인간 유도만능 줄기세포로부터 유래된 심근세포를 이용한 허혈성 심장질환 모델을 제시하고, 허혈에 의한 조직 손상의 정량적 평가를 위한 방법을 제시한다. 이 모델은 약물 검진및 허혈성 심장 질환에 대한 추가 연구를위한 유용한 플랫폼을 제공 할 수 있습니다.
허혈성 심장 질환은 전 세계적으로 중요한 사망 원인입니다. 따라서 설치류와 같은 작은 동물 모델과 함께 엄청난 양의 연구의 대상이되었습니다. 그러나, 인간 적인 심혼의 생리학은 심장병을 공부하기 위하여 임상적으로 관련있는 모형에 대한 필요를 강조하는 설치류 심혼의 것과 현저하게 다릅니다. 여기서, 인간 유도만능 줄기세포(hiPS-CM)와 차별화된 심근세포를 이용하여 허혈성 심장질환을 모델링하고 허혈성 심근세포의 손상 및 기능적 장애를 정량화하는 프로토콜을 제시한다. 포도당과 혈청이없는 2 %의 산소에 노출되면 부상당한 세포의 비율을 증가시켜, 이는 프로피듐 요오드와 핵의 염색에 의해 표시되고, 세포 생존가능성을 감소시킨다. 이러한 조건은 또한 현미경 비디오 이미지의 변위 벡터 필드 분석에 의해 확인된 바와 같이 hiPS-CM의 수축도 감소한다. 이 프로토콜은 또한 개별 환자로부터 hiPS 세포의 사용을 촉진하여 개인화 된 약물 스크리닝을위한 편리한 방법을 제공 할 수 있습니다. 따라서, 인간 기원의 iPS-CM을 기반으로 하는 허혈성 심장질환의 이 모형은, 약물 검열을 위한 유용한 플랫폼 및 허혈성 심장병에 대한 추가 연구를 제공할 수 있습니다.
허혈성 심장 질환 (IHD)은 전 세계적으로 사망의 주요 원인으로 인식되고 있으며 2016 년1에서 9 백만 명 이상의 사망자를 책임지는 것으로 추정되었습니다. 심혈관 질환의 보급은 계속 증가하고 있으며, 세계화는 개발도상국의 심장 질환 위험 요소의 보급에 기여한 것으로 보입니다. 따라서 IHD의 연구는 점점 더 긴급해지고 있다2.
심혈관 질환의 실험 모델은 질병의 메커니즘, 진단의 정확성 및 새로운 치료법의 개발을 연구하는 데 중요합니다. 몇몇 실험적인 모형은 많은 실험실에 의해 제안되었습니다. 중요한 장점을 가진 모델을 선택하는 것이 가장 중요합니다. 인체 질환에 대한 타당성, 반복성 및 유사성은 심혈관 질환 모델3의선택에 핵심적인 요소입니다. 특정 심근병증 관련 돌연변이를 운반하는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSCs)는 동물 모델4에대한 유망한 대안이다. ,iPSC5,6,,7,88,9를사용하여 심근세포를 유도하는 데 많은 전략이 설명되어 왔지만, 여기서는 마커를 사용하여 심근세포의 힘든 선택이 적용되지 않는 hiPSC에서 분화된 심근세포를 사용하여 IHD 모델을 생성하는 간단한 방법을 제공합니다., 이 방법에서, 심근세포는 자발적인 수축을 분석하여 기능적으로 선택된다.
hiPSCs를 사용하여 심근세포의 유도는 동물 희생및 기술적으로 어려운 수술을 피합니다. IHD의 동물 모델을 확립하려면 도전적인 수술 기술10이필요합니다. 설치류의 생리학에서 심박수 및 행동 잠재력과 같은 인간의 심장 질환의 다양한 병리학적 측면을 완벽하게 시뮬레이션하는 것은 거의 불가능합니다. 동물 모델 사용의 도덕성과 윤리와 결합하여 동물 모델 이외의 새로운 실험 모델의 개발이 필수적입니다. 인간 iPS 세포와 분화된 심근세포는 인간의 심장의 생리적 상태를 더 잘 모방한다. 이 프로토콜에서는 hiPS 세포(hiPS-CM)에서 파생된 심근세포(hiPS-CM)를 사용하여 IHD 모델을 설정합니다. 우리의 모형에서, 산소와 포도당의 박탈은 hiPS-CM의 수축 힘 그리고 생존의 감소로 이끌어 냅니다. 우리의 방법은 IHD 모형에 새로운 접근을 제공하고 이 질병의 연구를 위한 새로운 플랫폼을 보여줍니다.
연구원은 종종 IHD 실험을 수행하기 위해 실험실 작은 동물 모델을 사용합니다. 여기서, 우리는 그러한 실험을 수행하기 위하여 인간 IHD의 세포 배양 모형을 개발했습니다.
이 프로토콜의 사용자가 직면 할 수있는 주요 문제는 차별화 된 심근세포의 낮은 비율입니다. 성공적인 분화 속도를 향상시키기 위해 세심한 주의를 기울여 몇 가지 단계를 수행해야합니다: (a) 세포가 세포 해리 효소 시약을 첨가한 후 쉽게 분리되기 때문에 파이펫팅 시 부드럽게 해야 하며, (b) Y-27632를 첨가하면 분리시 iPS 세포의 생존율이 증가하고, (c) 분화 의 시작 시 중간 변화의 타이밍은 분화에 관여하는 유전자의 통제된 발현을 보장하기 위해 정확하게 48h 떨어져 있어야 한다.
배양판의 표면을 코팅하는 데 사용되는 세포외 매트릭스 단백질에 관해서는, 본 프로토콜에 사용된 라미닌 이외의 물질을 사용할 수 있다. 예를 들어,마트리겔(14),15,및 젤라틴(16)16,17은 hiPSC의 피더 프리 유지 보수 문화에 사용된다. 하라구치 외에 따르면, 마트리겔에 시드된 hiPSCs는 심장 세포 시트18로성공적으로 분화되었다.
hiPSCs에서 파생된 심근세포를 사용하여 질병 모델링을 위한 배양 모델에 관하여 선행 한 연구는 많이 있습니다. 허혈 재관류 손상의 모델링에 관해서는, 고칼륨혈증, 산증 및 젖산 축적과 같은 세포 환경의 조작이19개도입되었다. 다른 방법으로는 산소확산(20)과 시안화물(21)을 이용한 대사21억제를 방해하는 세포 펠릿을 포함한다. 현재 프로토콜에서, 세포 상해는 상대적으로 간단한 방법, 즉 산소와 양분의 24 시간 박탈에 의해 달성되었다. 그러나, 3차원 세포 환경 및 혈액의 존재 또는 부재와 같은 현재 프로토콜의 생체 내 질환과 질병 모델 사이에 실제로 차이가 있기 때문에 허혈성 심장 질환의 정확한 병리학적 과정을 고려해야 한다.
심근세포 기능의 평가의 기술적 측면에 대해 Toepfer 외.는 hiPS-CM22에서사코프레 수축 및 이완을 결정하는 MatLab 기반 알고리즘을 보고했다. Smith 외.는 hiPS-CM에서 유래한 흥분성 세포의 고처리량 전기생리학적 분석의 고급 방법을 보고하여 정교한 나노지형 패턴 멀티 전기극어레이(23,,24)를이용하여 보고하였다. 우리의 프로토콜의 장점은 imageJ 소프트웨어 및 96 웰 플레이트와 같은 기존의 소프트웨어 및 소모품만 필요하다는 것입니다.
심장의 산소 수준에 대하여, 심혼에 도달하는 정맥에 있는 산소 압력은 40 mmHg25로생각됩니다. McDougal 외.에 따르면, 저산소증 하에서 세포 외 산소 압력은 추정된다 <12.8 mmHg26. Rounds etal.27의방법을 적용함으로써, 현재 프로토콜로 처리된 37°C에서 저산소 상태(2%산소)하에서 배양 배지(salinity: 35°)의 산소 압은 위의 추정치보다 높은 14.9mmHg로 계산된다. 흥미롭게도, Al-Ani 등은 배양 배지에 산소 압의 그라데이션이 있고, 산소 압력이 세포 형, 종자 밀도 및 중간부피(28)에의해 영향을 받는것으로 보고되었다. 전형적으로, 세포가 거주하는 배양판의 바닥에 있는 산소 농도는 가장 낮다. 따라서 배양 배지의 깊이의 효과는 hiPS-CM 근처의 효과적인 산소 압력을 더욱 감소시킬 것이다. 저산소 상태를 사용하여 hiPS-CM에 충분한 손상을 유도하기 위해서는 중간 깊이 및 세포 밀도에 주의를 기울여야 합니다.
인간의 심장 심근세포의 생리적 조건에 매우 가까운 우리의 hiPS-CM 모델은 인간 IHD를 유리하게 모방합니다. 동물 모델 기반 접근 방식에는 윤리적, 기술적 및 학문적 문제가 포함됩니다. 특히, 생체 내 모델은 재현 가능한 데이터를 달성하기 위해 미세 수술의 고급 기술이 필요합니다: 예를 들어, 설치류3에서좌측 관상 동맥의 전방 내림차순 분기의 폐색. 본 명세서에 설명된 hiPS-CM 모델은 이러한 중요한 장벽을 극복하고 심혈관 질환에 대한 유용하고 관련성이 있으며 반복 가능한 플랫폼을 제공합니다.
그러나 몇 가지 제한 사항에 유의해야 합니다. iPS 유도 심근세포와 일반 심근세포 사이의 명백한 차이점은 T-tubules29의부재이며, 우리는 백혈구에 의해 유도된 조직 손상 및 우리의 연구에서 보완 시스템의 활성화와 같은 유머 인자를 포함하지 않았습니다. 더욱이, 본 모델에서 차별화된 심근세포의 비율(20.7± 9.6%, 보충도 3)의비율이 향상되어야 한다. 할로인 외에 의한 최근 간행물은마커(30)에의한 임의의 선택 요건 없이 화학적 WNT 통로 변조기에 의한 hiPS-CM 순도및 95%를 유도하는 확장가능하고 화학적으로 정의된 방법을 설명한다. 그럼에도 불구하고, 인간 IHD의 우리의 모형은 상대적으로 간단하고 임상적으로 적용됩니다 (예를 들면, 환자 유래 iPS 세포를 이용한 약 검열). 우리의 모델은 또한 ID의 기본 메커니즘을 더 해명할 수있는 독특한 플랫폼입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 JSPS KAKENHI에 의해 지원되었다, 공동 국제 연구 (공동 국제 연구 육성) 기금, 17KK0168. 저자는 FACS의 도움을 위해 중앙 연구소, 오카야마 대학 의과 대학을 감사하게 인정합니다.
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |