Summary
Se describe un protocolo para realizar el trasplante intratraqueal de células estromales mesenquimales (MSC) a través de la inyección intratraqueal en ratas neonatales. Esta técnica es una opción clínicamente viable para la administración de células madre y fármacos en pulmones de ratas neonatales para evaluar su eficacia.
Abstract
La exposición prolongada a altas concentraciones de oxígeno conduce a inflamación y lesión pulmonar aguda, que es similar a la displasia broncopulmonar humana (BPD). En bebés prematuros, la BPD es una complicación importante a pesar del uso temprano de la terapia con surfactantes, las estrategias óptimas de ventilación y la ventilación positiva de presión no invasiva. Debido a que la inflamación pulmonar desempeña un papel crucial en la patogénesis de la BPD, el uso de corticoesteroides es un tratamiento potencial para prevenirla. Sin embargo, el tratamiento sistémico con corticoesteroides no suele recomendarse para bebés prematuros debido a efectos adversos a largo plazo. Los estudios preclínicos y los ensayos clínicos de fase I en humanos demostraron que el uso de células estromales mesenquimales (MSC) en lesiones pulmonares inducidas por hiperoxia y en bebés prematuros es seguro y factible. Se ha demostrado que el trasplante intratraqueal e intravenoso de MSC protege contra la lesión pulmonar hiperóxica neonatal. Por lo tanto, la administración intratraqueal de células madre y el tratamiento combinado de tensioactivos y glucocorticoides ha surgido como una nueva estrategia para tratar a los recién nacidos con trastornos respiratorios. La etapa de desarrollo de los pulmones de rata al nacer es equivalente a la de los pulmones humanos a las 26 a 28 semanas de gestación. Por lo tanto, las ratas recién nacidas son apropiadas para estudiar la administración intratraqueal a bebés prematuros con dificultad respiratoria para evaluar su eficacia. Esta técnica de instilación intratraqueal es una opción clínicamente viable para la administración de células madre y fármacos a los pulmones.
Introduction
A menudo se requiere oxígeno suplementario para tratar a los recién nacidos con dificultad respiratoria1. Sin embargo, la terapia con hiperoxia en lactantes tiene efectos adversos a largo plazo. La exposición prolongada a altas concentraciones de oxígeno conduce a inflamación y lesión pulmonar aguda, que es similar a la displasia broncopulmonar humana (BPD)2. La BPD es una complicación importante del tratamiento con hiperoxia que puede ocurrir a pesar de la terapia con surfactantes tempranos, los procedimientos óptimos de ventilación y el aumento del uso de ventilación por presión positiva no invasiva en bebés prematuros. Si bien se han notificado muchas estrategias de tratamiento para la BPD3,ninguna terapia conocida puede reducir esta complicación.
El uso de corticoesteroides es un tratamiento potencial para prevenir la BPD, porque la inflamación pulmonar juega un papel crucial en su patogénesis. Sin embargo, el tratamiento sistémico con corticoesteroides no suele recomendarse en bebés prematuros debido a los efectos adversos a largo plazo4,,5.
Las células estromales mesenquimales (MSC) tienen características pluripotentes y pueden diferenciarse en varios tipos de células, incluyendo hueso, cartílago, tejido adiposo, músculo y tendones6. Los MSC tienen efectos inmunomoduladores, antiinflamatorios y regenerativos7,y los estudios en animales muestran los beneficios terapéuticos de las MSC y sus componentes secretados en la lesión pulmonar inducida por hiperoxia en roedores8,,9. Se ha demostrado que el trasplante intratraqueal e intravenoso de MSC protege contra la lesión pulmonar hiperóxica neonatal. Por lo tanto, la administración intratraqueal de células madre y la terapia combinada de tensioactivos y corticoesteroides podrían ser una posible estrategia de tratamiento para tratar a los recién nacidos con trastornos respiratorios. Los estudios preclínicos han utilizado la administración intratraqueal de células madre y virus adeno-asociados en ratas recién nacidas10,11,12. Sin embargo, no se dispone de una presentación paso a paso de la técnica y el seguimiento in vivo de las células madre trasplantadas. La rata recién nacida es adecuada para estudiar los efectos de la administración intratraqueal en bebés prematuros con dificultad respiratoria porque la etapa saccular del pulmón de la rata al nacer es equivalente a la del pulmón humano a las 26-28 semanas de gestación13. Un método eficaz para la administración en la tráquea de rata es crucial para una distribución pulmonar exitosa. La técnica presentada aquí permite el estudio de la administración intratraqueal de células y/o fármacos para el tratamiento de enfermedades pulmonares neonatales utilizando ratas como modelo para humanos.
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Protocol
Este procedimiento fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Taipei.
NOTA: Los MSC humanos transfectados de forma estable con proteína fluorescente verde (GFP) y genes de la luciasa de luciélula (Fluc) se obtuvieron de una empresa comercial (Tabla de Materiales).
1. Caracterización de MSC humanos con luciosa de luciélub contra incendios y proteína fluorescente verde
- Mantener los MSC humanos transfectados con GFP y Fluc en medios completos (mínimo esencial medio de modificación de águila-alfa [-MEM], complementado con 10-15% de suero bovino fetal [FBS], 2 mM de L-glutamina, ng/mL de FGF básico, y PSF) a 37 oC con humedad saturada y 5% de CO2. Células de paso a una confluencia de 70 x 90 %.
- Observe los MSC bajo un microscopio de contraste de fase de fluorescencia (Figura 1A) y analice los niveles de expresión de Fluc y GFP14.
- Caracterice a los MSC mediante el análisis de la expresión de marcadores de CD, incluidos CD44, CD73, CD90, CD105 mediante la citometría de flujo (Figura 1B). Inducir la diferenciación del trilineage de las células madre a adipocitos, condrocitos y osteocitos, y confirmar la diferenciación del trilineage (Figura 1C) por von Kossa, aceite rojo O, y tinción azul alcian siguiendo un protocolo comercial15,16.
2. Anestesización de cachorros de rata
- Permita que las ratas Sprague-Dawley embarazadas con fecha de tiempo de parto den a luz vaginalmente a término.
- Retire a los cachorros de rata de la jaula el día 5 postnatal.
- Anestesiar a los cachorros de rata usando anestesia de gas (es decir, 2% isoflurano) en una cámara de anestesia.
- Confirme la anestesia adecuada comprobando la respiración y los reflejos.
NOTA: La respiración debe volverse superficial y los reflejos deben disminuir. Los cachorros de rata permanecen inconscientes durante al menos 10 minutos con esta concentración de isoflurano.
3. Instilación intratraqueal
- Una vez anestesiados, sostenga a los cachorros de rata en un soporte de intubación en ángulo a 60o y sostenga a los cachorros en su lugar con cinta adhesiva de laboratorio en las cuatro extremidades.
- Aplique cinta adhesiva debajo de la nariz para fijar la cabeza y localizar el cuello para la traqueotomía punzante.
- Desinfectar el área de incisión (es decir, cuello) con una almohadilla de preparación de alcohol del 75%.
- Haga una incisión vertical del cuello medio por encima de la tráquea con microscisores para evitar dañar las arterias carótidas.
- Disecciona las capas de grasa y músculo para localizar la tráquea con pinzas cónicas con punta curva sin gancho.
- Sostenga la tráquea con las pinzas cónicas de punta curvadas.
- Sostenga una jeringa de 100 l en posición vertical e inyecte lentamente 30 ml de solución salina normal (es decir, control) o 30 ml de MSC etiquetados con Fluc-GFP (1 x 105 células) en la tráquea a través de una jeringa de aguja de 30 G durante la fase inspiratoria.
- Cierre la incisión con una puntada de seda 6-0, ate el nudo lo más pequeño posible y corte los extremos lo más cortos posible.
- Coloque las ratas bajo luz infrarroja o sobre una almohadilla de calentamiento para mantenerlas calientes y permitir que se recuperen de la anestesia.
- Confirme que las ratas son cálidas, rosadas y capaces de movimiento espontáneo antes de devolver las ratas a la jaula.
4. Monitoreo de la distribución pulmonar de los MSC
- Para realizar un seguimiento de los MSC humanos trasplantados, inyectar por vía intraperitoneal a las ratas sal de potasio de luciferina en solución salina tamponada de fosfato (PBS) a una dosis de 125 mg/kg de peso corporal 15 minutos después de la inyección de MSC.
- Anesthetizar las ratas usando 2% isoflurano a través de los conos nasales.
- Adquirir imágenes secuenciales a intervalos de 5-15 s 10 min después de la administración de luciferina con binning medio, 1 f/stop, y un campo de visión de 26 cm utilizando un sistema de imágenes de animales pequeños (Tabla de materiales).
- Cuantificar la actividad de luminiscencia de los pulmones en función de las regiones automáticas de interés utilizando software de imagen (Tabla de materiales)17.
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Representative Results
La distribución pulmonar de la instilación intratraqueal de las células madre en el término ratas neonatales se determinó por células madre etiquetadas con foufa luciferasa (Fluc). Los MSC fueron etiquetados con Fluc y etiquetados con proteína fluorescente verde a través de transducción lentiviral. La Figura 1A muestra un alto nivel de expresión de la GFP en los MSC humanos, y el 93,7% de la población mostró la expresión positiva de la GFP detectada por la citometría de flujo. Los MSC se caracterizaron por analizar la expresión de marcadores de CD (es decir, CD 44, CD73, CD90 y CD105) y la capacidad de diferenciación de trilineación en osteocitos, condrocitos y adipocitos (Figura 1B,C). Para rastrear los MSC humanos trasplantados in vivo, se realizaron imágenes de luminiscencia de las ratas utilizando un sistema de imágenes de animales pequeños. Las mediciones fueron tomadas ventralmente. Las ratas se fijaron con cinta adhesiva y posteriormente se administró una inyección intraperitoneal de 30 mg/ml de sal de potasio de luciferina en PBS a una dosis de 125 mg/kg de peso corporal. Luciferase se combina con luciferina, oxígeno y ATP, y genera luz a través de una reacción química, lo que resulta en bioluminiscencia18. Durante el procedimiento de diagnóstico por imágenes, las ratas fueron anestesiadas usando 2% de isoflurano administrado a través de conos nasales. Las imágenes de ratas se adquirieron 10 minutos después de la administración de Luciferin. Las imágenes secuenciales se adquirieron a intervalos de 5 a 15 s (sin retardo de tiempo) durante al menos 1 min, con binning medio, 1 f/stop y un campo de visión de 26 cm. Utilizando datos de medición de una secuencia de imágenes espectrales filtradas a diferentes longitudes de onda (560–660 nm), se determinó la profundidad y la ubicación del reportero bioluminiscente. Las señales de luminiscencia de los pulmones se calcularon en función de las regiones automáticas de interés en el modo de selección de círculos. A la intensidad media de luminiscencia en animales tratados con solución salina normal se le asignó un valor de uno, y los datos de cada animal tratado con MSC se normalizaron a los de los animales tratados con solución salina normales.
La Figura 2A muestra una imagen representativa de la luminiscencia en los pulmones de las ratas. No se observó luminiscencia en las regiones pulmonares de las ratas tratadas con solución salina normal. Las ratas tratadas con MSC mostraron luminiscencia en las regiones de la tráquea y del pulmón central. La cuantificación de la intensidad de luminiscencia reveló que las ratas tratadas con MSC presentaban un aumento de aproximadamente 13 veces la actividad de luminiscencia, en comparación con las ratas tratadas con solución salina normal solamente(Figura 2B).
Figura 1: Caracterización de los MSC humanos.
(A) expresión de GFP en MSC humanos después de la transducción de lentivirus. (B) Expresión de marcadores de CD específicos de MSC humanos (es decir, CD 44, CD73, CD90, CD105). (C) Diferenciación de trilines de los MSC humanos. Please click here to view a larger version of this figure.
Figura 2: Monitoreo de la distribución pulmonar de la luminiscencia utilizando un sistema de imágenes de animales pequeños.
(A) Una imagen representativa de la distribución pulmonar de los MSC etiquetados en ratas. No se observó luminiscencia en la región pulmonar de ratas tratadas con solución salina normal. Las ratas tratadas con MSC humanos mostraron luminiscencia en las regiones traqueal y pulmonar. (B) Cuantificación de la actividad de luminiscencia en los pulmones de rata (n s 4). Las barras de error representan la desviación estándar. La escala es fotónicos/s/cm2/sr en el eje Y. **P < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los recién nacidos con dificultad respiratoria suelen requerir tensioactivos intratraqueales y/o tratamiento con corticoesteroides19. Los ensayos clínicos de fase I en humanos han demostrado la seguridad de los MSC intratraqueales en bebés prematuros8. Estos estudios sugieren que la administración intratraqueal de medicamentos es una opción importante para los recién nacidos con dificultad respiratoria. Los estudios de modelos en animales son más útiles si las características del modelo son directamente pertinentes para los seres humanos. Las ratas recién nacidas son modelos útiles para los estudios de desarrollo y lesiones pulmonares prematuros. Sin embargo, la vía aérea superior de las ratas neonatales es demasiado pequeña para permitir la intubación traqueal directa como se realiza en ratas adultas20. La instilación intratraqueal a través de la traqueotomía es una técnica alternativa factible para la administración intratraqueal de células madre o fármacos a los pulmones de ratas.
La bioluminiscencia in vivo es una herramienta valiosa para el seguimiento in vitro e in vivo del destino de la célula madre trasplantada, lograda mediante el etiquetado de células con la expresión constitutiva de una proteína de reportero luciferasa21. Las enzimas Luciferase catalizan la oxidación de un sustrato (luciferina), y liberan la luz como producto de la reacción. La imagen visual a través de la bioluminiscencia permite un análisis no invasivo y en tiempo real de los procesos de la enfermedad en organismos vivos. Las imágenes de bioluminiscencia se utilizaron para el seguimiento in vivo de la migración, la supervivencia y la diferenciación morfológica de los MSC22. Este estudio evaluó la distribución de las células madre trasplantadas en los pulmones utilizando un sistema de imágenes in vivo. Las imágenes de bioluminiscencia in vivo se basan en la monitorización de partículas contenidas en células. Debido a que estos pueden ser fagocitosos al morir de la célula, podría conducir al rastreo de los macrófagos anfitriones. Por lo tanto, la luminiscencia se midió menos de 10 minutos después de la administración de Luciferin.
La limitación de este estudio es que la variación interanimal se percibió en las imágenes del IVIS. Por lo tanto, las señales de luminiscencia de los pulmones se calcularon sobre la base de las regiones automáticas de interés y normalizando la intensidad media de luminiscencia a una en animales tratados con solución salina normal.
La instilación intratraqueal correcta y eficaz es esencial para la evaluación de la eficacia de la MSC en las ratas neonatales, pero también puede ser útil para probar otros tratamientos medicinales. Por lo tanto, esta técnica de modelo de rata puede ser ajustable a una variedad de aplicaciones pulmonares. La instilación intratraqueal de células madre o medicamentos representa un tratamiento relativamente fácil y rentable de las enfermedades pulmonares.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado en parte por una subvención de Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwán (A-109-008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
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