Separasjon og rensing av små molekyler og peptider fra Gymnema sylvestre planteekstrakt
Ved hjelp av den forberedende flytende fasen IEF-metoden fraksjonerte vi medisinske planteekstrakter og celleoverflateproteiner fra en menneskelig patogen sopp, C. albicans. Et skjematisk av disse brøkprotokollene vises i figur 1.
Fra 20 fraksjoner av G. sylvestre ekstrakt hentet fra væskefase IEF, ble de mørke fargede molekylene (terpenoid saponiner) funnet å migrere og bli beriket ved anode enden (pH 2-3) og de lysgule klare brøkene ble observert ved katodeenden (pH 8-9) (Figur 2). Aliquots (20 μL) fra hver brøk (1-20) ble løst på 15% SDS-PAGE etter reduksjon og koking av prøvene. En Coomassie blåfarget gel viser det diffuserte polypeptidbåndet på ca. 5 kDa som er beriket i fraksjoner 16-19 (Figur 3). Det har blitt rapportert at G. sylvestre anlegget inneholder en 35 aminosyre gurmarin grunnleggende polypeptid med den forventede molekylvekt på 4209 Da20. Bakterier, planter og dyr inneholder peptider; mange av dem er sirkulære (knuter) og stabile med bredt spekter av biologiske aktiviteter som insekticide og antimikrobielle egenskaper21,22.
Biologisk aktivitet av separerte gymnemiske syrer
G. sylvestre anlegget inneholder også gymnemiske syrer (terpenoid saponiner) som storebestanddeler 16,,23,24. Som forventet ble disse små molekylene i brøk 1 og de neste fraksjonene ikke oppdaget av SDS-PAGE og Coomassie-farging (figur 3) siden de ikke er proteiniske. Imidlertid kan disse små molekylene skilles med TLC og oppdages under UV-lys (Figur 4A, kjørefelt F1). Brøkdel 10 inneholdt ikke en påviselig mengde av disse små molekylene på TLC som antyder at de fleste organiske små molekylene ble beriket i fraksjoner 1-3. Gymnemiske syrer (GAs) molekyler ble vist å hemme C. albicans gjær-til-hypha overgang16,25. Vi sa alle 20 fraksjoner samlet i denne studien for deres hemmende aktivitet mot C. albicans gjær-til-hypha konvertering og hyphal vekst16. Resultatene vises i figur 4B,4C. Den høyeste aktiviteten observeres i brøkdel 1, som er enig med TLC-resultatene der flere flekker kan ses. Isomers av gymnemiske syrer eksisterer og alle har lignende biologiske aktiviteter10. Disse isomerene ble separert i brøkdel 1-3 og viser hemming av C. albicans hyphal vekst(Figur 4A,4C, brøkdel 1). Graden av hyphal hemming ble gradvis redusert som det går fra 1 til 10. Liten eller ingen aktivitet ble oppnådd i brøk 10 og over.
Separasjon av celleoverflateproteiner fra patogen sopp, C. albicans
Resultater fra væskefase IEF-fraksjonering av C. albicans celleoverflateproteiner er vist i figur 5. Disse celleoverflateproteinene spiller viktige roller i C. albicans adhesjon og patogenese26. Flere berikede proteiner (piler) i forskjellige fraksjoner ble observert. Dette kan tillate identifisering av deres immunologiske reaksjoner med Candida infisert humant serum og/eller deres identifikasjon av massespektrometri. På samme måte kan proteiner fra andre cellulære fraksjoner (f.eks. cytoplasma og cellevegg) fraksjoneres ved hjelp av denne IEF-metoden. Den væskefase IEF-baserte rensingen vil tillate identifisering av lav overflod proteiner fra komplekse biologiske prøver, når kombinert med massespektrometri analyse.
Figur 1: Flytskjema som viser den eksperimentelle arbeidsflyten. Trinnvis flytende fase IEF-fraksjoneringsprosedyrer og påfølgende nedstrømsanalyser er avbildet. Eksempler inkluderer Gymnema sylvestre blad ekstrakt (prøve 1) og Candida albicans ikke-glukan festet gjær proteiner (prøve 2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Oppsett av flytende fase IEF-apparater og fraksjonering av G. sylvestre planteekstrakt. (A) Under kjøringen , (B) under brøk samling, (C) etter brøk samling, og (D) væskefase IEF apparater deler, 1) iion utveksling membraner, 2) fokusering kammer og membran kjerne, 3) elektrode montering (negativ), 4) elektrode montering (positiv). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: SDS-PAGE-separasjoner av IEF-fokuserte planteekstraktfraksjoner. L- stige, PC- Positiv kontroll (peptid), 0 - inndataprøve, 1-20 separerte fraksjoner. SDS-PAGE (15% løse gel) ble farget av Coomassie blå fargestoff for å visualisere de løste peptider (~ 5 kDa) fra fraksjoner 1-20. Fraksjoner 1-3 inneholder små molekyler (brøk 1 har mørkere farge som indikerer berikede forbindelser) som ikke kan farges/ oppdages av Coomassie blå fargestoff. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Analyse av IEF fraksjonerte små molekyler ved TLC og bestemmelse av bioaktivitet mot C. albicans. (A) Viser TLC analyse av små molekyler fra brøkdel #1 og #10. Aktivert silikagelplate ble brukt til å oppdage ~5 μL prøver og løp med toluen: kloroform: metanolløsemiddel (5:8:3 ratio) til løsningsmidlen nådde marginen. TLC separerte forbindelser ble påvist under et epifluorescens UV-lys (310 nm). (B)Viser % hemming av C. albicans gjær-til-hypha konvertering av forskjellige fraksjoner. (C)Demonstrerer cellemorfologien til C. albicans under hypha inducing forhold. Brøk #1 viser maksimum (98 %) hemming av gjær-til-hypha konvertering. Andre fraksjoner og kontroller viser ingen hemming av C. albicans hyphal vekst etter 12 timer med inkubasjon ved 37 °C. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: SDS-PAGE-analyse av C. albicans celleoverflateproteiner (ikke-glukan festet). L- stige, 0 - inndataprøve, 1-18 fraksjoner samlet inn etter IEF i en standard flytende fase IEF-celle ved hjelp av et smalt område (pH 5-8) amfolytt. Bildet viser SDS-PAGE (12,5 %) proteiner etter farging med Coomassie blå fargestoff. Flere proteiner ble beriket i visse fraksjoner (piler). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Små molekyler fra naturlige produktkilder (f.eks. planter) inkluderer komplekse sekundære metabolitter som er svært varierte i kjemisk struktur. De antas å være involvert i planteforsvarsmekanismer. I tillegg er polypeptider også tilstede i plantevev22. Disse naturlige produkt små molekyler er rike kilder til testmolekyler for narkotikaoppdagelse og utvikling. Men de vanskelige og kjedelige metodene som kreves for deres isolasjon og rensing begrenser bruken for terapeutiske applikasjoner. Den flytende fasen IEF tilnærming som brukes i denne rapporten fremhever evnen til å skille disse små molekyler og polypeptider uten å gå på akkord med deres bioaktiviteter.
Denne IEF-baserte metoden gir flere fordeler ved å skille biologiske molekyler, inkludert konsentrasjon av rensede proteiner fra en kompleks blanding, vedlikehold av innfødt konformasjon under og etter deres fokusering, og innsamling av prøver som individuelle rensede fraksjoner uten krysskontaminering. Når det er nødvendig, kan prøver re-fokusert med et smalt pH-område for å rense proteinisoformer. Siden en miniatyr IEF fokusering celle (~ 15 ml) er tilgjengelig, kan den brukes til mindre mengder prøver også. Det nye funnet fra denne rapporten er at organiske små molekyler og peptider kan skilles fra et komplekst planteekstrakt. Selv om det er vanskelig å være enig i at små molekyler kan skilles fra naturlige produktekstrakter av IEF, er det sannsynlig for de forbindelsene som er amfieriske. Gymnemiske syrer som ble skilt fra gurmarin peptid i G. sylvestre ekstrakt synes å være amfiotisk som de inneholder en karboksylic syre gruppe eller de oppfører seg så i hvert fall i nærvær av amfolytten som brukes. Siden glykosider er bioaktive naturlige molekyler som ligner gymnemiske syrer, kan IEF-metoden brukes til å skille dem fra komplekse naturlige kilder. På samme måte kan peptider fra naturlige produkter også isoleres ved hjelp av denne flytende fasen IEF tilnærming.
Noen av begrensningene i denne tilnærmingen er at ikke alle små molekyler kan fraksjoneres av IEF-metoden, da de må være vannløselige og svakt amfiberiske, i det minste. Ekstraktet som brukes her ble utarbeidet av en 50% metanolutvinning av tørket plantemateriale, men er vannløselig. Bruken av IEF-metoden for løsemiddelløselige og amfieriske forbindelser gjenstår å se på som noen av de organiske løsemidlene er uforenlige med de flytende fasen IEF instrumentkomponenter. Tendensen til proteiner å utløse på sine isoelektriske punkter (pI) i lav ionisk styrke løsninger er velkjent. Men i et roterende IEF-system reduseres proteinnedbøyen etter hvert som de fokuserte proteinene forblir i omløp på pI-punktet.
Hvis man bruker en høy konsentrasjon av proteiner i denne IEF separasjon, kan det oppstå nedbør. For å minimere proteinnedbør og for å forbedre proteinfokus, kan urea brukes opptil 3-5 M. Nonioniske vaskemidler som CHAPS, digitonin og lav konsentrasjon av vaskemidler (0,1-1%) kan også brukes til å redusere proteinaggregasjon under IEF. Urea og vaskemidler må imidlertid fjernes før de analyserer proteinene for aktiviteten, og i noen tilfeller kan disse midlene påvirke proteinfunksjonene. Noen kritiske trinn å vurdere under en flytende fase IEF kjøre inkluderer lasting IEF fokusering celle uten luftbobler, erstatte ion utveksling membraner hvis de ble skadet, og erstatte ventilasjonsknappene etter et visst antall gjentatte bruksområder.
Til slutt, ved hjelp av væskefase IEF-metoden, har vi vist separasjon av bioaktive gymnemiske syrer og gurmarin polypeptid fra G. sylvestre bladekstrakt. Videre kan flytende fase IEF være nyttig for å berike selektive proteiner fra de komplekse råoljeekstraktene av patogene mikrober.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ønsker å erklære ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for finansieringskildene fra henholdsvis Division of Biology og Johnson Cancer Research Center for BRIEF og IRA til GV. Vi takker også K-INBRE postdoktorprisen til RV. Dette arbeidet ble delvis støttet av Institutional Development Award (IDeA) fra National Institute of General Medical Sciences ved National Institutes of Health under tilskuddsnummer P20 GM103418. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institute of General Medical Sciences eller National Institutes of Health. Vi takker de anonyme anmelderne for deres nyttige kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
References
- Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
- Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins. Proteomes. 5 (1), (2017).
- Stoyanov, A. IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution. Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).
- Vesterberg, O. A. Y. Method of Isoelectric Fractionation. , US3485736A (1964).
- Vesterberg, O., Svensson, H. Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins. Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).
- Righetti, P. G. Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , Elsevier Science. 1 (1983).
- Vesterberg, O. Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes. Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).
- Bier, M. Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis. Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).
- Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation. Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).
- Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure. Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).
- Wagner, L., et al. Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization. Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).
- Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing. Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).
- Yu, J. J., et al. Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice. Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).
- Riyong, D., et al. Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).
- Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins. Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).
- Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans. PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides. Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).
- Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre. Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).
- Craik, D. J. Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends. Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).
- Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).
- Stoecklin, W. Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).
- Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).
- Veerapandian, R., Vediyappan, G. Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms. Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).
- Chaffin, W. L. Candida albicans cell wall proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).
