Summary
Описанный протокол для выполнения интракачальной трансплантации мезенхимальных стромальных клеток (MSCs) через интрачехальные инъекции в термине неонатальных крыс. Этот метод является клинически жизнеспособным вариантом для доставки стволовых клеток и препаратов в легкие неонатальной крысы, чтобы оценить их эффективность.
Abstract
Длительное воздействие высоких концентраций кислорода приводит к воспалению и острой травме легких, которая похожа на бронхолегочную дисплазию человека (БЛД). У недоношенных детей, BPD является одним из основных осложнений, несмотря на раннее использование сурфактантной терапии, оптимальные стратегии вентиляции, и неинвазивной вентиляции положительного давления. Поскольку воспаление легких играет решающую роль в патогенезе БЛД, использование кортикостероидов является одним из потенциальных методов лечения, чтобы предотвратить его. Тем не менее, системное лечение кортикостероидами обычно не рекомендуется для недоношенных детей из-за долгосрочных побочных эффектов. Доклинические исследования и клинические испытания человеческой фазы I показали, что использование мезенхимальных стромальных клеток (МСК) при травмах легких, вызванных гипероксией, и у недоношенных детей является безопасным и осуществимым. Было показано, что внутритравмная и внутривенная трансплантация MSC защищает от неонатальной гипероксической травмы легких. Поэтому интратрахенное введение стволовых клеток и комбинированное сурфактантное и глюкокортикоидное лечение стало новой стратегией лечения новорожденных с респираторными расстройствами. Стадия развития легких крыс при рождении эквивалентна той, что в легких человека в 26–28 недель беременности. Таким образом, новорожденные крысы подходят для изучения интрачиального введения для недоношенных детей с дыхательной недостаточностью, чтобы оценить его эффективность. Этот метод интрачиальной трансплантации является клинически жизнеспособным вариантом для доставки стволовых клеток и препаратов в легкие.
Introduction
Дополнительный кислород часто требуется для лечения новорожденных с дыхательной дистресс1. Однако, гипероксия терапия у младенцев имеет неблагоприятные долгосрочные последствия. Длительное воздействие высоких концентраций кислорода приводит к воспалению и острой травме легких, которая похожа на бронхолегочную дисплазию человека (БЛД)2. BPD является основным осложнением лечения гипероксия, которые могут возникнуть, несмотря на раннюю сурфактантную терапию, оптимальные процедуры вентиляции и более широкое использование неинвазивной вентиляции положительного давления у недоношенных детей. Хотя многие стратегии лечения были зарегистрированы для BPD3, не известная терапия может уменьшить это осложнение.
Использование кортикостероидов является одним из потенциальных лечения для предотвращения БЛД, потому что воспаление легких играет решающую роль в его патогенезе. Однако системная кортикостероидная терапия обычно не рекомендуется для недоношенных детей из-за долгосрочных побочных эффектов4,,5.
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) обладают плюрипотентными характеристиками и могут дифференцироваться в различные типы клеток, включая кости, хрящи, жировую ткань, мышцы и сухожилия6. MSCs имеют иммуномодуляторные, противовоспалительные и регенеративные эффекты7, и исследования на животных показывают терапевтические преимущества MSCs и их секретированные компоненты в гипероксии индуцированной травмы легких у грызунов8,9. Было показано, что внутритравмная и внутривенная трансплантация MSC защищает от неонатальной гипероксической травмы легких. Таким образом, интрарченое введение стволовых клеток и комбинированной сурфактантной и кортикостероидной терапии может быть потенциальной стратегией лечения новорожденных с респираторными расстройствами. Доклинические исследования использовали интратрахельная администрация стволовых клеток и адено-ассоциированного вируса у новорожденных крыс10,,11,,12. Однако пошаговая презентация методики и in vivo отслеживания пересаженных стволовых клеток недоступна. Новорожденная крыса подходит для изучения влияния интрачиального введения на недоношенных детей с дыхательной недостаточностью, потому что саккулярная стадия крысиного легкого при рождении эквивалентна стадии человеческого легкого в 26–28 неделях беременности13. Эффективный метод для введения в крысиную трахею имеет решающее значение для успешного распределения легких. Техника, представленная здесь, позволяет изучать интрарчеальное введение клеток и/или препаратов для лечения неонатальных легочных заболеваний с использованием крыс в качестве модели для человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эта процедура была одобрена Комитетом по уходу и использованию животных в Медицинском университете Тайбэя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Человеческие MSCs стабильно трансфицированы с зеленым флуоресцентным белком (GFP) и светлячок люциферазы генов (Fluc) были получены от коммерческой компании (Таблица материалов).
1. Характеристика человека MSCs с светлячок люцифераза и зеленый флуоресцентный белок
- Поддержание человека MSCs трансфицированы с GFP и Fluc в полном носителе (минимальный основной средний орел-альфа модификации "ЗМЭМ", дополненный 10'15% плода бычьей сыворотки "FBS", 2 мМ L-гл-гл, 1 нг / мЛ основные FGF, и PSF) при 37 С с насыщенной влажностью и 5% CO2. Проходных ячеек при слиянии на 70–90%.
- Наблюдайте MSCs под микроскопом контрастности фазы флуоресценции(Рисунок 1A)и проанализируйте уровни выражения Fluc и GFP14.
- Характеристика MSCs путем анализа выражения CD маркеров, включая CD44, CD73, CD90, CD105 с использованием потока цитометрии (Рисунок 1B). Индуцировать сортировку дифференциации стволовых клеток адипоцитов, хондроцитов и остеоцитов, и подтвердить дифференциацию сортировки (Рисунок 1C) фон Kossa, масло красный O, и Алкий синий окрашивания после коммерческого протокола15,16.
2. Анестезия крысиных щенков
- Разрешить время от беременных Sprague-Dawley крыс доставить вагинально на срок.
- Удалите крысиных щенков из клетки на послеродовой день 5.
- Обезболивать крысиных щенков с помощью газовой анестезии (т.е. 2% изофлурана) в анестезии камеры.
- Подтвердите адекватную анестезию, проверив дыхание и рефлексы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дыхание должно стать мелким и рефлексы должны уменьшаться. Крысиные щенки остаются без сознания, по крайней мере, 10 мин с этой концентрацией изофлурана.
3. Интрарчельная закапывание
- После анестезии, сдерживайте крысиных щенков на интубации стенд под углом на 60 "и держать щенков на месте с лабораторной маркировки ленты на всех четырех конечностей.
- Нанесите ленту под нос, чтобы зафиксировать голову и определить шею для прокола трахеотомии.
- Дезинфицировать область разреза (т.е. шею) с 75% спиртосодержащих подготовительных площадки.
- Сделайте 0,3 см вертикальный разрез шейки средней линии над трахеей с микросцисорами, чтобы избежать повреждения сонных артерий.
- Вскрыть жировые и мышечные слои прочь, чтобы найти трахею с изогнутыми кончиком конические пинцет без крючка.
- Держите трахею с изогнутым кончиком конические пинцеты.
- Держите шприц 100 МЛ в вертикальном положении и медленно впрыскивает 30 мл нормального солевого раствора (т.е. контроль) или 30 мл флюк-GFP с маркировкой MSCs (1 x 105 клеток) в трахею через 30 G иглы шприца во время инспираторной фазы.
- Закройте разрез одним шелковым стежком 6-0, завяжите узел как можно меньше и разрежьте концы как можно короче.
- Поместите крыс под инфракрасным светом или на грелку, чтобы согреться и позволить им оправиться от анестезии.
- Подтвердите, что крысы теплые, розовые и способные к спонтанному движению, прежде чем вернуть крыс в клетку.
4. Мониторинг легочного распределения MSCs
- Чтобы отследить пересаженные человека MSCs, интраперитонально вводить крыс с люцифериновой соли калия в фосфат буферного солевого раствора (PBS) в дозе 125 мг/кг массы тела 15 мин после инъекции MSC.
- Обезболивать крыс, используя 2% изофлуран через носовые конусы.
- Приобретайте последовательные изображения с интервалом 5-15 с интервалами 10 мин после введения люциферина со средним binning, 1 f/stop и 26-сантиметровым полем зрения с помощью системы визуализации малогоживотного (Таблица материалов).
- Количественная активность люминесценции из легких на основе автоматических областей интереса с помощью программного обеспечения для визуализации(Таблица материалов)17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Легочное распределение внутритравматизации стволовых клеток в термине неонатальных крыс было определено светлячок luciferase (Fluc)-маркированных стволовых клеток. MSCs были помечены Fluc и помечены зеленым флуоресцентным белком через лентивиральной трансдукции. Рисунок 1A демонстрирует высокий уровень экспрессии GFP в МЧС человека, и 93,7% населения показали положительное выражение GFP, обнаруженное цитометрией потока. MSCs были охарактеризованы путем анализа экспрессии CD маркеров (т.е., CD 44, CD73, CD90, и CD105) и возможности сортировки дифференциации в остеоциты, хондроциты, и адипоциты(Рисунок 1B, C). Для отслеживания пересаженных человеческих MSCs in vivo, люминесценция изображения крыс была выполнена с помощью малой животной системы визуализации. Измерения были проведены в желудочно. Крысы были зафиксированы клейкой лентой, а затем вводили интраперитонеальную инъекцию 30 мг/мЛ соли люциферина в PBS в дозе 125 мг/кг массы тела. Люцифераза сочетается с люциферином, кислородом и АТФ, и генерирует свет через химическую реакцию, в результате чего биолюминесценция18. Во время процедуры визуализации, крысы были анестезированы с помощью 2% изофлуран вводят через носовые конусы. Крыса изображения были приобретены 10 минут после администрации Luciferin. Последовательные изображения были приобретены с интервалом 5-15 с (без задержки времени) по крайней мере 1 мин, со средним binning, 1 f/stop, и 26 cm полем зрения. Используя данные измерений из последовательности спектральных изображений, отфильтрованных на разных длинах волн (560-660 нм), была определена глубина и расположение биолюминесцентного репортера. Сигналы люминесценции из легких рассчитывались на основе автоматических областей интереса в режиме выбора круга. Средняя интенсивность люминесценции у нормальных солево-обработанных животных была назначена величина одного, и данные по каждому обработанному МСЗ животным были нормализованы с данными нормальных солево-обработанных животных.
Рисунок 2A показывает репрезентативное изображение люминесценции в легких крыс. В легких, обработанных нормальным физраствором, люминесценции не наблюдалось. Крысы, обработанные MSCs выставлены люминесценции в трахеи и центральных областях легких. Количественная оценка интенсивности люминесценции показала, что крысы, обработанные MSCs, продемонстрировали примерно 13-кратное увеличение активности люминесценции, по сравнению с крысами, обработанными нормальным физраствором в одиночку(Рисунок 2B).
Рисунок 1: Характеристика человеческих MSCs.
(A) выражение GFP в человеческих MSCs после трансдукции лентивируса. (B) Выражение человека MSC-специфических CD маркеров (т.е., CD 44, CD73, CD90, CD105). (C) Trilineage дифференциации человека MSCs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Мониторинг легочного распределения люминесценции с использованием системы визуализации малого животного.
(A) Репрезентативное изображение легочного распределения помеченных MSCs у крыс. В области легких крыс, обработанных нормальным физраствором, не наблюдалось люминесценции. Крысы, обработанные человеческими МСК, выставляли люминесценцию в трахеи и легких. (B) Количественная оценка люминесценции активности в легких крыс (n No 4). Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение. Шкала фотонов/см2/srв оси Y. ЗП йтт; 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Новорожденные младенцы с дыхательной недостаточностью обычно требуют внутритравматового сурфактанта и/или кортикостероидного лечения19. Клинические испытания фазы I на людях продемонстрировали безопасность внутритравматических MSCs у недоношенных детей8. Эти исследования показывают, что интрарчеальное введение лекарств является важным вариантом для новорожденных с дыхательной недостаточностью. Исследования моделей животных являются наиболее полезными, если характеристики модели имеют непосредственное отношение к людям. Термин новорожденных крыс являются полезными моделями для преждевременной травмы легких и развития исследований. Тем не менее, верхние дыхательные пути неонатальных крыс слишком малы, чтобы позволить прямой трахеи интубации, как осуществляется у взрослых крыс20. Интрачехная закалотная закапывание через трахеотомию является осуществимым альтернативным методом интрахеального введения стволовых клеток или препаратов в легкие неонатальной крысы.
In vivo биолюминесценции изображений является ценным инструментом для in vitro и in vivo мониторинга судьбы пересаженных стволовых клеток, осуществляется путем маркировки клеток с составным выражением luciferase репортер белка21. Ферменты Люциферазы катализуют окисление субстрата (люциферина) и высвобождают свет как продукт реакции. Визуальная визуализация с помощью биолюминесценции позволяет проводить неинвазивный и в режиме реального времени анализ процессов заболевания в живых организмах. Биолюминесценция была использована для инво мониторинг миграции, выживания и морфологической дифференциации MSCs22. Это исследование оценивало распределение пересаженных стволовых клеток в легких с помощью системы визуализации in vivo. Биолюминесценция In vivo опирается на мониторинг частиц, содержащих клетки. Поскольку они могут быть фагоцитозы при смерти клеток, это может привести к отслеживанию макрофагов хозяина. Таким образом, люминесценция была измерена менее чем через 10 минут после введения люциферина.
Ограничение этого исследования заключается в том, что межанимальные изменения воспринимались в изображениях IVIS. Таким образом, сигналы люминесценции из легких были рассчитаны на основе автоматических областей интереса и нормализации средней интенсивности люминесценции до одного в нормальных солевой обработки животных.
Правильная и эффективная интрохельная закапывание имеет важное значение для оценки эффективности MSC у неонатальных крыс, но это может быть полезно для тестирования других лекарственных методов лечения, а также. Таким образом, эта крыса модель техника может быть регулируемым для различных легочных приложений. Внутричешное закаление стволовых клеток или лекарственных средств представляет собой относительно легкое и экономически эффективное лечение легочных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было частично поддержано грантом от Meridigen Biotech Co., Ltd. Тайбэй, Тайвань (A-109-008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
- Ramanathan, R., Bhatia, J. J., Sekar, K., Ernst, F. R. Mortality in preterm infants with respiratory distress syndrome treated with poractant alfa, calfactant or beractant: a retrospective study. Journal of Perinatology. 33, 119-125 (2013).
- Gien, J., Kinsella, J. P. Pathogenesis and treatment of bronchopulmonary dysplasia. Current Opinion in Pediatrics. 23, 305-313 (2011).
- Pasha, A. B., Chen, X. Q., Zhou, G. P. Bronchopulmonary dysplasia: Pathogenesis and treatment. Experimental and Therapeutic. 16, 4315-4321 (2018).
- Committee on Fetus and Newborn. Postnatal corticosteroids to treat or prevent chronic lung disease in preterm infants. Pediatrics. 109, 330-338 (2002).
- Watterberg, K. L. American Academy of Pediatrics; Committee on Fetus and Newborn. Policy statement-postnatal corticosteroids to prevent or treat bronchopulmonary dysplasia. Pediatrics. 126, 800-808 (2010).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)- dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (2), 42-49 (2009).
- Chou, H. C., Li, Y. T., Chen, C. M. Human mesenchymal stem cells attenuate experimental bronchopulmonary dysplasia induced by perinatal inflammation and hyperoxia. American Journal of Translational Research. 8, 342-353 (2016).
- Chen, C. M., Chou, H. C., Lin, W., Tseng, C. Surfactant effects on the viability and function of human mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo assessment. Stem Cell Research & Therapy. 8, 180 (2017).
- Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80, 415-424 (2016).
- Fleurence, E., et al. Comparative efficacy of intratracheal adeno-associated virus administration to newborn rats. Human Gene Therapy. 16, 1298-1306 (2005).
- Waszak, P., et al. Effect of intratracheal adenoviral vector administration on lung development in newborn rats. Human Gene Therapy. 13, 1873-1885 (2002).
- O'Reilly, M., Thébaud, B. Animal models of bronchopulmonary dysplasia. The term rat models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307, 948 (2014).
- Yu, J., et al. GFP labeling and hepatic differentiation potential of human placenta-derived mesenchymal stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 35, 2299-2308 (2015).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells. Stem Cells. 27, 126-137 (2009).
- Huang, L. T., et al. Effect of surfactant and budesonide on pulmonary distribution of fluorescent dye in mice. Pediatric and Neonatology. 56, 19-24 (2015).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18, 164-172 (2012).
- Yeh, T. F., et al. Intra-tracheal administration of budesonide/surfactant to prevent bronchopulmonary dysplasia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193, 86-95 (2016).
- Nguyen, J. Q., et al. Intratracheal inoculation of Fischer 344 rats with Francisella tularensis. Journal of Visualized Experiments. (127), e56123 (2017).
- de Almeida, P. E., van Rappard, J. R., Wu, J. C. In vivo bioluminescence for tracking cell fate and function. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 663-671 (2011).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49, 3-10 (2011).
