我们提出了一个缺血性心脏病的模型,使用从人类诱导多能干细胞中提取的心肌细胞,以及一种定量评估缺血引起的组织损伤的方法。该模型可为药物筛查和进一步研究缺血性心脏病提供一个有用的平台。
缺血性心脏病是全世界死亡的一个重要原因。因此,它一直是大量研究的主题,往往与小动物模型,如啮齿动物。然而,人类心脏的生理与啮齿动物心脏的生理机能有显著差异,这突出表明需要临床相关模型来研究心脏病。在这里,我们提出了一个方案,使用与人类诱导多能干细胞(hiPS-CMs)不同的心肌细胞来模拟缺血性心脏病,并量化缺血性心肌细胞的损伤和功能损伤。在没有葡萄糖和血清的情况下暴露2%的氧气会增加受伤细胞的百分比,这通过用碘化钠染色细胞核来表示,并降低细胞的生存能力。这些条件还降低了hiPS-CMs的收缩性,这一点通过微观视频图像的位移向量场分析得到证实。此外,通过促进单个患者的hiPS细胞的使用,该协议可以为个性化药物筛查提供一种方便的方法。因此,这种基于人类起源的 iPS-CMs 的缺血性心脏病模型可以为药物筛选和进一步研究缺血性心脏病提供一个有用的平台。
缺血性心脏病 (IHD) 被全世界公认为主要死因,据估计,2016 年1月造成 900 多万人死亡。心血管疾病的流行率继续上升,全球化似乎助长了发展中国家心脏病危险因素的流行。因此,IHD的研究越来越迫切。
心血管疾病的实验模型对于研究疾病机制、诊断的准确性和新疗法的发展至关重要。许多实验室提出了几种实验模型。选择具有显著优势的模型至关重要;可行性、可重复性和人类疾病的相似性是心血管疾病模型选择的关键因素。携带特定心肌病相关突变的人类诱导多能干细胞(hiPSCs)是动物模型4的有希望的替代品。虽然已经描述了许多策略,用于诱导心肌细胞使用 iPSCs 5,,6,,7,,8,,9,在这里,我们提供一个简单的方法,以产生一个简单的方法,使用心肌细胞区别于hiPSC, 其中不应用使用标记的心肌细胞的费力选择.在这种方法中,通过分析自发收缩,从功能上选择心肌细胞。
使用 hiPSC 诱导心肌细胞可避免动物牺牲和技术上困难的手术。建立 IHD 的动物模型需要具有挑战性的手术技术 10。从啮齿动物的生理学上完美地模拟人类心脏病的各种病理生理方面,如心率和作用潜力,几乎是不可能的。结合动物模型的道德伦理,开发动物模型以外的新实验模型势在必行。与人类 iPS 细胞不同的心肌细胞可以更好地模仿人类心脏的生理状态。在此协议中,我们使用从hiPS细胞(hiPS-CMs)衍生的心肌细胞建立了 IHD 模型。在我们的模型中,氧气和葡萄糖的剥夺导致hiPS-CMs的收缩力和生存能力降低。该方法为 IHD 模型提供了一种新方法,并演示了研究该病的新平台。
研究人员经常使用实验室小动物模型进行 IHD 实验。在这里,我们开发了人类 IHD 的细胞培养模型来进行此类实验。
此协议用户可能面临的主要问题是分化心肌细胞率低。应非常小心地采取几个步骤来提高成功分化率:(a) 移液时保持温和,因为细胞在添加细胞分离酶试剂后容易分离;(b) 添加 Y-27632 可提高分离时 iPS 细胞的存活率;(c) 分化开始时介质变化的时间应精确 48 h 分开,以确保参与分化的基因的受控表达。
关于用于涂覆培养板表面的细胞外基质蛋白,可以使用本协议中使用的层压素以外的其他材料。例如,Matrigel14、,15和明胶16、17用于 hiPSC 的免馈线维护培养。16,根据原口等人的说法,在Matrigel上播种的hiPSC被成功地分化成心脏细胞表18。
有一些前述研究,关于培养模型的疾病建模使用心肌细胞派生自hiPSC。关于缺血-再灌注损伤的建模,19介绍了对细胞环境的操纵,如高钾血症、酸中毒和乳酸积累。其他方法包括细胞造粒阻碍氧气扩散20 和代谢抑制使用氰化物21。在目前的方案中,细胞损伤是通过相对简单的方法实现的,即24小时剥夺氧气和营养物质。然而,应注意考虑缺血性心脏病的准确病理生理过程,因为体内疾病与当前协议的疾病模型之间确实存在差异,例如是否存在三维细胞环境和血液。
关于心肌细胞功能评估的技术方面,Toepfer等人报告了基于MatLab的算法,用于确定hiPS-CMs22中的沙康美收缩和松弛。Smith等人报告了一种先进的高通量电生理分析方法,该方法使用先进的纳米图型多电极阵列23、24,,对从hiPS-CMs中提取的可兴奋细胞进行高通量电生理分析。我们的协议的优点是,它只需要传统的软件和耗材,如图像J软件和96孔板。
关于心脏的氧水平,到达心脏的静脉中的氧压被认为是40毫米汞柱25。根据McDougal等人的说法,缺氧下的细胞外氧压估计为<12.8 mmHg26。通过采用圆27等方法,在用当前方案处理的37°C下,培养基介质中的氧压(盐度:35°)计算为14.9毫米汞柱,高于上述估计值。有趣的是,Al-Ani等人报告说,培养基中氧压有梯度,氧压受细胞类型、播种密度和介质体积28的影响。通常,细胞所在的培养板底部的氧气浓度最低。因此,培养基的深度效应将进一步降低hiPS-CMs附近的有效氧压。为了使用缺氧条件对hiPS-CMs造成足够的损伤,必须仔细注意介质的深度和细胞的密度。
我们的hiPS-CM模型非常接近人类心脏肌细胞的生理条件,有利地模仿人类 IHD。基于动物模型的方法包括伦理、技术和学术问题。特别是,体内模型需要先进的显微外科技术来实现可重复的数据:例如,啮齿动物3中左冠状动脉前下降分支的遮挡。此处描述的 hiPS-CM 模型克服了这些关键障碍,为心血管疾病提供了一个有用、相关且可重复的平台。
但是,应注意一些限制。iPS诱导心肌细胞和正常心肌细胞之间的一个明显区别是缺乏T-tubule29,我们不包括体基因素,如白细胞引起的组织损伤和补充系统的激活在我们的研究中。此外,该模型中的分化心肌细胞率(20.7±9.6%, 补充图3)。Halloin等人最近出版的一份可伸缩的化学定义方法,通过化学WNT通路调制剂诱导hiPS-CM纯度为>95%,无需通过标记30进行任何选择。然而,我们的人类 IHD 模型相对简单且临床适用(例如,使用患者衍生的 iPS 细胞进行药物筛查)。我们的模型也是一个独特的平台,可以进一步阐明 IHD 的基础机制。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了JSPS KAKENHI,促进联合国际研究基金(促进联合国际研究),17KK0168的支持。作者感谢冈山大学医学院中央研究实验室对FACS的援助。
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |