Summary
目的は、液相等電体集光(IEF)法を用いることによって、生理活性小分子、複雑な植物抽出物からのペプチド、および病原性微生物からのタンパク質を分画し、単離することです。さらに、分離した分子を同定し、その生物活性を確認した。
Abstract
植物や微生物由来の天然物は、生物活性分子の豊富な供給源です。使用する前に、複雑な抽出物からの活性分子を下流の適用のために精製しなければならない。この目的のために利用可能な様々なクロマトグラフィー方法がありますが、すべてのラボが高性能の方法を提供できるわけではないし、複雑な生物学的サンプルからの分離は困難な場合があります。ここでは、微分液体相等圧体集光(IEF)が、その等電点(pI)に基づいて、小分子やペプチドを含む分子を複雑な植物抽出物から分離できることを実証する。我々は、複雑な生物学的サンプル分画と特性評価にこの方法を用いた。概念実証として、我々は、小分子とペプチドのテルペノイドサポニンのファミリーを単離し、ジムネマシルヴェストル植物抽出物を分画した。また、カンディダ・アルビカンス菌をモデルとして用いた微生物タンパク質分離の効果も実証した。
Introduction
複雑な生体試料からの生体分子の精製は、生物学的実験において不可欠かつしばしば困難なステップである1。等電式焦点(IEF)は、担体アンホリュートが電荷に従って移動し、電場3にpH勾配を確立する複雑な生体分子の高解像度分離に適している。IEFのための最初の商業キャリアアンプホーリテは、1964年にオロフ・ヴェスターベルクによって開発され、特許を取得しました4,5.担体アンプリエステルは、脂肪族オリゴ-アミノオリゴ-カルボン酸分子の様々な長さと分岐6.その後、ベスターバーグらは生体分子,6,7を分離する際の使用拡大のためにキャリアアンプリ6ケートを改良した。
生体分子を分離する方法としては、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動(2-DE)、等電集、キャピラリー電気泳動、イソタコフォレシス、その他のクロマトグラフィー技術(例えば、TLC、FPLC、HPLC)2が挙げられる。2「ロトフォー」と呼ばれる器械で行われた液体相IEFは、ミラノ・ビア8によって発明された。彼は、この装置のコンセプトとデザインを開拓し、電気泳動の理論に広く貢献しました。彼のチームはまた、コンピュータシミュレーションのための電気泳動分離プロセスの数学的モデルを開発しました 9.
液相IEF装置は、20の多孔質コンパートメントと循環水冷却セラミックロッドに分割されたナイロンコアからなる水平回転円筒形セルである。多孔質チャンバーは、分子が電極間の水相を通って移動することを可能にし、分画の真空下で精製されたサンプルの収集を可能にする。この精製システムは、特定の分子を<4時間で最大1000倍に精製することができます。この装置の貴重な特徴は、複雑な混合物から精製するための第一歩として、または純度10を達成するための最終ステップとして適用することができるということです。目的の分子がタンパク質である場合、別の利点は、その天然の立体構造が分離中に維持されることである。
液体相IEFの使用は、タンパク質、酵素および抗体,,精製66、10、11、12、13、1410,11について広く報告されている。13,1412ここでは、このアプローチを用いて、小分子とペプチドを薬用植物Gymnema sylvestreから分離および精製する方法について説明します。このプロトコルは、研究者が低コストで下流のアプリケーションのための植物抽出物から活性小分子を濃縮し、精製するのに役立ちます。また、このIEF系系ではカンジダ・アルビカンス菌15から抽出した複雑なタンパク質抽出物からのタンパク質の濃縮が2番目の例として示される。
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Protocol
1. 標準液相 IEF ユニットの設定と前実行
- 取扱説明書に従って、液体相IEF電極(アノードレッドボタンとカソードブラックボタン)をそれぞれの交換膜で組み立てます(資料表を参照)。新しい膜を使用する場合、0.1 M NaOHとイオン交換膜を0.1 M H3PO4で平衡化します。
- 膜を電解質(0.1 M NaOHまたは0.1 MH3PO4)で保存し、乾燥させないでください。
- イオン交換ガスケットに3つの楕円形の穴を合わせることで、電極の内側と外側の部分を組み立てます。それぞれの電解質(〜25~30 mL)を電極に充填して、膜が乾燥するのを防ぎます。
- 電極内部に圧力を蓄積し、漏れを引き起こす可能性のある過剰な(電極室容積の1/3rd以上)電解質を加えないでください。
- サンプル収集ポートを、計器アセンブリパーツに付属のシールテープで覆います(「材料表」を参照)。サンプル収集ポート側は、2本の垂直金属位置合わせピンで識別できます。または、標準のシールテープを使用してポートをシールします。
- セラミック冷却フィンガー上に、集電室アセンブリのすべての部品(アノード電極、ナイロン膜コア、集光チャンバ、カソード電極)を順番に組み立てます。
- 50 mL シリンジを使用して、あらかじめ冷却された蒸留水 (標準 IEF セルの総容積 60 mL) を集中するチャンバーに充填します。
- 液体相IEF装置を4°Cの循環冷却水に接続し、3~5分または電圧が安定するまで15 Wと3,000 Vでユニットを予め実行します。
メモ:一般的に、1分以内に電圧が設定値の最大値に達します。蒸留水で前走すると、焦点を絞るチャンバーとナイロン膜コアから残留イオンを除去するのに役立ちます。 - 電源をオフにし、分数コレクターを使用してセルから水を取り除きます。シーリングテープで回収ポートを再シールします。
メモ:これで、計測器はステップ2.4で使用できます。
2.ジムネマシルヴェストル抽出物からの小分子とペプチドの分離と精製
- 0.6gの植物エキスを測定し、5分間ローラーチューブに混合して蒸留水(60mL)に溶解します。
注:塩分が可溶で、塩分が無い生物学的試料は、このIEF装置を用いた分離精製に使用できます。10 mMまでの緩衝塩濃度のサンプルは、わずかに減少した分解能で使用できます。我々は、トリテルペノイド化合物のサポニンファミリーに興味を持っています, ジムネミック酸, G. シルヴェストル植物からそのユニークな抗真菌特性16. - 可溶化した植物抽出物を5分間5分間の遠心分離して不溶g性粒子を除去する。
- 上清(60mL)を80 mL遠心管に移し、0.6mLのアンプホリ酸塩(pH 3-10)を1%(v/v)に混ぜます。
- 手順 1.1 ~ 1.7 に従って、液相 IEF ユニットを準備します。チャンバーはサンプルをロードする準備が整いました。
- 1-1/2インチ19G鈍エンドニードル(器械付属)と50 mLのシリンジを使用し、サンプル採取ポートを通して細胞にアンプリケート(合計60 mL)で準備されたサンプルをロードします。
- スタンドからフォーカスセルを取り出し、電極チャンバーをタップして気泡を外すことで、サンプルセルから気泡を取り除きます。気泡の存在は電圧と電流の変動を引き起こし、実行に影響を与えます。
- 水の冷却水(4 °C)に単位を接続し、一定の15 Wで電源で分画を開始します。
- 3時間、または電圧が一定値に達するまで装置を実行します。
注:サンプルが焦点を合わせ始めると、電圧は一定の値に達するまで徐々に上昇し始めます。 - 実行後、IEFユニットで収穫ボタンONを押して真空ポンプに接続された収穫箱(20本のプラスチックチューブ、12mm x 75 mm、5〜6 mL体積を含む)の分数を収集する準備をします。
- テープで密封されているフォーカスセルの20個のコレクション・ポートに、20個のコレクション・ピンを合わせます。
- 収集ピンをシーリングテープに押し込み、同時に真空ポンプをオンにします(図2B、2C、2Dを参照)。
注:各チャンバから約3 mLの分率は、各時間のチューブに収集されます。分数は、その後の下流用途(ペプチド定量、TLCおよび低分子のバイオアッセイのためのSDS-PAGE)に使用することができます。
3. C.アルビカンスからのタンパク質の分離と精製
- C.アルビカンの単一コロニーを、一晩振る(200rpm)で30°Cで酵母ペプトンデキストロース(YPD)ブロス16で成長させる。
- 遠心分離(5分間10,000 x g)で酵母細胞を採取する。
- C.アルビカンス酵母細胞を炭酸アンモニウム(1.89g/L)にサスペンドし、β-メルカプトエタノール(β-ME)(培養量の1/10分)を含有する緩衝液を5°C15で1時間ローラチューブで15回転させた。
- 遠心分離(5分間10,000 x g)で酵母細胞を取り除き、0.45 μmのフィルターでタンパク質抽出物を濾過します。
注:C.アルビカンスサイトゾル、膜または細胞壁からのタンパク質サンプルを調製し、IEF分画に使用することができます。同様に、細菌または他の生物学的試料からのタンパク質(動物組織抽出物)は、任意の塩を適切な方法(例えば、透析または脱塩カラムを使用して)除去した後に使用することができる。 - 4°Cで15時間水に対する透析チューブ(3,500 MWCO)中のタンパク質抽出物を透析します。ガンマグロブリンを標準17として使用して、ブラッドフォード色素結合法によってタンパク質濃度を推定する。
- 分画には、1%(v/v)アンプホリュート(pH 5-8)を含む60mLの水に500mgの総タンパク質を使用してください。
注:広域のアンプリアン(pH 3-10)は、C.アルビカンスの特定の非グルカン付き細胞壁タンパク質を十分に富まないので、狭い範囲(pH 5-8)アンプリルテを使用してください。サンプルタンパク質濃度が2mg/mLを超える場合、最大2%のアンプホリ酸塩濃度を使用できます。これにより、焦点合わせ時のタンパク質凝集を最小限に抑えることができます。常にサンプル、アンプリレット、水を氷の上で予冷してください。 - ステップ 1.1 ~ 1.7 を繰り返して IEF ユニットを準備し、ステップ 3.6 のタンパク質溶液を使用して IEF 細胞にロードします。
- 定常15Wで4時間の焦点を合わせた後、上記のようにタンパク質画分(1〜20)を収穫し(ステップ2.9〜2.11)、タンパク質サンプル18を還元・沸騰させた後、12.5%SDS-PAGEで分析した。
- SDS-PAGEゲルをクマシーブルー染料で染色して分解したタンパク質を染色する(0.01%)ロッカーの室温で2-3時間のための解決。ゲルをデステインし、ゲルイメージャーを用いてゲル画像を記録する。
注:クマシーブルー染料(0.01%)40%メタノールと10%酢酸を含むデステイン溶液中のクマシーブルー粉末の0.01 gを混合することにより調製することができる。
4. 植物抽出物から精製された小分子の生物活性
- ステップ3.1のように酵母細胞でC.アルビカンを成長させる。
- 細胞懸濁液を調製するために、C.アルビカンス酵母細胞(1/1000希釈)の一晩培養を50mMグルコースを添加した新鮮なRPMI細胞培地に希釈した。
注:C.アルビカンは、酵母の成長から催眠誘導条件下でのヒファエ(RPMI 37°C)に変換します。小分子のジムネミック酸は、ハイファ誘導条件16の下で酵母細胞のハイファへの変換を阻害することが示されている。液体相-IEF分離G.シルヴェストル抽出物にこれらの生理活性分子が含まれているかどうかを判断することを目指しました。 - 調製したセル懸濁液から、96ウェルプレートの各ウェルに90 μLを加えます。
- 各画分(液体相IEFから得られたG.シルヴェストル抽出物の1〜20採取された分画、図4)から、上記の細胞懸濁液の90 μLでウェルに10μLを加える(ステップ4.2)。三重でアッセイを行います。
- アンプホリ酸塩を含む水を10μL加える(1%)90 μLのC.アルビカン酵母細胞懸濁液を負のコントロールとして別々のウェルにします。
注:アンプリケートは生物活性の可能性を秘めているため、バイオアッセイ19を実行しながらアンホリ酸塩制御を含める必要があります。 - 96ウェルプレートを37°Cで12時間インキュベートし、C.アルビカンス酵母からヒュファへの変換を顕微鏡16で阻害観察する。また、酵母からヒュファへの変換の阻害の割合を決定する。
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Representative Results
ジムネマシルヴェストル植物抽出物からの小分子とペプチドの分離と精製
前処理液相IEF法を用いて、ヒト病原性真菌C.アルビカンスから薬用植物抽出物および細胞表面タンパク質を分画した。これらの分数プロトコルの概略を図 1に示します。
液体相IEFから得られたG.シルヴェストル抽出物の20画分から、暗色の分子(テルペノイドサポニン)がアノード端(pH 2-3)で移動して濃縮され、カソード端(pH 8-9)で明黄透明分が観察された(図2)。各分画(1-20)からのアリコート(20 μL)は、サンプルを減らして沸騰させた後、15%SDS-PAGEで分解した。クマシーブルー染色ゲルは、画分16〜19で富化された約5kDaの拡散ポリペプチドバンドを示す(図3)。G.シルヴェストル植物には、予測分子量4,209Da20の35アミノ酸グルマリン塩基性ポリペプチドが含まれていることが報告されている。細菌、植物および動物は、ペプチドを含みます。それらの多くは円形(結び目)であり、殺虫性および抗菌特性21、22,22などの生物活性の広い範囲で安定している。
分離されたジクミン酸の生物活性
G.シルヴェストル植物はまた、主要な成分としてジンネミック酸(テルペノイドサポニン)を含む16,,23,,24.予想通り、画分1および次の数画のこれらの小分子は、非タンパク質性であるため、SDS-PAGEおよびクマシー染色(図3)では検出されなかった。しかし、これらの小分子はTLCによって分離され、UV光下で検出することができる(図4A、レーンF1)。フラクション10は、これらの小分子の検出可能な量をTLCに含まず、有機小分子のほとんどが画分1〜3で濃縮されたことを示唆した。ジムネ酸(G)分子は、C.アルビカン酵母からヒphaへの移行を阻害することが示された16,25。,25我々は、C.アルビカン酵母からヒphaへの変換および催眠成長に対するそれらの阻害活性について、本研究で収集された全20個の分画をアッセイした。結果は図 4B,4Cに示されています。最も高い活性は、いくつかのスポットが見ることができるTLCの結果と一致する分数1で観察される。異性体の異性体が存在し、すべて同様の生物学的活動を有する10.これらの異性体は、分画1〜3で分離し、C.アルビカンスヒphphal増殖の阻害を示す(図4A,4C、画分1)。1から10に行くにつれて、催眠阻害の程度は徐々に減少した。画分10以上ではほとんどまたは全く活性が得られなかった。
病原性真菌、C.アルビカンからの細胞表面タンパク質の分離
C.アルビカンス細胞表面タンパク質の液相IEF分画の結果を図5に示す。これらの細胞表面タンパク質は、C.アルビカンの接着および病因において重要な役割を果たす。異なる画分で複数の富化タンパク質(矢印)が観察された。これにより、カンディダ感染ヒト血清による免疫学的反応の同定および/または質量分析による同定が可能になる。同様に、他の細胞分画(例えば、細胞質および細胞壁)からのタンパク質は、このIEF法を用いて分画することができる。液相IEFベースの精製により、質量分析と組み合わせた複雑な生物学的サンプルから低存在量のタンパク質を同定することができます。
図1:実験ワークフローを示すフローチャート。段階的液体相IEF分画手順およびその後の下流アッセイが描かれている。サンプルには、ジムネマシルヴェストル葉エキス(サンプル1)とカンジダアルビカンス非グルカン結合酵母タンパク質(サンプル2)が含まれる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:G.シルヴェストル植物抽出物の液相IEF装置のセットアップおよび分画。(A)回中、(B)画分採取中、(C)分数採取後、及び(D)液相IEF装置部品、1)イオン交換膜、2)集光室および膜コア、3)電極アセンブリ(負)、4)電極アセンブリ(正)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:IEF焦点植物抽出画分のSDS-PAGE分離図。L-ラダー、PC-陽性対照(ペプチド)、0-入力サンプル、1〜20分離された画分。SDS-PAGE(15%リゾルベーションゲル)を、1〜20分から分解されたペプチド(〜5kDa)を可視化するために、クマシーブルー色素によって染色した。分数1~3は小分子(分画1は濃い色が濃い色で富化した化合物を示す)を含み、クーマシーブルー染料では染色/検出できない。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: TLCによる小分子分画の分析とC.アルビカンスに対する生物活性の測定(A)分数#1と#10からの小分子のTLC分析を示す。活性シリカゲルプレートを使用して、サンプルの〜5μLをスポットし、トルエンで実行しました:クロロホルム:メタノール溶媒(5:8:3比)溶媒フロントがマージンに達するまで。TLC分離化合物は、蛍光UV光(310nm)下で検出された。(B) 異なる分画によるC.アルビカン酵母からヒュファへの変換の阻害率を示す。(C)は、ハイファ誘導条件下でのC.アルビカンスの細胞形態を示す。#1の分数は最大(98%)を示す酵母からヒュファへの変換の阻害。他の画分およびコントロールは、37°Cでの12時間のインキュベーション後のC.アルビカンス催眠成長の阻害を示さない。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:C.アルビカンス細胞表面タンパク質(非グルカン付き)のSDS-PAGE分析。L-ラダーは、0-入力サンプル、狭い範囲(pH5−8)を使用して標準的な液相IEFセルにIEF後に集められた1〜18分の分数を、アンホリ酸塩である。画像はSDS-PAGE(12.5%)を示しています分解したタンパク質は、クマシーブルー染料で染色した後に行った。いくつかのタンパク質は、特定の分数(矢印)で濃縮された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
天然物源(植物など)からの小分子は、化学構造において非常に多様な複雑な二次代謝産物を含む。彼らは植物の防衛メカニズムに関与していると考えられています。また、ポリペプチドは植物組織22にも存在する。これらの天然物の小分子は、創薬と開発のための試験分子の豊富な供給源です。しかし、その分離と精製に必要な困難で退屈な方法は、治療用途への使用を制限します。このレポートで使用される液相IEFアプローチは、生物活動を損なうことなく、これらの小分子とポリペプチドを分離する能力を強調しています。
このIEFベースの方法は、複雑な混合物からの精製タンパク質の濃度、その焦点の間および後の天然の立体構造の維持、およびクロスコンタミネーションのない個々の精製された分画としてのサンプルの収集を含む生物学的分子を分離する上で、いくつかの利点を提供する。必要に応じて、サンプルを狭いpH範囲で再集め直してタンパク質アイソフォームを精製することができます。小型IEFの焦点セル(約15mL)が利用可能であるため、少量のサンプルにも使用できます。この報告から得られた新しい発見は、有機小分子とペプチドが複雑な植物抽出物から分離できることである。小分子がIEFによって天然物抽出物から分離できることに同意することは困難であるが、それは両和物であるそれらの化合物のためにもっともらしい。G.シルヴェストル抽出物中のグルマリンペプチドから分離されたジムネミック酸は、カルボン酸基を含んでいるか、少なくとも使用されるアンホリ酸塩の存在下で振る舞うので、両液性であるように見える。グリコシドは、ジムネミック酸に類似した生理活性天然分子であるため、IEF法を用い、それらを複雑な天然源から分離することができる。同様に、天然物由来のペプチドも、この液相IEFアプローチを用いて単離され得る。
このアプローチの制限のいくつかは、少なくとも水溶性で弱いアンフォトリックでなければならないので、すべての小分子がIEF法によって分別できるわけではないということです。ここで用いた抽出物は、乾燥植物材料の50%メタノール抽出によって調製したが、水溶性である。溶媒溶性およびアンホテリ化合物に対するIEF法の使用は、有機溶媒の一部が液相IEF装置成分と相溶性でないものとして見られるままである。低イオン強度溶液中の等電点(pI)でタンパク質が沈殿する傾向はよく知られている。しかし、回転IEFシステムでは、焦点を合わせたタンパク質がpIポイントで循環したままであるため、タンパク質の沈殿が減少します。
このIEF分離において高濃度のタンパク質を使用すると、沈殿が生じることがある。タンパク質の沈殿を最小限に抑え、タンパク質の焦点を合わせるのを改善するために、尿素は、CHAPS、デジトニンおよび低濃度の洗剤(0.1-1%)などの非イオン性洗剤を3-5 Mまで使用することができる。IEF中のタンパク質凝集を減らすためにも使用できます。しかし、尿素や洗剤は、タンパク質の活性を分析する前に除去する必要があり、場合によっては、これらの薬剤がタンパク質機能に影響を与える可能性があります。液相IEFの実行中に考慮すべきいくつかの重要なステップは、気泡なしでIEFの焦点セルをロードし、それらが損傷した場合にイオン交換膜を交換し、一定の繰り返し使用の後にベントボタンを交換する。
結論として、液相IEF法を用いて、G.シルヴェストル葉抽出物からの生理活性ジムネミック酸およびグルマリンポリペプチドの分離を示した。また、液相IEFは、病原性微生物の複合粗抽出物から選択的タンパク質を濃縮するのに有用であり得る。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益を宣言したいと考えています。
Acknowledgments
私たちは、生物学部門とジョンソンがん研究センターのBRIEFおよびIRA賞の資金源に感謝しています。また、RVに対するK-INBREポスドク賞に感謝します。この研究は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所の機関開発賞(IDeA)によって、助成金番号P20 GM103418の下で部分的に支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立一般医学研究所または国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。私たちは、彼らの役に立つコメントのために匿名のレビュー担当者に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
References
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