ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞を用いた虚血性心疾患のモデルを、虚血による組織損傷の定量的評価方法と共に提示する。このモデルは、薬物スクリーニングおよび虚血性心疾患に関するさらなる研究のための有用なプラットフォームを提供することができる。
虚血性心疾患は、世界中の死亡の重大な原因です。したがって、多くの場合、げっ歯類などの小動物モデルで、膨大な量の研究の対象となっています。しかし、ヒト心臓の生理学はげっ歯類の心臓の生理学とは大きく異なり、心臓病を研究するために臨床的に関連するモデルの必要性を強調している。ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(hiPS-CM)と分化した心筋細胞を用いて虚血性心疾患をモデル化し、虚血性心筋細胞の損傷および機能障害を定量化するプロトコルを提示する。グルコースおよび血清を含まない2%の酸素への曝露は、ヨウ化プロピジウムで核を染色することによって示される負傷細胞の割合を増加させ、細胞の生存率を低下させる。これらの条件はまた、顕微鏡ビデオ画像の変位ベクトル場分析によって確認されるようにhiPS-CMの収縮性を低下させる。このプロトコルは、個々の患者からのhiPS細胞の使用を促進することによって、さらに個別の薬物スクリーニングのための便利な方法を提供することができる。したがって、この虚血性心疾患モデルは、ヒト起源のiPS-CMに基づいて、虚血性心疾患に関する薬物スクリーニングおよびさらなる研究のための有用なプラットフォームを提供することができる。
虚血性心疾患(IHD)は、死亡の主な原因として世界的に認識され、2016年に900万人以上の死亡者の原因であると推定された1。心血管疾患の罹患率は増加し続けており、グローバリゼーションは発展途上国における心臓病の危険因子の蔓延に寄与していると考えられます。したがって、IHDの研究はますます緊急になりつつあります 2.
心血管疾患の実験モデルは、疾患のメカニズム、診断の正確さ、新しい治療法の開発を研究するために重要です。いくつかの実験モデルは、多くの研究室によって提案されています。大きな利点を持つモデルを選択することが最も重要です。人間の病気に対する実現可能性、再現性および類似性は、心血管疾患モデル3の選択における重要な要因である。ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)は、特定の心筋症関連変異を有する動物モデル4に代わる有望な代替物である。iPSC,,95,6,7,8,96,7を用いて心筋細胞を5誘導する戦略は数多く記載されているが、ここでは、マーカーを用いた心筋細胞の手間の選定が行われていないhiPSCと区別した心筋細胞を用いてIHDモデルを作製する簡単な方法を提供する。8この方法では、自然収縮を解析して機能的に心筋細胞を選択する。
HIPSCを用いた心筋細胞の誘導は、動物の犠牲や技術的に困難な手術を避ける。IHDの動物モデルを確立するには、挑戦的な外科技術10が必要です。げっ歯類の生理学から心拍数や行動電位などの人間の心臓病の様々な病態生理学的側面を完全にシミュレートすることはほぼ不可能です。動物モデルを用いた道徳や倫理と相まって、動物モデル以外の新しい実験モデルの開発が不可欠です。ヒトiPS細胞から分化した心筋細胞は、ヒトの心臓の生理学的状態をよりよく模倣する。このプロトコルでは、HiPS細胞(hiPS-CM)由来の心筋細胞を用いたIHDモデルを確立する。我々のモデルでは、酸素とグルコースの欠乏は、hiPS-CMの収縮力と生存率の低下につながります。我々の方法は、モデルIHDへの新しいアプローチを提供し、この疾患の研究のための新しいプラットフォームを示しています。
研究者は、多くの場合、IHD実験を行うために実験室の小動物モデルを使用しています.そこで、このような実験を行うヒトIHDの細胞培養モデルを開発しました。
このプロトコルのユーザーが直面する主な問題は、分化された心筋細胞の低率である。正常な分化の速度を改善するために細心の注意を払って行う必要があります:(a)細胞解離酵素試薬の添加後に容易に切り離す細胞、(b)Y-27632を添加すると、分離時のiPS細胞の生存率が増加し、(c)分化の開始時の培地変化のタイミングは、異なる遺伝子の分解を確実にするために正確に48時間でなければならない。
培養プレートの表面をコーティングするために使用される細胞外マトリックスタンパク質に関しては、このプロトコルで使用したラミニン以外の材料も使用できます。例えば、Matrigel14、15、およびゼラチン14,16、17,17は、hiPSCのフィーダーフリー維持培養に使用される。原口らによると、マトリゲルに播種されたhiPSCは、心臓細胞シート18に正常に分化された。
HIPSC由来の心筋細胞を用いた疾患モデルモデルの培養モデルに関する先行研究が数多く行われている。虚血再灌流損傷のモデル化に関しては、高カリウム血症、アシドーシス、乳酸蓄積などの細胞環境の操作が導入された19.他の方法としては、酸素拡散20 を妨げる細胞ペレット化やシアン化物21を用いた代謝抑制が挙げられる。現在のプロトコルでは、細胞損傷は比較的単純な方法、すなわち酸素および栄養素の24時間の剥奪によって達成された。しかし、3次元細胞環境や血液の有無など、生体内疾患と現在のプロトコルの疾患モデルとの間には確かに違いがあるので、虚血性心疾患の正確な病態生理学的プロセスを考慮するように注意する必要があります。
心筋細胞機能の評価の技術的側面について、ToepferらはhiPS-CM22におけるサルコメア収縮および弛緩を決定するMatLabベースのアルゴリズムを報告した。22Smithらは、hiPS-CMに由来する興奮性細胞の高スループット電気生理学的解析の高度な方法を報告し、高度なナノトポグラフィパターン多電極アレイ23,24,24を用いた。私たちのプロトコルの利点は、imageJソフトウェアや96ウェルプレートなどの従来のソフトウェアと消耗品しか必要としなくていいということです。
心臓の酸素濃度に関しては、心臓に到達する静脈の酸素圧力は40mmHg25と考えられている。McDougalらのご報告によると、低酸素下の細胞外酸素圧は<12.8mmHg26であると推定される。ラウンドスら27の方法を適用することにより、現在のプロトコルで処理された37°Cの低酸素状態(2%酸素)下の培養培地中の酸素圧力(35‰)は、上記の推定値より高い14.9mmHgであると計算される。興味深いことに、Al-Aniらは、培養培地中に酸素圧の勾配があり、酸素圧力が細胞型、播種密度、および中容積28の影響を受けていることを報告した。典型的には、細胞が存在する培養プレートの底部の酸素濃度が最も低い。したがって、培養培地における深さの効果は、hiPS-CMの近傍の有効な酸素圧力をさらに低下させるであろう。低酸素状態を用いてhiPS-CMに十分な損傷を与えるためには、培地の深さと細胞の密度に細心の注意を払う必要があります。
ヒト心臓筋細胞の生理的条件に非常に近いhiPS-CMモデルは、有利にヒトIHDを模倣する。動物モデルに基づくアプローチには、倫理的、技術的、学術的な問題が含まれます。特に、生体内モデルでは、再現性データを達成するためのマイクロサージャリーの高度な技術が必要である:例えば、げっ歯類3における左冠動脈の前下方枝の閉塞。本明細書に記載されているhiPS-CMモデルは、これらの重大な障壁を克服し、心血管疾患に有用で、関連性があり、反復可能なプラットフォームを提供する。
ただし、いくつかの制限に注意する必要があります。iPS誘導型心筋細胞と正常心筋細胞の明らかな違いはT-tubule29の欠如であり、白血球によって引き起こされる組織損傷や補体系の活性化などの体液性因子は含まれていなかった。また、このモデルにおける分化心筋細胞の割合(20.7±9.6%、 補足図3)を改善する必要があります。最近の出版物は、マーカー30による選択を必要とせずに化学WNT経路変調器によって>95%のhiPS-CM純度を誘導するスケーラブルで化学的に定義された方法を説明している。それにもかかわらず、ヒトIHDのモデルは比較的単純で臨床的に適用可能です(例えば、患者由来のiPS細胞を用いた薬物スクリーニング)。また、当社のモデルは、基礎となるIDのメカニズムをさらに解明するためのユニークなプラットフォームでもあります。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、JSPS KAKENHI(国際共同研究推進基金)17KK0168によって支援されました。著者らは、FACSの支援を受け入れた岡山大学医学部中央研究所を認めている。
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |