Presentamos un modelo de cardiopatía isquémica utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos, junto con un método para la evaluación cuantitativa del daño tisular causado por la isquemia. Este modelo puede proporcionar una plataforma útil para la detección de fármacos y la investigación adicional sobre enfermedades cardíacas isquémicas.
Las cardiopatías isquémicas son una causa importante de muerte en todo el mundo. Por lo tanto, ha sido objeto de una enorme cantidad de investigación, a menudo con modelos de animales pequeños como roedores. Sin embargo, la fisiología del corazón humano difiere significativamente de la del corazón de roedores, subrayando la necesidad de modelos clínicamente relevantes para estudiar enfermedades del corazón. Aquí, presentamos un protocolo para modelar la cardiopatía isquémica utilizando cardiomiocitos diferenciados de las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPS-CM) y para cuantificar el daño y deterioro funcional de los cardiomiocitos isquémicos. La exposición al 2% de oxígeno sin glucosa y suero aumenta el porcentaje de células lesionadas, que se indica mediante la tinción del núcleo con yoduro de propidium, y disminuye la viabilidad celular. Estas condiciones también disminuyen la contractilidad de los hiPS-CM confirmados por el análisis de campo vectorial de desplazamiento de imágenes de vídeo microscópicas. Además, este protocolo puede proporcionar un método conveniente para la detección personalizada de medicamentos al facilitar el uso de células hiPS de pacientes individuales. Por lo tanto, este modelo de cardiopatía isquémica, basado en iPS-CM de origen humano, puede proporcionar una plataforma útil para la detección de fármacos y la investigación adicional sobre enfermedades isquémicas del corazón.
La cardiopatía isquémica (IHD) es reconocida en todo el mundo como la principal causa de muerte, y se estimó que fue responsable de más de nueve millones de muertes en 20161. La prevalencia de las enfermedades cardiovasculares sigue aumentando y la globalización parece haber contribuido a la prevalencia de factores de riesgo de enfermedades cardíacas en los países en desarrollo. Por lo tanto, el estudio de la IHD es cada vez más urgente2.
Los modelos experimentales de enfermedades cardiovasculares son fundamentales para estudiar los mecanismos de la enfermedad, la precisión del diagnóstico y el desarrollo de nuevas terapias. Varios modelos experimentales han sido propuestos por muchos laboratorios. Es de suma importancia elegir un modelo con ventajas significativas; viabilidad, repetibilidad y similitud con las enfermedades humanas son factores clave en la selección de los modelos de enfermedades cardiovasculares3. Las células madre pluripotentes inducidas por el ser humano (hiPSC) portadoras de mutaciones específicas asociadas a la cardiomiopatía son una alternativa prometedora a los modelos animales4. Aunque se han descrito muchas estrategias para inducir cardiomiocitos utilizando iPSCs5,6,7,,8,9, aquí proporcionamos un método simple para producir un modelo IHD utilizando cardiomiocitos diferenciados de hiPSCs, en el que no se aplica la laboriosa selección de cardiomiocitos usando marcadores. En este método, los cardiomiocitos se seleccionan funcionalmente mediante el análisis de la contracción espontánea.
La inducción de cardiomiocitos usando hiPSC evita el sacrificio animal y la cirugía técnicamente difícil. Establecer modelos animales de IHD requiere técnicas quirúrgicas desafiantes10. Es casi imposible simular perfectamente los diversos aspectos fisiopatológicos de las enfermedades cardíacas humanas, como la frecuencia cardíaca y los potenciales de acción de la fisiología de los roedores. Junto con la moral y la ética del uso de modelos animales, el desarrollo de nuevos modelos experimentales distintos de los modelos animales es imperativo. Los cardiomiocitos diferenciados de las células iPS humanas imitan mejor el estado fisiológico del corazón humano. En este protocolo, establecemos un modelo de IHD utilizando cardiomiocitos derivados de células hiPS (hiPS-CM). En nuestro modelo, la privación de oxígeno y glucosa conduce a una disminución en la fuerza contráctil y la viabilidad de los hiPS-CM. Nuestro método proporciona un nuevo enfoque para modelar IHD y demuestra una nueva plataforma para el estudio de esta enfermedad.
Los investigadores a menudo utilizan modelos de laboratorio para animales pequeños para llevar a cabo experimentos con IHD. Aquí, desarrollamos un modelo de cultivo celular de IHD humano para llevar a cabo tales experimentos.
El principal problema que puede enfrentar un usuario de este protocolo es la baja tasa de cardiomiocitos diferenciados. Se deben tomar varias medidas con gran cuidado para mejorar la tasa de diferenciación exitosa: (a) ser suave al pipetear porque las células se desprenden fácilmente después de la adición del reactivo de enzimas de disociación celular, (b) la adición de Y-27632 aumenta la tasa de supervivencia de las células iPS al separarse, y (c) el momento de los cambios medios al comienzo de la diferenciación debe ser precisamente 48 h de distancia para asegurar la expresión controlada de genes en la diferenciación.
En cuanto a las proteínas de matriz extracelular utilizadas para recubrir la superficie de la placa de cultivo, se pueden utilizar otros materiales distintos de la laminina que utilizamos en este protocolo. Por ejemplo, Matrigel14,15, y gelatina16,17 se utilizan para el cultivo de mantenimiento sin alimentación de hiPSCs. Según Haraguchi et al., hiPSCs sembrados en Matrigel se diferenciaron con éxito en la hoja de células cardíacas18.
Hay una serie de estudios anteriores sobre modelos de cultivo para el modelado de enfermedades utilizando cardiomiocitos derivados de hiPSCs. En cuanto al modelado de la lesión por isquemia-reperfusión, se han introducido19manipulaciones del entorno celular, como hiperpotasemia, acidosis y acumulación de lactato. Otros métodos incluyen peletización celular para obstaculizar la difusión de oxígeno20 y la inhibición metabólica utilizando cianuro21. En el protocolo actual, la lesión celular se logró mediante un método relativamente simple, a saber, la privación de oxígeno y nutrientes a las 24 horas. Sin embargo, se debe tener cuidado de considerar procesos fisiopatológicos precisos de la cardiopatía isquémica, ya que efectivamente hay diferencias entre la enfermedad in vivo y el modelo de enfermedad del protocolo actual, como la presencia o ausencia de entorno celular tridimensional y sangre.
En cuanto al aspecto tecnológico de la evaluación de la función cardiomiocitos, Toepfer et al. informaron de un algoritmo basado en MatLab para determinar la contracción y relajación de los sarcomeres en hiPS-CMs22. Smith y otros informaron de un método avanzado de análisis electrofisiológico de alto rendimiento de células excitables derivadas de hiPS-CM, utilizando sofisticados arreglos multielectrodo modelados nanotopográficamente23,,24. La ventaja de nuestro protocolo es que sólo requiere software convencional y consumibles, como software imageJ y placas de 96 pozos.
Con respecto al nivel de oxígeno en el corazón, la presión de oxígeno en las venas que llegan al corazón se cree que es 40 mmHg25. Según McDougal et al., la presión extracelular de oxígeno bajo hipoxia se estima en <12.8 mmHg26. Mediante la aplicación del método de Rondas yotros 27, la presión de oxígeno en el medio de cultivo (salinidad: 35o) bajo la condición hipoxica (2% de oxígeno) a 37 oC tratada con el protocolo actual se calcula como 14,9 mmHg, que es superior a la estimación anterior. Curiosamente, Al-Ani et al. informaron que hay un gradiente de presión de oxígeno en el medio de cultivo, y la presión de oxígeno se ve afectada por el tipo de célula, la densidad de siembra y el volumen medio28. Típicamente, la concentración de oxígeno en la parte inferior de la placa de cultivo donde residen las células es la más baja. Por lo tanto, el efecto de la profundidad en el medio de cultivo reduciría aún más la presión efectiva de oxígeno cerca de hiPS-CM. Con el fin de inducir suficiente daño a los hiPS-CM utilizando la condición hipoxica, se debe prestar atención cuidadosa a la profundidad del medio y la densidad de las células.
Nuestro modelo hiPS-CM, que está muy cerca de las condiciones fisiológicas de los miocitos cardíacos humanos, imita ventajosamente la IHD humana. Los enfoques basados en modelos animales incluyen cuestiones éticas, técnicas y académicas. En particular, los modelos in vivo requieren una técnica avanzada de microcirugía para lograr datos reproducibles: por ejemplo, oclusión de la rama descendente anterior de la arteria coronaria izquierda en roedores3. El modelo hiPS-CM descrito en este documento supera estas barreras críticas y proporciona una plataforma útil, relevante y repetible para las enfermedades cardiovasculares.
Sin embargo, deben tenerse en cuenta algunas limitaciones. Una diferencia obvia entre los cardiomiocitos inducidos por iPS y los cardiomiocitos normales es la ausencia de T-tubules29,y no incluimos factores humorales como el daño tisular inducido por los leucocitos y la activación de un sistema de complemento en nuestro estudio. Además, se debe mejorar la tasa de cardiomiocitos diferenciados en este modelo (20,7 ± 9,6%, Figura Complementaria 3). La reciente publicación de Halloin et al. describe un método escalable, definido químicamente para inducir la pureza hiPS-CM de >95% por moduladores químicos de vía WNT sin necesidad de ninguna selección por los marcadores30. Sin embargo, nuestro modelo de IHD humana es relativamente simple y clínicamente aplicable (por ejemplo, el cribado de fármacos utilizando células iPS derivadas del paciente). Nuestro modelo es también una plataforma única para dilucidar aún más los mecanismos subyacentes a los IHD.
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue apoyado por JSPS KAKENHI, Fondo para la Promoción de la Investigación Internacional Conjunta (Fostering Joint International Research), 17KK0168. Los autores agradecen al Laboratorio Central de Investigación de la Escuela de Medicina de la Universidad de Okayama por la asistencia de FACS.
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |