Vi presenterer en modell av iskemisk hjertesykdom ved hjelp av kardiomyocytter avledet fra humane induserte pluripotente stamceller, sammen med en metode for kvantitativ evaluering av vevsskade forårsaket av iskemi. Denne modellen kan gi en nyttig plattform for narkotikascreening og videre forskning på iskemisk hjertesykdom.
Iskemisk hjertesykdom er en betydelig dødsårsak over hele verden. Det har derfor vært gjenstand for en enorm mengde forskning, ofte med smådyrmodeller som gnagere. Imidlertid er fysiologien til det menneskelige hjerte betydelig forskjellig fra gnagerhjertet, og understreker behovet for klinisk relevante modeller for å studere hjertesykdom. Her presenterer vi en protokoll for å modellere iskemisk hjertesykdom ved hjelp av kardiomyocytter differensiert fra humane induserte pluripotente stamceller (hiPS-CMs) og for å kvantifisere skaden og funksjonsnedsettelsen av iskemiske kardiomyocytter. Eksponering for 2% oksygen uten glukose og serum øker prosentandelen av skadede celler, som indikeres ved farging av kjernen med propidiumjodid, og reduserer cellulær levedyktighet. Disse betingelsene reduserer også kontraktiliteten til hiPS-CMs som bekreftet ved forskyvning vektorfeltanalyse av mikroskopiske videobilder. Denne protokollen kan videre gi en praktisk metode for personlig legemiddelscreening ved å legge til rette for bruk av hiPS-celler fra individuelle pasienter. Derfor kan denne modellen av iskemisk hjertesykdom, basert på iPS-CMs av menneskelig opprinnelse, gi en nyttig plattform for narkotikascreening og videre forskning på iskemisk hjertesykdom.
Iskemisk hjertesykdom (IHD) er anerkjent over hele verden som den ledende dødsårsaken, og det ble anslått å være ansvarlig for mer enn ni millioner dødsfall i 20161. Forekomsten av hjerte- og karsykdommer fortsetter å stige, og globaliseringen synes å ha bidratt til forekomsten av risikofaktorer for hjertesykdom i utviklingsland. Derfor blir studien av IHD stadig mer presserende2.
Eksperimentelle modeller av kardiovaskulær sykdom er avgjørende for å studere sykdomsmekanismer, nøyaktighet av diagnose og utvikling av nye terapier. Flere eksperimentelle modeller har blitt foreslått av mange laboratorier. Det er av største betydning å velge en modell med betydelige fordeler; gjennomførbarhet, repeterbarhet og likhet med menneskelig sykdom er viktige faktorer i valg av kardiovaskulær sykdom modeller3. Humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCer) som bærer spesifikke kardiomyopati-assosierte mutasjoner er et lovende alternativ til dyremodeller4. Selv om mange strategier har blitt beskrevet for å indusere kardiomyocytter ved hjelp av iPSCs5,6,7,8,9, her gir vi en enkel metode for å produsere en IHD-modell ved hjelp av kardiomyocytter differensiert fra hiPSCer, der arbeidskrevende utvalg av kardiomyocytter ved hjelp av markører ikke brukes. I denne metoden velges kardiomyocytter funksjonelt ved å analysere spontan sammentrekning.
Induksjon av kardiomyocytter ved hjelp av hiPSCer unngår dyreoffer og teknisk vanskelig kirurgi. Etablering av dyremodeller av IHD krever utfordrende kirurgiske teknikker10. Perfekt simulere de ulike patofysilogiske aspektene ved menneskelig hjertesykdom som hjertefrekvens og virkningspotensialer fra fysiologi av gnagere er nesten umulig. Kombinert med moralen og etikken ved å bruke dyremodeller, er utviklingen av nye eksperimentelle modeller enn dyremodeller avgjørende. Kardiomyocytter differensiert fra menneskelige iPS-celler etterligner bedre den fysiologiske tilstanden til det menneskelige hjertet. I denne protokollen etablerer vi en modell av IHD ved hjelp av kardiomyocytter avledet fra hiPS-celler (hiPS-CMs). I vår modell fører deprivasjon av oksygen og glukose til en reduksjon i kontraktil kraft og levedyktighet av hiPS-CMs. Vår metode gir en ny tilnærming til modell IHD og demonstrerer en ny plattform for studiet av denne sykdommen.
Forskere bruker ofte laboratoriemodeller for små dyr til å gjennomføre IHD-eksperimenter. Her utviklet vi en cellekulturmodell av menneskelig IHD for å utføre slike eksperimenter.
Hovedproblemet en bruker av denne protokollen kan møte er lav hastighet på differensierte kardiomyocytter. Flere trinn bør tas med stor forsiktighet for å forbedre frekvensen av vellykket differensiering: (a) være forsiktig når de pipettering fordi cellene lett løsner etter tilsetning av celledissosiasjonsenzymer reagens, (b) å legge til Y-27632 øker overlevelsesraten til iPS-celler ved løsrivelse, og (c) tidspunktet for middels endringer i begynnelsen av differensiering bør være nøyaktig 48 h fra hverandre for å sikre kontrollert uttrykk for gener involvert i differensiering.
Når det gjelder ekstracellulære matriseproteiner som brukes til å belegge overflaten av kulturplaten, kan andre materialer enn laminin vi brukte i denne protokollen brukes. Matrigel14,15oggelatin16,17 brukes for materfri vedlikeholdskultur av hiPSCer. Ifølge Haraguchi et al., hiPSCs seeded på Matrigel ble vellykket differensiert i hjertecelleark18.
Det finnes en rekke tidligere studier om kulturmodeller for sykdomsmodellering ved hjelp av kardiomyocytter avledet fra hiPSCer. Når det gjelder modellering av iskemi-reperfusjonsskade, har manipulasjoner av cellemiljøet, som hyperkalemi, acidose og laktatakkumulering, blittintrodusert 19. Andre metoder inkluderer cellepelleting for å hindre oksygendiffusjon20 og metabolsk hemming ved hjelp avcyanid 21. I den nåværende protokollen ble celleskade oppnådd ved relativt enkel metode, nemlig 24 h deprivasjon av oksygen og næringsstoffer. Det bør imidlertid tas hensyn til å vurdere nøyaktige patofysilogiske prosesser av den iskemiske hjertesykdommen, da det faktisk er forskjeller mellom sykdommen in vivo og sykdomsmodellen av den nåværende protokollen, for eksempel tilstedeværelse eller fravær av tredimensjonalt cellulært miljø og blod.
Når det gjelder det teknologiske aspektet ved evalueringen av kardiomyocyte-funksjonen, rapporterte Toepfer et al. en MatLab-basert algoritme for å bestemme sarcomere sammentrekning og avslapning i hiPS-CMs22. Smith et al. rapporterte en avansert metode for høy gjennomstrømning elektrofysiologisk analyse av spennende celler avledet fra hiPS-CMs, ved hjelp av sofistikerte nanotopografisk mønstrede multielektrodarrayer23,,24. Fordelen med vår protokoll er at den bare krever konvensjonell programvare og forbruksvarer, for eksempel imageJ-programvare og 96-brønnplater.
Med hensyn til oksygennivået i hjertet, oksygentrykket i årer som når hjertet antas å være 40 mmHg25. Ifølge McDougal et al., ekstracellulært oksygentrykk under hypoksi er anslått å være <12.8 mmHg26. Ved å bruke metoden for runder et al.27, er oksygentrykket i kulturmediet (saltholdighet: 35‰) under hypoksisk tilstand (2% oksygen) ved 37 °C behandlet med gjeldende protokoll beregnet til å være 14,9 mmHg, som er høyere enn estimeringen ovenfor. Interessant, Al-Ani et al. rapporterte at det er en gradient av oksygentrykk i kulturmediet, og oksygentrykket påvirkes av celletype, såetetthet og middels volum28. Vanligvis er oksygenkonsentrasjonen på bunnen av kulturplaten der cellene bor den laveste. Derfor vil effekten av dybde i kulturmediet ytterligere redusere det effektive oksygentrykket nær hiPS-CMs. For å indusere tilstrekkelig skade på hiPS-CMs ved hjelp av hypoksisk tilstand, må nøye oppmerksomhet rettes mot dybden av middels og tettheten av celler.
Vår hiPS-CM-modell, som ligger svært nær de fysiologiske forholdene til humane hjerte myocytter, etterligner fordelaktig menneskelig IHD. Dyremodellbaserte tilnærminger inkluderer etiske, tekniske og akademiske problemstillinger. Spesielt krever in vivo-modeller en avansert teknikk for mikrokirurgi for å oppnå reproduserbare data: f.eks. okklusjon av den fremre synkende grenen av venstre koronararterie hos gnagere3. HiPS-CM-modellen som er beskrevet her, overvinner disse kritiske barrierene og gir en nyttig, relevant og repeterbar plattform for kardiovaskulær sykdom.
Noen begrensninger bør imidlertid noteres. En åpenbar forskjell mellom iPS-induserte kardiomyocytter og normale kardiomyocytter er fraværet av T-tubuli29, og vi inkluderte ikke humorale faktorer som vevsskade indusert av leukocytter og aktivering av et komplementsystem i vår studie. Videre bør frekvensen av differensierte kardiomyocytter i denne modellen (20,7 ± 9,6%, Supplerende figur 3) forbedres. Den nylige publikasjonen av Halloin et al. beskriver en skalerbar, kjemisk definert metode for å indusere hiPS-CM renhet på > 95% av kjemiske WNT pathway modulatorer uten krav om valg av markører30. Likevel er vår modell av menneskelig IHD relativt enkel og klinisk anvendelig (f.eks. legemiddelscreening ved hjelp av pasientavledede iPS-celler). Vår modell er også en unik plattform for ytterligere å belyse mekanismer underliggende IHDer.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av JSPS KAKENHI, Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research), 17KK0168. Forfatterne takknemlig anerkjenne Central Research Laboratory, Okayama University Medical School for hjelp av FACS.
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |