Presentiamo un modello di cardiopatia ischemica utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo, insieme a un metodo per la valutazione quantitativa dei danni ai tessuti causati dall’ischemia. Questo modello può fornire una piattaforma utile per lo screening farmacologico e ulteriori ricerche sulle cardiopatie ischemiche.
La cardiopatia ischemica è una causa significativa di morte in tutto il mondo. È stato quindi oggetto di un’enorme quantità di ricerca, spesso con modelli di piccoli animali come i roditori. Tuttavia, la fisiologia del cuore umano differisce significativamente da quella del cuore roditore, sottolineando la necessità di modelli clinicamente rilevanti per studiare le malattie cardiache. Qui presentiamo un protocollo per modellare le cardiopatie ischemiche utilizzando cardiomiociti differenziati dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPS-CM) e per quantificare il danno e la compromissione funzionale dei cardiomiociti ischemici. L’esposizione al 2% di ossigeno senza glucosio e siero aumenta la percentuale di cellule ferite, che è indicata dalla colorazione del nucleo con iodide propidio, e diminuisce la vitalità cellulare. Queste condizioni riducono anche la contrattilità dei hiPS-CM, come confermato dall’analisi del campo vettoriale di spostamento di immagini video microscopiche. Questo protocollo può inoltre fornire un metodo conveniente per lo screening farmacologico personalizzato facilitando l’uso di cellule hiPS da singoli pazienti. Pertanto, questo modello di cardiopatia ischemica, basato su iPS-CM di origine umana, può fornire una piattaforma utile per lo screening farmacologico e ulteriori ricerche sulle cardiopatie ischemiche.
La cardiopatia ischemica (IHD) è riconosciuta in tutto il mondo come la principale causa di morte, ed è stato stimato essere responsabile di più di nove milioni di morti nel 20161. La prevalenza delle malattie cardiovascolari continua ad aumentare e la globalizzazione sembra aver contribuito alla prevalenza dei fattori di rischio per le malattie cardiache nei paesi in via di sviluppo. Pertanto, lo studio di IHD sta diventando sempre più urgente2.
I modelli sperimentali di malattia cardiovascolare sono fondamentali per studiare i meccanismi della malattia, l’accuratezza della diagnosi e lo sviluppo di nuove terapie. Molti laboratori hanno proposto diversi modelli sperimentali. È della massima importanza scegliere un modello con vantaggi significativi; la fattibilità, la ripetibilità e la somiglianza con la malattia umana sono fattori chiave nella selezione dei modelli di malattia cardiovascolare3. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSC) che trasportano specifiche mutazioni associate alla cardiomiopatia sono un’alternativa promettente ai modelli animali4. Anche se molte strategie sono state descritte per indurre cardiomiociti utilizzando iPSC5,6,7,8,9, qui forniamo un metodo semplice per produrre un modello IHD utilizzando cardiomiociti differenziati da hiPSC, in cui non viene applicata la laboriosa selezione di cardiomiociti utilizzando marcatori. In questo metodo, i cardiomiociti vengono selezionati funzionalmente analizzando la contrazione spontanea.
L’induzione di cardiomiociti con hiPSC evita il sacrificio animale e la chirurgia tecnicamente difficile. Stabilire modelli animali di IHD richiede tecniche chirurgicheimpegnative 10. Simulare perfettamente i vari aspetti patofsiologici delle malattie cardiache umane come la frequenza cardiaca e i potenziali di azione dalla fisiologia dei roditori è quasi impossibile. Accoppiato con la moralità e l’etica dell’utilizzo di modelli animali, lo sviluppo di nuovi modelli sperimentali diversi dai modelli animali è imperativo. I cardiomiociti differenziati dalle cellule iPS umane imitano meglio lo stato fisiologico del cuore umano. In questo protocollo, stabiliamo un modello di IHD utilizzando cardiomiociti derivati da cellule hiPS (hiPS-CM). Nel nostro modello, la privazione di ossigeno e glucosio porta ad una diminuzione della forza contrattile e della vitalità dei hiPS-CM. Il nostro metodo fornisce un nuovo approccio al modello IHD e dimostra una nuova piattaforma per lo studio di questa malattia.
I ricercatori spesso utilizzano modelli di laboratorio di piccoli animali per condurre esperimenti IHD. Qui, abbiamo sviluppato un modello di coltura cellulare di IHD umano per condurre tali esperimenti.
Il problema principale che un utente di questo protocollo può affrontare è il basso tasso di cardiomiociti differenziati. Dovrebbero essere adottate diverse misure con grande attenzione per migliorare il tasso di differenziazione di successo: (a) essere delicato quando pipettare perché le cellule si staccano facilmente dopo l’aggiunta del reagente enzimatico di dissociazione cellulare, (b) l’aggiunta di Y-27632 aumenta il tasso di sopravvivenza delle cellule iPS durante il distacco, e (c) la tempistica dei cambiamenti medi all’inizio della differenziazione dovrebbe essere precisamente 48 h di distanza per garantire l’espressione controllata dei geni coinvolti nella differenziazione.
Per quanto riguarda le proteine a matrice extracellulare utilizzate per rivestire la superficie della piastra di coltura, possono essere utilizzati materiali diversi dalla laminina che abbiamo usato in questo protocollo. Ad esempio, Matrigel14,15e gelatina16,17 vengono utilizzati per la coltura di manutenzione senza alimentatori di hiPSC. Secondo Haraguchi et al., hiPSCs semi su Matrigel sono stati differenziati con successo in foglio di cellule cardiache18.
Ci sono una serie di studi precedenti riguardanti i modelli di coltura per la modellazione della malattia utilizzando cardiomiociti derivati da hiPSC. Per quanto riguarda la modellazione della lesione ischemia-reperfusione, sono state introdotte manipolazioni dell’ambiente cellulare, come l’ipercalemia, l’acidosi e l’accumulo di lattati,19. Altri metodi includono la pelleting cellulare per ostacolare la diffusionedell’ossigeno 20 e l’inibizione metabolica utilizzando cianuro21. Nell’attuale protocollo, la lesione cellulare è stata ottenuta con un metodo relativamente semplice, vale a dire 24 h privazione di ossigeno e sostanze nutritive. Tuttavia, si dovrebbe fare attenzione a considerare processi patofsiologici accurati della cardiopatia ischemica, poiché esistono effettivamente differenze tra la malattia in vivo e il modello di malattia dell’attuale protocollo, come la presenza o l’assenza di ambiente cellulare tridimensionale e sangue.
Per quanto riguarda l’aspetto tecnologico della valutazione della funzione cardiomiocite, Toepfer et al. ha segnalato un algoritmo basato su MatLab per determinare la contrazione e il rilassamento del sarcomere in hiPS-CMs22. Smith et al. ha riferito un metodo avanzato di analisi elettrofisiologica ad alto rendimento delle cellule eccitabili derivate da hiPS-CMs, utilizzando sofisticati array multielectrode con motivi nanotograficamente23,24. Il vantaggio del nostro protocollo è che richiede solo software convenzionali e materiali di consumo, come il software imageJ e piastre a 96 well.
Per quanto riguarda il livello di ossigeno nel cuore, la pressione di ossigeno nelle vene che raggiungono il cuore è pensata per essere 40 mmHg25. Secondo McDougal et al., la pressione extracellulare dell’ossigeno sotto ipossia è stimata in <12.8 mmHg26. Applicando il metodo di Rounds et al.27, la pressione dell’ossigeno nel mezzo di coltura (salinità: 35‰) sotto la condizione ipossica (2% di ossigeno) a 37 gradi centigradi trattata con il protocollo attuale è calcolata in modo da essere 14,9 mmHg, che è superiore alla stima di cui sopra. È interessante notare che, Al-Ani et al. ha riferito che c’è un gradiente di pressione dell’ossigeno nel mezzo di coltura, e la pressione dell’ossigeno è influenzata dal tipo di cellula, densità di semina, e volume medio28. Tipicamente, la concentrazione di ossigeno nella parte inferiore della piastra di coltura in cui risiedono le cellule è la più bassa. Pertanto, l’effetto della profondità nel mezzo di coltura ridurrebbe ulteriormente l’effettiva pressione dell’ossigeno vicino a singhiozzi. Al fine di indurre danni sufficienti ai sistemi hiPS-VM utilizzando condizioni ipossiche, è necessario prestare attenzione alla profondità del mezzo e alla densità delle cellule.
Il nostro modello hiPS-CM, che è molto vicino alle condizioni fisiologiche dei miociti cardiaci umani, imita in modo vantaggioso l’IHD umano. Gli approcci basati su modelli animali includono questioni etiche, tecniche e accademiche. In particolare, i modelli in vivo richiedono una tecnica avanzata di microchirurgia per ottenere dati riproducibili: ad esempio, l’occlusione del ramo discendente anteriore dell’arteria coronaria sinistra nei roditori3. Il modello hiPS-CM descritto nel punto di riferimento supera queste barriere critiche e fornisce una piattaforma utile, rilevante e ripetibile per le malattie cardiovascolari.
Tuttavia, alcune limitazioni dovrebbero essere notate. Un’ovvia differenza tra cardiomiociti iotti da iPS e cardiomiociti normali è l’assenza di tubuli T29, e non abbiamo includere fattori umoristici come danni ai tessuti indotti da leucociti e attivazione di un sistema di complemento nel nostro studio. Inoltre, il tasso di cardiomiociti differenziati in questo modello (20,7 ± 9,6%, Figura supplementare 3) dovrebbe essere migliorato. La recente pubblicazione di Halloin et al. descrive un metodo scalabile e definito chimicamente per indurre la purezza hiPS-CM di >95% da modulatori di vie WNT chimici senza alcun requisito di alcuna selezione da parte dei marcatori30. Tuttavia, il nostro modello di IHD umano è relativamente semplice e clinicamente applicabile (ad esempio, lo screening farmacologico utilizzando cellule iPS derivate dal paziente). Il nostro modello è anche una piattaforma unica per chiarire ulteriormente i meccanismi sottostanti gli IED.
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato sostenuto da JSPS KAKENHI, Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research), 17KK0168. Gli autori riconoscono con gratitudine il Central Research Laboratory, Okayama University Medical School per l’assistenza di FACS.
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |