Summary
Beschreven is een protocol voor het uitvoeren van intratracheale transplantatie van mesenchymale stromale cellen (MSC's) door intratracheale injectie in term neonatale ratten. Deze techniek is een klinisch haalbare optie voor de levering van stamcellen en geneesmiddelen in neonatale rattenlongen om hun werkzaamheid te evalueren.
Abstract
Langdurige blootstelling aan hoge concentraties zuurstof leidt tot ontsteking en acute longletsel, die vergelijkbaar is met menselijke bronchopulmonale dysplasie (BPS). Bij premature baby's is BPD een belangrijke complicatie ondanks het vroege gebruik van oppervlakteactieve therapie, optimale ventilatiestrategieën en niet-invasieve positieve drukventilatie. Omdat longontsteking een cruciale rol speelt in de pathogenese van BPD, corticosteroïdengebruik is een potentiële behandeling om het te voorkomen. Niettemin wordt systemische corticosteroïdenbehandeling meestal niet aanbevolen voor te vroeg geboren baby's als gevolg van langdurige bijwerkingen. Preklinische studies en klinische studies van de menselijke fase I toonden aan dat het gebruik van mesenchymale stromale cellen (MSC's) in door hyperoxie veroorzaakte longletsels en bij te vroeg geboren zuigelingen veilig en haalbaar is. Intratracheale en intraveneuze MSC-transplantatie is aangetoond te beschermen tegen neonatale hyperoxische longletsel. Daarom is intratracheale toediening van stamcellen en gecombineerde oppervlakteactieve en glucocorticoïde behandeling naar voren gekomen als een nieuwe strategie voor de behandeling van pasgeborenen met ademhalingsstoornissen. Het ontwikkelingsstadium van rattenlongen bij de geboorte is gelijk aan die in menselijke longen bij 26−28 week van de zwangerschap. Vandaar, pasgeboren ratten zijn geschikt voor het bestuderen van intratracheale toediening aan premature baby's met ademhalingsproblemen om de werkzaamheid ervan te evalueren. Deze intratracheale instillatietechniek is een klinisch haalbare optie voor de levering van stamcellen en geneesmiddelen in de longen.
Introduction
Aanvullende zuurstof is vaak nodig om pasgeboren baby's te behandelen met ademhalingsproblemen1. Hyperoxietherapie bij zuigelingen heeft echter negatieve langetermijneffecten. Langdurige blootstelling aan hoge concentraties zuurstof leidt tot ontsteking en acute longletsel, die vergelijkbaar is met menselijke bronchopulmonale dysplasie (BPD)2. BPD is een belangrijke complicatie van hyperoxiebehandeling die kan optreden ondanks vroege oppervlakteactieve therapie, optimale ventilatieprocedures en toenemend gebruik van niet-invasieve positieve drukventilatie bij premature baby's. Hoewel veel behandelingsstrategieën zijn gemeld voor BPD3,kan geen bekende therapie deze complicatie verminderen.
Corticosteroïdengebruik is een mogelijke behandeling om BPD te voorkomen, omdat longontsteking een cruciale rol speelt in de pathogenese. Systemische corticosteroïdentherapie wordt echter meestal niet aanbevolen voor te vroeg geboren baby's vanwege bijwerkingen op lange termijn4,5.
Mesenchymale stromale cellen (MSCs) hebben pluripotente kenmerken en kunnen zich onderscheiden in verschillende celtypen, waaronder bot, kraakbeen, vetweefsel, spieren en pezen6. MSC's hebben immunomodulerende, ontstekingsremmende en regeneratieve effecten7, en dierstudies tonen de therapeutische voordelen van MSC's en hun uitgescheiden componenten in hyperoxie-geïnduceerde longletsel bij knaagdieren8,9. Intratracheale en intraveneuze MSC-transplantatie is aangetoond te beschermen tegen neonatale hyperoxische longletsel. Daarom kan intratracheale toediening van stamcellen en gecombineerde oppervlakteactieve en corticosteroïde therapie een potentiële behandelingsstrategie zijn voor de behandeling van pasgeborenen met ademhalingsstoornissen. Preklinische studies hebben gebruik gemaakt van intratracheale toediening van stamcellen en adeno-geassocieerd virus bij pasgeboren ratten10,11,12. Een stapsgewijze presentatie van de techniek en in vivo tracking van de getransplanteerde stamcellen is echter niet beschikbaar. De pasgeboren rat is geschikt voor het bestuderen van de effecten van intratracheale toediening op te vroeg geborene zuigelingen met ademhalingsproblemen, omdat het sacculaire stadium van de rattenlong bij de geboorte gelijk is aan die van de menselijke long bij 26−28 week van de zwangerschap13. Een effectieve methode voor toediening in de rattenpijp is cruciaal voor een succesvolle longdistributie. De hier gepresenteerde techniek maakt het mogelijk om intratracheale toediening van cellen en/of geneesmiddelen te bestuderen voor de behandeling van neonatale longziekten met ratten als model voor de mens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze procedure werd goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de Taipei Medical University.
OPMERKING: Menselijke MSC's met groene fluorescerende eiwitten (GFP) en firefly luciferase genen (Fluc) werden verkregen van een commercieel bedrijf (Table of Materials).
1. Karakterisering van menselijke MSCs met vuurvlieg luciferase en groen fluorescerend eiwit
- Houd menselijke MSC's in volledige media (minimale essentiële medium eagle-alpha modificatie [αMEM], aangevuld met 10−15% foetale runderserum [FBS], 2 mM L-glutamine, 1 ng/mL basisFGF en PSF) bij 37 °C met verzadigde vochtigheid en 5% CO2. Passagecellen bij ~70−90% samenvloeiing.
- Observeer MSC's onder een fluorescentiefasecontrastmicroscoop(figuur 1A)en analyseer de expressieniveaus van Fluc en GFP14.
- Karakteriseer de MMC's door de expressie van cd-markers te analyseren, waaronder CD44, CD73, CD90, CD105 met behulp van flow cytometrie (Figuur 1B). Induceer trilineage differentiatie van stamcellen tot adipocyten, chondrocyten en osteocyten, en bevestig trilineage differentiatie (Figuur 1C) door von Kossa, olie rode O, en Alcian blauwe vlekken volgens een commercieel protocol15,16.
2. Verdoving van rattenpups
- Laat tijd-gedateerde zwangere Sprague-Dawley ratten om vaginaal te leveren op termijn.
- Haal de rattenpups uit de kooi op postnatale dag 5.
- Verdoes de rattenpups met behulp van gasverdoving (d.w.z. 2% isoflurane) in een anesthesiekamer.
- Bevestig voldoende anesthesie door ademhaling en reflexen te controleren.
OPMERKING: De ademhaling moet ondiep worden en reflexen moeten afnemen. Rattenpups blijven minstens ~10 min bewusteloos met deze isofluraneconcentratie.
3. Intratracheale instillatie
- Eenmaal verdoofd, beperk de rattenpups op een intubatiestand schuin op ~ 60° en houd pups op hun plaats met laboratoriumlabeltape op alle vier de ledematen.
- Breng tape onder de neus om het hoofd vast te stellen en lokaliseren van de nek voor punctie tracheotomie.
- Desinfecteer het incisiegebied (d.w.z. nek) met een 75% alcoholpre prep pad.
- Maak een verticale middellijn neck incisie van 0,3 cm boven de luchtpijp met microscissors om beschadiging van de halsslagaders te voorkomen.
- Ontleden het vet en spier lagen weg om de luchtpijp te lokaliseren met gebogen tip taps toelopende pincet zonder haak.
- Houd de luchtpijp vast met de gebogen punt taps toelopende pincet.
- Houd een 100 μL spuit rechtop en injecteer langzaam 30 μL normale zoutoplossing (d.w.z. besturing) of 30 μL Fluc-GFP gelabelde MSCs (1 x 105 cellen) in de luchtpijp via een 30 G naaldspuit tijdens de inspiratoire fase.
- Sluit de incisie met een 6-0 zijden steek, bind de knoop zo klein mogelijk, en snijd de uiteinden zo kort mogelijk.
- Plaats de ratten onder infrarood licht of op een verwarmingskussen om warm te blijven en ze te laten herstellen van anesthesie.
- Bevestig de ratten zijn warm, roze, en in staat van spontane beweging voordat de ratten terug te keren naar de kooi.
4. Toezicht op de longdistributie van MSC's
- Om de getransplanteerde menselijke MSC's op te sporen, injecteer je de ratten intraperitoneally met luciferine kaliumzout in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij een dosis van 125 mg/kg lichaamsgewicht 15 minuten na MSC-injectie.
- Verdoven de ratten met behulp van 2% isoflurane door middel van neuskegels.
- Verwerf sequentiële beelden met intervallen van 5-15 s 10 min na de toediening van luciferin met medium binning, 1 f/stop en een gezichtsveld van 26 cm met behulp van een beeldvormingssysteem voor kleine dieren(Tabel van materialen).
- Kwantificeer de luminescentieactiviteit uit de longen op basis van de automatische interessegebieden met behulp van beeldvormingssoftware (Tabel van materialen)17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De longverdeling van intratracheale instillatie van stamcellen in de term neonatale ratten werd bepaald door firefly luciferase (Fluc)-gelabelde stamcellen. MSC's werden gelabeld met Fluc en gelabeld met groene fluorescerende eiwitten door lentivirale transductie. Figuur 1A toont een hoog niveau van GFP-expressie in menselijke MSC's, en 93,7% van de bevolking toonde GFP positieve expressie gedetecteerd door flow cytometrie. MSC's werden gekenmerkt door het analyseren van de expressie van cd-markers (d.w.z. CD 44, CD73, CD90 en CD105) en de mogelijkheid van trilineagedifferentiatie in osteocyten, chondrocyten en adipocyten(figuur 1B,C). Om de getransplanteerde menselijke MSCs in vivo te volgen, werd luminescentie beeldvorming van de ratten uitgevoerd met behulp van een klein-dier beeldvormingssysteem. De metingen werden genomen ventrally. De ratten werden gefixeerd met plakband en vervolgens werd een intraperitoneale injectie van 30 mg/mL luciferine kaliumzout in PBS toegediend bij een dosis van 125 mg/kg lichaamsgewicht. Luciferase combineert met luciferine, zuurstof en ATP, en genereert licht door middel van een chemische reactie, wat resulteert in bioluminescentie188. Tijdens de beeldvormingsprocedure werden de ratten verdoofd met behulp van 2% isoflurane toegediend via neuskegels. Rat beelden werden verworven 10 min na luciferin administratie. Sequentiële beelden werden verworven met intervallen van 5-15 s (geen vertraging) gedurende ten minste 1 min, met medium binning, 1 f/stop en een gezichtsveld van 26 cm. Met behulp van meetgegevens van een reeks spectrale beelden gefilterd op verschillende golflengten (560-660 nm), werd de diepte en locatie van de bioluminescente reporter bepaald. Luminescentiesignalen uit de longen werden berekend op basis van de automatische interessegebieden in de cirkelselectiemodus. De gemiddelde luminescentieintensiteit bij normaal met zout behandelde dieren kreeg een waarde van één toegewezen en de gegevens voor elk met MSC behandeld dier werden genormaliseerd tot die van normale met zout behandelde dieren.
Figuur 2A toont een representatief beeld van luminescentie in de rattenlongen. Er werd geen luminescentie waargenomen in de longgebieden van de ratten die met normale zoutoplossing werden behandeld. De met MSC's behandelde ratten vertoonden luminescentie in de luchtpijp- en centrale longgebieden. Uit kwantificering van de luminescentieintensiteit bleek dat de met MSC's behandelde ratten een toename van ongeveer 13voudige toename van de luminescentieactiviteit vertoonden, vergeleken met de ratten die alleen met normale zoutoplossing werden behandeld(figuur 2B).
Figuur 1: Karakterisering van menselijke MDC's.
(A) GFP-expressie in menselijke MSC's na de transductie van lentivirus. (B) Expressie van menselijke MSC-specifieke cd-markers (d.w.z. CD 44, CD73, CD90, CD105). (C) Trilineage differentiatie van menselijke MSCs. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Monitoring van de longverdeling van luminescentie met behulp van een beeldvormingssysteem voor kleine dieren.
aA) een representatief beeld van de longdistributie van de gelabelde MSC's bij ratten. Er werd geen luminescentie waargenomen in het longgebied van ratten die met normale zoutoplossing werden behandeld. Ratten behandeld met menselijke MSCs tentoongesteld luminescentie in de tracheale en longgebieden. (B) Kwantificering van de luminescentieactiviteit in de rattenlongen (n = 4). De foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. De schaal is fotonen/s/cm2/sr in Y-as. **P < 0,01. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pasgeboren baby's met ademhalingsproblemen hebben vaak intratracheale oppervlakteactieve stoffen en/of corticosteroïdenbehandeling19nodig. Klinische studies van de menselijke fase I hebben de veiligheid van intratracheale MSC's bij te vroeg geboren baby'saangetoond 8. Deze studies suggereren dat intratracheale toediening van geneesmiddelen is een belangrijke optie voor pasgeboren baby's met ademhalingsproblemen. Diermodel studies zijn zeer nuttig als het model functies zijn direct relevant voor de mens. Term pasgeboren ratten zijn nuttige modellen voor vroegtijdige longletsel en ontwikkelingsstudies. Echter, de bovenste luchtwegen van neonatale ratten is te klein om directe tracheale intubatie zoals uitgevoerd bij volwassen ratten20mogelijk te maken. Intratracheale instillatie door tracheotomie is een haalbare alternatieve techniek voor intratracheale toediening van stamcellen of geneesmiddelen naar de neonatale rattenlongen.
In vivo bioluminescentie beeldvorming is een waardevol instrument voor in vitro en in vivo monitoring van het lot van de getransplanteerde stamcel, bereikt door het labelen van cellen met de constitutieve expressie van een luciferase reporter eiwit21. Luciferase enzymen katalyseren de oxidatie van een substraat (luciferine), en geven licht af als een product van de reactie. Visuele beeldvorming door middel van bioluminescentie maakt een niet-invasieve en real-time analyse van ziekteprocessen in levende organismen mogelijk. Bioluminescentie beeldvorming werd gebruikt voor in vivo monitoring van de migratie, overleving en morfologische differentiatie van de MSCs22. Deze studie evalueerde de verdeling van de getransplanteerde stamcellen in de longen met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem. In vivo bioluminescentie is beeldvorming gebaseerd op de monitoring van cellen die in cel zitten. Omdat deze kunnen worden fagocytosed bij celdood, kan het leiden tot het bijhouden van gastheer macrofagen. Daarom werd luminescentie minder dan 10 minuten na luciferin toediening gemeten.
De beperking van deze studie is dat interanimale variatie werd waargenomen in de IVIS beelden. Vandaar dat de luminescentiesignalen uit de longen werden berekend op basis van de automatische interessegebieden en het normaliseren van de gemiddelde luminescentieintensiteit tot één bij normale met zout behandelde dieren.
Correcte en effectieve intratracheale instillatie is essentieel voor de evaluatie van de MSC-werkzaamheid bij neonatale ratten, maar het kan ook nuttig zijn voor het testen van andere medicinale behandelingen. Vandaar dat deze rat model techniek kan worden aangepast aan een verscheidenheid van longtoepassingen. Intratracheale instillatie van stamcellen of geneesmiddelen is een relatief eenvoudige en kosteneffectieve behandeling van longziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd mede ondersteund door een subsidie van Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan (A-109-008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
- Ramanathan, R., Bhatia, J. J., Sekar, K., Ernst, F. R. Mortality in preterm infants with respiratory distress syndrome treated with poractant alfa, calfactant or beractant: a retrospective study. Journal of Perinatology. 33, 119-125 (2013).
- Gien, J., Kinsella, J. P. Pathogenesis and treatment of bronchopulmonary dysplasia. Current Opinion in Pediatrics. 23, 305-313 (2011).
- Pasha, A. B., Chen, X. Q., Zhou, G. P. Bronchopulmonary dysplasia: Pathogenesis and treatment. Experimental and Therapeutic. 16, 4315-4321 (2018).
- Committee on Fetus and Newborn. Postnatal corticosteroids to treat or prevent chronic lung disease in preterm infants. Pediatrics. 109, 330-338 (2002).
- Watterberg, K. L. American Academy of Pediatrics; Committee on Fetus and Newborn. Policy statement-postnatal corticosteroids to prevent or treat bronchopulmonary dysplasia. Pediatrics. 126, 800-808 (2010).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)- dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (2), 42-49 (2009).
- Chou, H. C., Li, Y. T., Chen, C. M. Human mesenchymal stem cells attenuate experimental bronchopulmonary dysplasia induced by perinatal inflammation and hyperoxia. American Journal of Translational Research. 8, 342-353 (2016).
- Chen, C. M., Chou, H. C., Lin, W., Tseng, C. Surfactant effects on the viability and function of human mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo assessment. Stem Cell Research & Therapy. 8, 180 (2017).
- Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80, 415-424 (2016).
- Fleurence, E., et al. Comparative efficacy of intratracheal adeno-associated virus administration to newborn rats. Human Gene Therapy. 16, 1298-1306 (2005).
- Waszak, P., et al. Effect of intratracheal adenoviral vector administration on lung development in newborn rats. Human Gene Therapy. 13, 1873-1885 (2002).
- O'Reilly, M., Thébaud, B. Animal models of bronchopulmonary dysplasia. The term rat models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307, 948 (2014).
- Yu, J., et al. GFP labeling and hepatic differentiation potential of human placenta-derived mesenchymal stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 35, 2299-2308 (2015).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells. Stem Cells. 27, 126-137 (2009).
- Huang, L. T., et al. Effect of surfactant and budesonide on pulmonary distribution of fluorescent dye in mice. Pediatric and Neonatology. 56, 19-24 (2015).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18, 164-172 (2012).
- Yeh, T. F., et al. Intra-tracheal administration of budesonide/surfactant to prevent bronchopulmonary dysplasia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193, 86-95 (2016).
- Nguyen, J. Q., et al. Intratracheal inoculation of Fischer 344 rats with Francisella tularensis. Journal of Visualized Experiments. (127), e56123 (2017).
- de Almeida, P. E., van Rappard, J. R., Wu, J. C. In vivo bioluminescence for tracking cell fate and function. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 663-671 (2011).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49, 3-10 (2011).
