Summary
Descrito é um protocolo para a realização de transplante intratraqueal de células estromais mesenquimais (MSCs) através de injeção intratraqueal a termo ratos neonatais. Esta técnica é uma opção clinicamente viável para a entrega de células-tronco e drogas em pulmões de ratos neonatais para avaliar sua eficácia.
Abstract
A exposição prolongada a altas concentrações de oxigênio leva a inflamação e lesão pulmonar aguda, que é semelhante à displasia broncopulmonar humana (BPD). Em bebês prematuros, a DBP é uma complicação importante, apesar do uso precoce da terapia surfactante, estratégias ideais de ventilação e ventilação positiva não invasiva. Como a inflamação pulmonar desempenha um papel crucial na patogênese do BPD, o uso de corticosteroides é um tratamento potencial para preveni-la. No entanto, o tratamento corticosteroide sistêmico não é geralmente recomendado para bebês prematuros devido a efeitos adversos a longo prazo. Estudos pré-clínicos e ensaios clínicos da fase I em humanos demonstraram que o uso de células estromais mesenquimais (MSCs) em lesões pulmonares induzidas por hiperoxia e em bebês prematuros é seguro e viável. O transplante de MSC intratraqueal e intravenoso tem sido demonstrado para proteger contra lesões pulmonares hiperóxicas neonatais. Portanto, a administração intratraqueal de células-tronco e o tratamento combinado de surfactante e glicocorticoide surgiu como uma nova estratégia para tratar recém-nascidos com distúrbios respiratórios. O estágio de desenvolvimento dos pulmões de ratos ao nascer é equivalente ao dos pulmões humanos em 26-28 semanas de gestação. Assim, os ratos recém-nascidos são apropriados para estudar a administração intratraqueal para bebês prematuros com dificuldade respiratória para avaliar sua eficácia. Esta técnica de instilação intratraqueal é uma opção clinicamente viável para a entrega de células-tronco e drogas nos pulmões.
Introduction
O oxigênio suplementar é frequentemente necessário para tratar recém-nascidos com problemas respiratórios1. No entanto, a hiperoxiaterapia em bebês tem efeitos adversos a longo prazo. Exposição prolongada a altas concentrações de oxigênio leva a inflamação e lesão pulmonar aguda, semelhante à displasia broncopulmonar humana (BPD)2. A DBP é uma complicação importante do tratamento da hiperoxia que pode ocorrer apesar da terapia surfactante precoce, procedimentos de ventilação ideais e aumento do uso de ventilação de pressão positiva não invasiva em bebês prematuros. Embora muitas estratégias de tratamento tenham sido relatadas para o BPD3,nenhuma terapia conhecida pode reduzir essa complicação.
O uso de corticosteroides é um tratamento potencial para prevenir a DBP, pois a inflamação pulmonar desempenha um papel crucial em sua patogênese. No entanto, a terapia corticosteroide sistêmica não é geralmente recomendada para bebês prematuros devido aos efeitos adversos de longo prazo4,,5.
As células estromamicanas mesenquimais (MSCs) possuem características pluripotentes e podem se diferenciar em vários tipos celulares, incluindo osso, cartilagem, tecido adiposo, músculo e tendões6. Os MSCs têm efeitos imunológicos, anti-inflamatórios e regenerativos7, e estudos em animais mostram os benefícios terapêuticos dos MSCs e seus componentes secretados em lesões pulmonares induzidas por hiperoxia em roedores8,,9. O transplante de MSC intratraqueal e intravenoso tem sido demonstrado para proteger contra lesões pulmonares hiperóxicas neonatais. Portanto, a administração intratraqueal de células-tronco e a terapia combinada de surfactante e corticosteroide podem ser uma estratégia de tratamento potencial para tratar recém-nascidos com distúrbios respiratórios. Estudos pré-clínicos têm utilizado administração intratraqueal de células-tronco e vírus associado ao adeno em ratos recém-nascidos10,,11,,12. No entanto, não está disponível uma apresentação passo a passo da técnica e o rastreamento in vivo das células-tronco transplantadas. O rato recém-nascido é apropriado para estudar os efeitos da administração intratraqueal em bebês prematuros com dificuldade respiratória porque o estágio saccular do pulmão de rato ao nascer é equivalente ao do pulmão humano em 26-28 semanas de gestação13. Um método eficaz de administração na traqueia de ratos é crucial para uma distribuição pulmonar bem sucedida. A técnica aqui apresentada permite o estudo da administração intratraqueal de células e/ou medicamentos para o tratamento de doenças pulmonares neonatais utilizando ratos como modelo para humanos.
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Protocol
Este procedimento foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Taipei.
NOTA: Os MSCs humanos foram transfectados com proteína fluorescente verde (GFP) e genes de luciferase de vagalume (Fluc) de uma empresa comercial(Tabela de Materiais).
1. Caracterização de MSCs humanos com luciferase de vagalume e proteína fluorescente verde
- Manter os MSCs humanos transfeinados com GFP e Fluc em mídia completa (modificação média-alfa média mínima essencial [αMEM], suplementado com soro bovino fetal de 10-15%, 2 mM L-glutamina, 1ng/mL básico FGF e PSF) a 37 °C com umidade saturada e 5% CO2. Células de passagem a ~70-90% de confluência.
- Observe os MSCs sob um microscópio de contraste de fase fluorescência(Figura 1A) e analise os níveis de expressão de Fluc e GFP14.
- Caracterize os MSCs analisando a expressão de marcadores de CD incluindo CD44, CD73, CD90, CD105 utilizando citometria de fluxo (Figura 1B). Induzir a diferenciação trilineagem de células-tronco a adipócitos, condrócitos e osteocitos, e confirmar a diferenciação de trilineagem(Figura 1C) por von Kossa, óleo vermelho O e manchas azuis alcianas seguindo um protocolo comercial15,,16.
2. Anesthetização de filhotes de rato
- Permita que ratos de Sprague-Dawley, datados do tempo, entreguem vaginalmente a termo.
- Remova os filhotes de rato da gaiola no pós-natal dia 5.
- Anestesia os filhotes de rato usando anestesia gasosa (ou seja, 2% isoflurane) em uma câmara de anestesia.
- Confirme a anestesia adequada verificando a respiração e os reflexos.
NOTA: A respiração deve se tornar superficial e os reflexos devem diminuir. Filhotes de rato permanecem inconscientes por pelo menos ~10 minutos com esta concentração de isoflurane.
3. Instilação intratraqueal
- Uma vez anestesiados, contenha os filhotes de rato em uma entubação em ângulo de ~60° e segure os filhotes no lugar com fita de rotulagem de laboratório nos quatro membros.
- Aplique fita abaixo do nariz para fixar a cabeça e identificar o pescoço para perfurar a traqueotomia.
- Desinfete a área de incisão (ou seja, pescoço) com uma almofada de preparação de 75% de álcool.
- Faça uma incisão vertical de 0,3 cm do pescoço médio acima da traqueia com microscisores para evitar danificar as artérias carótidas.
- Disseque as camadas de gordura e músculo para localizar a traqueia com pinças afiladas de ponta curva sem gancho.
- Segure a traqueia com a pinça afilada de ponta curva.
- Segure uma seringa de 100 μL ereto e injete lentamente 30 μL de soro fisiológico normal (ou seja, controle) ou 30 μL de MSCs rotulados fluc-GFP (1 x 105 células) na traqueia através de uma seringa de agulha de 30 G durante a fase inspiratória.
- Feche a incisão com um ponto de seda 6-0, amarre o nó o menor possível e corte as extremidades o mais curto possível.
- Coloque os ratos sob luz infravermelha ou em uma almofada de aquecimento para se manterem aquecidos e permitir que eles se recuperem da anestesia.
- Confirme se os ratos são quentes, rosados e capazes de movimento espontâneo antes de devolver os ratos à gaiola.
4. Monitorando a distribuição pulmonar de MSCs
- Para rastrear os MSCs humanos transplantados, injete intraperitoneally os ratos com sal de potássio de luciferina em soro fisco tamponado de fosfato (PBS) a uma dose de 125 mg/kg de peso corporal 15 min após a injeção de MSC.
- Anestesiar os ratos usando 2% de isoflurane através de cones de nariz.
- Adquira imagens sequenciais em intervalos de 5 a 15 s 10 min após a administração da luciferina com binning médio, 1 f/stop e um campo de visão de 26 cm utilizando um sistema de imagem de pequenos animais(Tabela de Materiais).
- Quantifique a atividade de luminescência dos pulmões com base nas regiões automáticas de interesse utilizando software de imagem (Tabela de Materiais)17.
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Representative Results
A distribuição pulmonar da instilação intratraqueal de células-tronco no termo ratos neonatais foi determinada por células-tronco rotuladas por vagalume (Fluc). Os MSCs foram rotulados com Fluc e marcados com proteína fluorescente verde através da transdução lentiviral. A Figura 1A demonstra um alto nível de expressão de GFP em MSCs humanas, e 93,7% da população apresentou expressão positiva de GFP detectada pela citometria de fluxo. Os MSCs caracterizaram-se pela análise da expressão de marcadores de CD (ou seja, CD 44, CD73, CD90 e CD105) e pela capacidade de diferenciação de trilineagem em osteocitos, condrócitos e adipócitos(Figura 1B,C). Para rastrear os MSCs humanos transplantados in vivo, a imagem de luminescência dos ratos foi realizada utilizando um sistema de imagem de pequenos animais. As medidas foram tomadas ventricamente. Os ratos foram fixados com fita adesiva e, posteriormente, foi administrada uma injeção intraperitoneal de 30 mg/mL de sal de potássio de luciferina em PBS a uma dose de 125 mg/kg de peso corporal. A luciferase combina com luciferina, oxigênio e ATP, e gera luz através de uma reação química, resultando em bioluminescência188. Durante o procedimento de imagem, os ratos foram anestesiados usando 2% de isoflurane administrado através de cones de nariz. Imagens de ratos foram adquiridas 10 minutos após a administração da luciferina. As imagens sequenciais foram adquiridas em intervalos de 5 a 15 s (sem atraso de tempo) por pelo menos 1 min, com binning médio, 1 f/stop e um campo de visão de 26 cm. Usando dados de medição de uma sequência de imagens espectrais filtradas em diferentes comprimentos de onda (560-660 nm), a profundidade e localização do repórter bioluminescente foi determinada. Os sinais de luminescência dos pulmões foram calculados com base nas regiões automáticas de interesse no modo de seleção do círculo. A intensidade média de luminescência em animais tratados com soro fisiológico normal foi atribuída a um valor de um, e os dados de cada animal tratado de MSC foram normalizados para os animais tratados com soro fisiológico normal.
A Figura 2A mostra uma imagem representativa de luminescência nos pulmões dos ratos. Não foi observada luminescência nas regiões pulmonares dos ratos tratados com soro fisiológico normal. Os ratos tratados com MSCs apresentaram luminescência nas regiões traqueia e pulmão central. A quantificação da intensidade de luminescência revelou que os ratos tratados com MSCs apresentaram um aumento de aproximadamente 13 vezes na atividade de luminescência, em comparação com os ratos tratados apenas com soro fisiológico normal(Figura 2B).
Figura 1: Caracterização de MSCs humanos.
(A) Expressão GFP em MSCs humanos após a transdução de lentivírus. (B) Expressão de marcadores de CD específicos do MSC humano (ou seja, CD 44, CD73, CD90, CD105). (C) Diferenciação trilineagem dos MSCs humanos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Monitoramento da distribuição pulmonar da luminescência utilizando um sistema de imagem de animais pequenos.
(A) Uma imagem representativa da distribuição pulmonar dos MSCs rotulados em ratos. Não foi observada luminescência na região pulmonar de ratos tratados com soro fisiológico normal. Ratos tratados com MSCs humanos apresentaram luminescência nas regiões traqueia e pulmão. (B) Quantificação da atividade de luminescência nos pulmões dos ratos (n = 4). As barras de erro representam desvio padrão. A escala é de fótons/s/cm2/sr no eixo Y. **P < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Recém-nascidos com problemas respiratórios comumente requerem surfactante intratraqueal e/ou tratamento corticosteroide199. Ensaios clínicos da fase I humana demonstraram a segurança dos MSCs intratraqueais em bebês prematuros8. Esses estudos sugerem que a administração intratraqueal de medicamentos é uma opção importante para recém-nascidos com dificuldade respiratória. Estudos de modelos animais são mais úteis se as características do modelo forem diretamente pertinentes aos seres humanos. Os ratos recém-nascidos são modelos úteis para lesões pulmonares pré-termo e estudos de desenvolvimento. No entanto, as vias aéreas superiores dos ratos neonatais são muito pequenas para permitir a intubação traqueal direta como realizada em ratos adultos20. A instilação intratraqueal através da traqueotomia é uma técnica alternativa viável para a administração intratraqueal de células-tronco ou drogas para os pulmões de ratos neonatais.
A imagem de bioluminescência in vivo é uma ferramenta valiosa para o monitoramento in vitro e in vivo do destino da célula-tronco transplantada, realizada pela rotulagem de células com a expressão constitutiva de uma proteína repórter luciferase21. Enzimas de luciferase catalisam a oxidação de um substrato (luciferina), e liberam luz como produto da reação. A imagem visual através da bioluminescência permite uma análise não invasiva e em tempo real dos processos da doença em organismos vivos. A bioluminescência foi utilizada para monitoramento in vivo da migração, sobrevivência e diferenciação morfológica dos MSCs22. Este estudo avaliou a distribuição das células-tronco transplantadas nos pulmões utilizando um sistema de imagem in vivo. A imagem de bioluminescência in vivo conta com o monitoramento de partículas contidas em células. Como estes podem ser fagocitados após a morte celular, pode levar ao rastreamento de macrófagos hospedeiros. Portanto, a luminescência foi medida menos de 10 minutos após a administração da luciferina.
A limitação deste estudo é que a variação interanimal foi percebida nas imagens do IVIS. Assim, os sinais de luminescência dos pulmões foram calculados com base nas regiões automáticas de interesse e normalizando a intensidade média de luminescência para um em animais tratados com soro fisiológico normal.
A instilação intratraqueal correta e eficaz é essencial para a avaliação da eficácia da MSC nos ratos neonatais, mas pode ser útil para testar outros tratamentos medicinais também. Assim, esta técnica de modelo de rato pode ser ajustável a uma variedade de aplicações pulmonares. A instilação intratraqueal de células-tronco ou medicamentos representa um tratamento relativamente fácil e econômico de doenças pulmonares.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi parcialmente apoiado por uma subvenção da Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan (A-109-008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
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