Vi præsenterer en model af iskæmisk hjertesygdom ved hjælp af kardiomyocytter stammer fra humane inducerede pluripotente stamceller, sammen med en metode til kvantitativ vurdering af vævsskader forårsaget af iskæmi. Denne model kan give en nyttig platform for narkotika screening og yderligere forskning i iskæmisk hjertesygdom.
Iskæmisk hjertesygdom er en væsentlig dødsårsag på verdensplan. Det har derfor været genstand for en enorm mængde forskning, ofte med små dyremodeller som gnavere. Men fysiologien i det menneskelige hjerte adskiller sig væsentligt fra gnaverhjertets, hvilket understreger behovet for klinisk relevante modeller til undersøgelse af hjertesygdomme. Her præsenterer vi en protokol til model iskæmisk hjertesygdom ved hjælp af kardiomyocytter differentieret fra humane inducerede pluripotente stamceller (hiPS-CMs) og til at kvantificere skader og funktionelle svækkelse af de iskæmiske kardiomyocytter. Eksponering for 2% ilt uden glukose og serum øger procentdelen af tilskadekomne celler, hvilket indikeres ved farvning af kernen med propidium iodid, og nedsætter cellulære levedygtighed. Disse betingelser mindsker også kontraktiliteten af hiPS-CMs som bekræftet ved forskydningsvektorfeltanalyse af mikroskopiske videobilleder. Denne protokol kan desuden give en bekvem metode til personlig lægemiddelscreening ved at lette brugen af hiPS-celler fra individuelle patienter. Derfor kan denne model af iskæmisk hjertesygdom, baseret på iPS-CMs af menneskelig oprindelse, give en nyttig platform for lægemiddelscreening og yderligere forskning i iskæmisk hjertesygdom.
Iskæmisk hjertesygdom (IHD) er anerkendt verden over som den hyppigste dødsårsag, og det blev anslået til at være ansvarlig for mere end ni millioner dødsfald i 20161. Forekomsten af hjerte-kar-sygdomme fortsætter med at stige, og globaliseringen synes at have bidraget til forekomsten af hjertesygdomme risikofaktorer i udviklingslandene. Derfor bliver undersøgelsen af IHD mere og mere presserende2.
Eksperimentelle modeller af hjerte-kar-sygdom er afgørende for at studere mekanismerne i sygdom, nøjagtigheden af diagnosen, og udvikling af nye behandlingsformer. Flere forsøgsmodeller er blevet foreslået af mange laboratorier. Det er yderst vigtigt at vælge en model med betydelige fordele; gennemførlighed, repeterbarhed og lighed med sygdomme hos mennesker er nøglefaktorer i udvælgelsen af modeller for hjerte-kar-sygdomme3. Humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) med specifikke kardiomyopati-associerede mutationer er et lovende alternativ til dyremodeller4. Selv om mange strategier er blevet beskrevet for at fremkalde kardiomyocyttervedhjælp af iPSCs5,6,,7,8,9, her giver vi en enkel metode til at producere en IHD-model ved hjælp af cardiomyocytes differentieret fra hiPSCs, hvor møjsommelig udvælgelse af cardiomyocyte ved hjælp af markører ikke anvendes. I denne metode udvælges kardiomyocytter funktionelt ved at analysere spontan sammentrækning.
Induktion af kardiomyocytter ved hjælp af hiPSCs undgår dyr ofre og teknisk vanskelig kirurgi. Etablering af dyremodeller af IHD kræver udfordrende kirurgiske teknikker10. Perfekt simulere de forskellige patofysiologiske aspekter af menneskelige hjertesygdomme såsom puls og handling potentialer fra fysiologi af gnavere er næsten umuligt. Kombineret med moral og etik ved at bruge dyremodeller er det bydende nødvendigt at udvikle andre nye forsøgsmodeller end dyremodeller. Kardiomyocytter differentieret fra menneskelige iPS-celler bedre efterligne den fysiologiske tilstand af det menneskelige hjerte. I denne protokol opretter vi en model af IHD ved hjælp af kardiomyocytter, der er afledt af hiPS-celler (hiPS-CMs). I vores model, afsavn af ilt og glukose fører til et fald i kontraktile kraft og levedygtighed hiPS-CMs. Vores metode giver en ny tilgang til model IHD og demonstrerer en ny platform for studiet af denne sygdom.
Forskere bruger ofte laboratoriemodeller for små dyr til at udføre IHD-eksperimenter. Her udviklede vi en cellekulturmodel af menneskelig IHD til at udføre sådanne eksperimenter.
Det største problem en bruger af denne protokol kan stå over for, er lav sats af differentierede kardiomyocytter. Der bør tages flere skridt med stor omhu for at forbedre hastigheden af vellykket differentiering: (a) være skånsom, når de afmonteres, fordi cellerne let løsnes efter tilsætning af celleresociationsenzymer reagens, b) tilføjelse af Y-27632 øger overlevelsesraten for iPS-celler ved afledning, og (c) timingen af mediumændringer i begyndelsen af differentiering bør være præcis 48 h fra hinanden for at sikre kontrolleret udtryk for involverede gener i differentiering.
Med hensyn til de ekstracellulære matrixproteiner, der anvendes til belægning af overfladen af kulturpladen, kan andre materialer end laminin, som vi brugte i denne protokol, anvendes. For eksempel, Matrigel14,15, og gelatine16,17 bruges til feeder-fri vedligeholdelse kultur hiPSCs. Ifølge Haraguchi et al., hiPSCs seedet på Matrigel blev med succes differentieret i hjertecelleark18.
Der er en række tidligere undersøgelser vedrørende kulturmodeller for sygdomsmodeller ved hjælp af kardiomyocytter afledt af hiPSCs. Med hensyn til modellering af iskæmi-reperfusion skade, manipulationer af det cellulære miljø, såsom hyperkaliæmi, acidose, og laktat akkumulering, er blevet indført19. Andre metoder omfatter celle pelletering for at hindre iltdiffusion20 og metabolisk hæmning ved hjælp afcyanid 21. I den nuværende protokol, celle skade blev opnået ved relativt enkel metode, nemlig 24 h afsavn af ilt og næringsstoffer. Man bør dog være opmærksom på at overveje nøjagtige patofysiologiske processer af den iskæmiske hjertesygdom, da der faktisk er forskelle mellem sygdommen in vivo og sygdomsmodellen i den nuværende protokol, såsom tilstedeværelsen eller fraværet af tredimensionelle cellulære miljø og blod.
Med hensyn til det teknologiske aspekt af evalueringen af cardiomyocyte funktion, Toepfer et al. rapporterede en MatLab-baseret algoritme til at bestemme sarcomere sammentrækning og afslapning i hiPS-CMs22. Smith et al. rapporterede en avanceret metode til høj-throughput elektrofysiologisk analyse af excitable celler stammer fra hiPS-CMs, ved hjælp af sofistikerede nanotopografisk mønstrede multielektrode arrays23,24. Fordelen ved vores protokol er, at det kun kræver konventionel software og forbrugsstoffer, såsom imageJ software og 96-brønd plader.
Med hensyn til iltniveauet i hjertet, ilttrykket i vener, der når hjertet menes at være 40 mmHg25. Ifølge McDougal et al., den ekstracellulære ilttryk under hypoxi skønnes at være <12.8 mmHg26. Ved anvendelse af metoden til runder et al.27beregnes ilttrykket i dyrkningsmediet (saltholdighed: 35‰) under hypoxisk tilstand (2% ilt) ved 37 °C behandlet med den aktuelle protokol til 14,9 mmHg, hvilket er højere end ovenstående skøn. Interessant, Al-Ani et al. rapporterede, at der er en gradient af ilttryk i kulturmediet, og ilttrykket påvirkes af celletype, såning tæthed, og medium volumen28. Typisk iltkoncentrationen i bunden af den kulturplade, hvor cellerne bor, er den laveste. Derfor vil effekten af dybde i kulturmediet yderligere reducere det effektive ilttryk nær hiPS-CMs. For at fremkalde tilstrækkelig skade på hiPS-CMs ved hjælp af hypoxisk tilstand skal der lægges særlig vægt på dybden af medium og cellernes massetæthed.
Vores hiPS-CM model, som er meget tæt på de fysiologiske forhold af menneskelige hjerte myocytter, med fordel efterligner menneskelige IHD. Dyremodelbaserede tilgange omfatter etiske, tekniske og akademiske spørgsmål. Især in vivo modeller kræver en avanceret teknik af mikrokirurgi for at opnå reproducerbare data: f.eks okklusion af den forreste faldende gren af venstre koronararterie hos gnavere3. Den hiPS-CM model, der er beskrevet heri overvinder disse kritiske barrierer og giver en nyttig, relevant og repeterbar platform for hjerte-kar-sygdom.
Der skal dog bemærkes visse begrænsninger. En indlysende forskel mellem iPS-induceret kardiomyocytter og normale kardiomyocytter er fraværet af T-tubuli29,og vi omfattede ikke humoral faktorer såsom vævsskader induceret af leukocytter og aktivering af et komplementsystem i vores undersøgelse. Desuden bør antallet af differentierede kardiomyocytter i denne model (20,7 ± 9,6 %, supplerende figur 3)forbedres. Den nylige publikation af Halloin et al. beskriver en skalerbar, kemisk defineret metode til at fremkalde hiPS-CM renhed på > 95% af kemiske WNT pathway modulatorer uden krav om nogen udvælgelse afmarkører 30. Ikke desto mindre er vores model for humant IHD relativt enkelt og klinisk anvendeligt (f.eks. lægemiddelscreening ved hjælp af patientbaserede iPS-celler). Vores model er også en unik platform til yderligere at belyse mekanismer, der ligger til grund for IHD’er.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af JSPS KAKENHI, Fonden til Fremme af Fælles International Forskning (Fremme af Fælles International Forskning), 17KK0168. Forfatterne taknemmeligt anerkende Central Research Laboratory, Okayama University Medical School for bistand fra FACS.
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |