We presenteren een model van ischemische hartziekten met behulp van cardiomyocyten afkomstig van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, samen met een methode voor kwantitatieve evaluatie van weefselschade veroorzaakt door ischemie. Dit model kan een nuttig platform bieden voor screening van geneesmiddelen en verder onderzoek naar ischemische hartziekten.
Ischemische hartziekte is een belangrijke doodsoorzaak wereldwijd. Het is daarom het onderwerp geweest van een enorme hoeveelheid onderzoek, vaak met kleine diermodellen zoals knaagdieren. Echter, de fysiologie van het menselijk hart verschilt aanzienlijk van die van het knaagdier hart, onderstrepen de noodzaak van klinisch relevante modellen om hart-en vaatziekten te bestuderen. Hier presenteren we een protocol om ischemische hartziekten te modelleren met behulp van cardiomyocyten die zich onderscheiden van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPS-CMs) en om de schade en functionele aantasting van de ischemische cardiomyocyten te kwantificeren. Blootstelling aan 2% zuurstof zonder glucose en serum verhoogt het percentage gewonde cellen, wat wordt aangegeven door kleuring van de kern met propidiumjodide, en vermindert de cellulaire levensvatbaarheid. Deze voorwaarden verminderen ook de contractiliteit van hiPS-CMs zoals bevestigd door verplaatsingsvectorveldanalyse van microscopische videobeelden. Dit protocol kan bovendien een handige methode bieden voor gepersonaliseerde screening van geneesmiddelen door het gebruik van hiPS-cellen van individuele patiënten te vergemakkelijken. Daarom kan dit model van ischemische hartziekten, gebaseerd op iPS-CMs van menselijke oorsprong, een nuttig platform bieden voor screening van geneesmiddelen en verder onderzoek naar ischemische hartziekten.
Ischemische hartziekten (IHD) wordt wereldwijd erkend als de belangrijkste doodsoorzaak, en het werd geschat op verantwoordelijk zijn voor meer dan negen miljoen dodelijke slachtoffers in 20161. De prevalentie van hart-en vaatziekten blijft stijgen, en de globalisering lijkt te hebben bijgedragen aan de prevalentie van hart-en vaatziekten risicofactoren in ontwikkelingslanden. Daarom wordt de studie van IHD steeds urgenter2.
Experimentele modellen van hart-en vaatziekten zijn van cruciaal belang voor het bestuderen van de mechanismen van de ziekte, de nauwkeurigheid van de diagnose, en de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Verschillende experimentele modellen zijn voorgesteld door vele laboratoria. Het is van het grootste belang om een model te kiezen met aanzienlijke voordelen; haalbaarheid, herhaalbaarheid en gelijkenis met menselijke ziekte zijn belangrijke factoren bij de selectie van modellen voor hart- en vaatziekten3. Door de mens veroorzaakte pluripotente stamcellen (hiPSC’s) met specifieke cardiomyopathie-geassocieerde mutaties zijn een veelbelovend alternatief voor diermodellen4. Hoewel veel strategieën zijn beschreven voor het induceren van cardiomyocyten met behulp van iPSCs5,6,7,8,9, hier bieden we een eenvoudige methode om een IHD-model te produceren met behulp van cardiomyocyten onderscheiden van hiPSC’s, waarin moeizame selectie van cardiomyocyte met behulp van markers wordt niet toegepast. In deze methode worden cardiomyocyten functioneel geselecteerd door spontane samentrekking te analyseren.
Inductie van cardiomyocyten met behulp van hiPSC’s voorkomt het opofferen van dieren en technisch moeilijke chirurgie. Het opzetten van diermodellen van IHD vereist uitdagende chirurgische technieken10. Het perfect simuleren van de verschillende pathofysiologische aspecten van menselijke hartziekten, zoals hartslag en actiemogelijkheden uit de fysiologie van knaagdieren, is bijna onmogelijk. In combinatie met de moraal en ethiek van het gebruik van diermodellen, is de ontwikkeling van andere experimentele experimentele modellen dan diermodellen noodzakelijk. Cardiomyocyten onderscheiden van menselijke iPS cellen beter na te bootsen de fysiologische toestand van het menselijk hart. In dit protocol stellen we een model van IHD op met behulp van cardiomyocyten afgeleid van hiPS-cellen (hiPS-CMs). In ons model leidt de ontbering van zuurstof en glucose tot een afname van de contractiele kracht en levensvatbaarheid van hiPS-CMs. Onze methode biedt een nieuwe benadering van model IHD en toont een nieuw platform voor de studie van deze ziekte.
Onderzoekers gebruiken vaak laboratoriummodellen voor kleine dieren om IHD-experimenten uit te voeren. Hier ontwikkelden we een celcultuurmodel van menselijke IHD om dergelijke experimenten uit te voeren.
Het belangrijkste probleem waarmee een gebruiker van dit protocol kan worden geconfronteerd is een laag percentage gedifferentieerde cardiomyocyten. Verschillende stappen moeten met grote zorg worden genomen om de snelheid van succesvolle differentiatie te verbeteren: a) zacht zijn bij het pipetten omdat de cellen gemakkelijk kunnen loskomen na toevoeging van het reagens van enzymen van de celdissociatie, b) het toevoegen van Y-27632 verhoogt de overlevingskans van iPS-cellen bij het losmaken, en (c) de timing van middelgrote veranderingen aan het begin van differentiatie moet precies 48 uur uit elkaar liggen om een gecontroleerde expressie van genen die betrokken zijn bij differentiatie te waarborgen.
Met betrekking tot de extracellulaire matrixeiwitten die worden gebruikt voor het coaten van het oppervlak van de kweekplaat, kunnen andere materialen dan laminine die we in dit protocol gebruiken, worden gebruikt. Zo worden Matrigel14,15en gelatine16,17 gebruikt voor de feedervrije onderhoudscultuur van hiPSC’s. Volgens Haraguchi et al., hiPSC’s gezaaid op Matrigel werden met succes gedifferentieerd in cardiale cel blad18.
Er zijn een aantal voorgaande studies met betrekking tot cultuurmodellen voor ziektemodellering met behulp van cardiomyocyten afgeleid van hiPSC’s. Met betrekking tot het modelleren van ischemie-reperfusieletsel, zijn manipulaties van de cellulaire omgeving, zoals hyperkalemia, acidose en lactaataccumulatie, geïntroduceerd19. Andere methoden zijn celpellets om zuurstofverspreiding20 en metabole remming met cyanide21te belemmeren. In het huidige protocol werd celletsel bereikt met een relatief eenvoudige methode, namelijk 24 uur ontbering van zuurstof en voedingsstoffen. Er moet echter voor worden gezorgd dat nauwkeurige pathofysiologische processen van de ischemische hartziekte worden overwogen, omdat er inderdaad verschillen zijn tussen de ziekte in vivo en het ziektemodel van het huidige protocol, zoals de aanwezigheid of afwezigheid van driedimensionale cellulaire omgeving en bloed.
Met betrekking tot het technologische aspect van de evaluatie van de cardiomyocyte functie, Toepfer et al. rapporteerde een MatLab-gebaseerd algoritme om sarcomere contractie en ontspanning in hiPS-CMs22te bepalen . Smith et al. rapporteerden een geavanceerde methode van elektrofysiologische analyse met hoge doorvoer van prikkelbare cellen afkomstig van hiPS-CMs, met behulp van geavanceerde nanotopografisch patroon multi-elektrodrode arrays23,24. Het voordeel van ons protocol is dat het alleen conventionele software en verbruiksartikelen vereist, zoals imageJ-software en 96-well platen.
Met betrekking tot het zuurstofgehalte in het hart, wordt de zuurstofdruk in aderen die het hart bereiken beschouwd als 40 mmHg25. Volgens McDougal et al., de extracellulaire zuurstofdruk onder hypoxie wordt geschat op <12,8 mmHg26. Door de methode van Rondes et al.27toe te passen, wordt de zuurstofdruk in het kweekmedium (zoutgehalte: 35‰) onder de hypoxische toestand (2% zuurstof) bij 37 °C die met het huidige protocol wordt behandeld berekend berekend op 14,9 mmHg, wat hoger is dan de hierboven genoemde schatting. Interessant is dat Al-Ani et al. gemeld dat er een gradiënt van zuurstofdruk in de cultuur medium, en de zuurstofdruk wordt beïnvloed door celtype, zaaien dichtheid, en medium volume28. Typisch, de zuurstofconcentratie aan de onderkant van de kweekplaat waar cellen wonen is de laagste. Daarom zou het effect van diepte in het kweekmedium de effectieve zuurstofdruk in de buurt van hiPS-CMs verder verminderen. Om met hypoxische toestand voldoende schade aan hiPS-CMs te veroorzaken, moet zorgvuldig worden aandacht besteed aan de diepte van het medium en de dichtheid van cellen.
Ons hiPS-CM model, dat zeer dicht bij de fysiologische omstandigheden van menselijke cardiale myocyten ligt, bootst op voordelige wijze menselijke IHD na. Op diermodellen gebaseerde benaderingen omvatten ethische, technische en academische kwesties. In het bijzonder, in vivo modellen vereisen een geavanceerde techniek van microchirurgie om reproduceerbare gegevens te bereiken: bijvoorbeeld, occlusie van de voorste aflopende tak van de linker kransslagader bij knaagdieren3. Het hiPS-CM-model dat hierin wordt beschreven, overwint deze kritieke barrières en biedt een nuttig, relevant en herhaalbaar platform voor hart- en vaatziekten.
Er moeten echter enkele beperkingen worden opgemerkt. Een duidelijk verschil tussen iPS-geïnduceerde cardiomyocyten en normale cardiomyocyten is de afwezigheid van T-tubuli29, en we hebben geen humorale factoren opgenomen, zoals weefselschade veroorzaakt door leukocyten en activering van een complementsysteem in onze studie. Bovendien moet het percentage gedifferentieerde cardiomyocyten in dit model (20,7 ± 9,6%, aanvullend figuur 3)worden verbeterd. De recente publicatie van Halloin et al. beschrijft een schaalbare, chemisch gedefinieerde methode om hiPS-CM zuiverheid van >95% door chemische WNT-routemodulatoren te induceren zonder enige selectie door markers30. Niettemin is ons model van menselijke IHD relatief eenvoudig en klinisch toepasbaar (bijvoorbeeld medicijnscreening met behulp van door patiënten afgeleide iPS-cellen). Ons model is ook een uniek platform om mechanismen die ten grondslag liggen aan IHD’s verder op te helderen.
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door JSPS KAKENHI, Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research), 17KK0168. De auteurs dankbaar erkennen Central Research Laboratory, Okayama University Medical School voor de hulp van FACS.
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |