Summary
Descritto è un protocollo per eseguire il trapianto intratracheale di cellule stromali mesenchymale (MSC) attraverso l'iniezione intratracheale in ratti neonatici. Questa tecnica è un'opzione clinicamente praticabile per la somministrazione di cellule staminali e farmaci nei polmoni di ratto neoatale per valutarne l'efficacia.
Abstract
L'esposizione prolungata ad alte concentrazioni di ossigeno porta a infiammazione e lesioni polmonari acute, che è simile alla displasia broncopolmonare umana (BPD). Nei neonati prematuri, la BPD è una complicazione importante nonostante l'uso precoce della terapia surfactant, le strategie di ventilazione ottimali e la ventilazione a pressione positiva non invasiva. Poiché l'infiammazione polmonare svolge un ruolo cruciale nella patogenesi della BPD, l'uso di corticosteroidi è un potenziale trattamento per prevenirlo. Tuttavia, il trattamento corticosteroide sistemico non è solitamente raccomandato per i neonati pretermine a causa di effetti avversi a lungo termine. Studi preclinici e studi clinici di fase io hanno dimostrato che l'uso di cellule stromali mesenchymale (MSC) in lesioni polmonari indotte da iperossia e nei neonati pretermine è sicuro e fattibile. Il trapianto intratracheale e intravenoso di MSC ha dimostrato di proteggere contro lesioni polmonari iperossiche neoatali. Pertanto, la somministrazione intratracheale delle cellule staminali e il trattamento combinato di surfactant e glucocorticoide è emerso come una nuova strategia per il trattamento dei neonati con disturbi respiratori. Lo stadio di sviluppo dei polmoni di ratto alla nascita è equivalente a quello dei polmoni umani a 26-28 settimane di gestazione. Quindi, i ratti appena nati sono appropriati per studiare la somministrazione intratracheale ai neonati pretermine con difficoltà respiratorie per valutarne l'efficacia. Questa tecnica di instillazione intratracheale è un'opzione clinicamente praticabile per la consegna di cellule staminali e farmaci nei polmoni.
Introduction
L'ossigeno supplementare è spesso necessario per trattare i neonati con difficoltà respiratorie1. Tuttavia, la terapia iperossia nei neonati ha effetti negativi a lungo termine. L'esposizione prolungata ad alte concentrazioni di ossigeno porta a infiammazione e lesioni polmonari acute, che è simile alla displasia broncopolmonare umana (BPD)2. La BPD è una delle principali complicanze del trattamento con iperossia che può verificarsi nonostante la terapia precoce, le procedure di ventilazione ottimali e l'aumento dell'uso della ventilazione a pressione positiva non invasiva nei neonati prematuri. Mentre molte strategie di trattamento sono state segnalate per BPD3, nessuna terapia nota può ridurre questa complicazione.
L'uso di corticosteroidi è un potenziale trattamento per prevenire la BPD, perché l'infiammazione polmonare svolge un ruolo cruciale nella sua patogenesi. Tuttavia, la terapia sistemica corticosteroide non è solitamente raccomandata per i neonati pretermine a causa di effetti avversi a lungo termine4,5.
Le cellule stromali mesenchymal (MSC) hanno caratteristiche pluripotenti e possono differenziarsi in vari tipi di cellule, tra cui osso, cartilagine, tessuto adiposo, muscolo e tendini6. Le MSC hanno effetti immunomodulatori, antinfiammatori e rigenerativi7, e gli studi sugli animali mostrano i benefici terapeutici delle MSC e dei loro componenti secreti in lesioni polmonari indotte da iperossia nei roditori8,9. Il trapianto intratracheale e intravenoso di MSC ha dimostrato di proteggere contro lesioni polmonari iperossiche neoatali. Pertanto, la somministrazione intratracheale delle cellule staminali e la terapia combinata di surfactant e corticosteroidi potrebbero essere una potenziale strategia di trattamento per il trattamento dei neonati con disturbi respiratori. Studi preclinici hanno utilizzato la somministrazione intratracheale delle cellule staminali e del virus adeno-associato nei ratti neonati10,11,12. Tuttavia, non è disponibile una presentazione passo-passo della tecnica e il monitoraggio in vivo delle cellule staminali trapiantate. Il ratto appena nato è adatto per studiare gli effetti della somministrazione intratracheale sui neonati con difficoltà respiratorie perché lo stadio saccolare del polmone del ratto alla nascita è equivalente a quello del polmone umano a 26-28 settimane di gestazione13. Un metodo efficace per la somministrazione nella trachea del ratto è fondamentale per una distribuzione polmonare di successo. La tecnica qui presentata consente lo studio della somministrazione intratracheale di cellule e/o farmaci per il trattamento di malattie polmonari neomotorie utilizzando ratti come modello per gli esseri umani.
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Protocol
Questa procedura è stata approvata dal comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di Medicina di Taipei.
NOTA: le MSC umane sono state equamente trascate da proteine fluorescenti verdi (GFP) e geni di luciferasi delle lucciole (Fluc) ottenuti da un'azienda commerciale (Tabella dei materiali).
1. Caratterizzazione di MSC umani con luciferasi della lucciola e proteina fluorescente verde
- Mantenere le MSC umane trascate con GFP e Fluc in supporti completi (modifica minima essenziale dell'aquila-alfa media-alfa,, completata con 10-15% siero bovino fetale [FBS], 2 mM L-glutamine, 1 ng/mL base FGF e PSF) a 37 gradi centigradi con umidità satura e 5% di CO2. Passare le celle a confluenza di 70-90 %.
- Osservare le MSC in un microscopio a contrasto di fase di fluorescenza (Figura 1A) e analizzare i livelli di espressione di Fluc e GFP14.
- Caratterizzare gli MSC analizzando l'espressione dei marcatori CD, tra cui CD44, CD73, CD90, CD105 utilizzando la citometria di flusso (Figura 1B). Indurre la differenziazione della trilina delle cellule staminali a adipociti, condrociti e osteociti, e confermare la differenziazione del trilineage (Figura 1C) di von Kossa, oltra tolmo rosso o Alcian colorazione a seguito di un protocollo commerciale15,16.
2. Anestesizzazione dei cuccioli di ratto
- Consentire ai ratti Sprague-Dawley incinte datati nel tempo di consegnare vaginalmente a termine.
- Togliere i cuccioli di topo dalla gabbia il giorno postnatale 5.
- Anestesizzare i cuccioli di ratto utilizzando l'anestesia del gas (cioè il 2% di isoflurane) in una camera di anestesia.
- Confermare l'anestesia adeguata controllando la respirazione e i riflessi.
NOTA: La respirazione dovrebbe diventare superficiale e i riflessi dovrebbero diminuire. I cuccioli di ratto rimangono incoscienti per almeno 10 dollari con questa concentrazione di isoflurane.
3. Instillazione intratracheale
- Una volta anestesizzati, trattenete i cuccioli di ratto su un supporto di intubazione inclinati a 60 gradi e tenete i cuccioli in posizione con del nastro di etichettatura di laboratorio su tutti e quattro gli arti.
- Applicare il nastro sotto il naso per fissare la testa e individuare il collo per la tracheotomia di foratura.
- Disinfettare l'area di incisione (cioè il collo) con un cuscinetto di preparazione alcolica del 75%.
- Fare un'incisione collo verticale di 0,3 cm sopra la trachea con microscissors per evitare di danneggiare le arterie carotidee.
- Dissezionare gli strati di grasso e muscoli per individuare la trachea con una pinzetta affitta a punta curva senza gancio.
- Tenere la trachea con le pinzette affido punta curva.
- Tenere una siringa di 100 l e iniettare lentamente 30 l di normale salina (cioè, controllo) o 30 L di MSC fluc-GFP etichettati (1 x 105 celle) nella trachea attraverso una siringa ad ago da 30 G durante la fase di inspir.
- Chiudere l'incisione con un punto di seta 6-0, legare il nodo il più piccolo possibile e tagliare le estremità il più corto possibile.
- Posizionare i ratti sotto la luce infrarossa o su una piastra di riscaldamento per tenere al caldo e consentire loro di recuperare dall'anestesia.
- Verificare che i ratti siano caldi, rosa e in grado di movimento spontaneo prima di restituire i ratti alla gabbia.
4. Monitoraggio della distribuzione polmonare delle MSC
- Per monitorare le MSC umane trapiantate, iniettare intraperitonenamente i ratti con sale di potassio luciferina in fosfato tamponato salina (PBS) ad una dose di 125 mg/kg di peso corporeo 15 min dopo l'iniezione MSC.
- Anestesizzare i ratti utilizzando 2% isoflurane attraverso i coni nasali.
- Acquisire immagini sequenziali a intervalli di 5-15 s 10 min dopo la somministrazione di luciferina con binning medio, 1 f/stop e un campo visivo di 26 cm utilizzando un sistema di imaging di piccoli animali (Tabella dei materiali).
- Quantificare l'attività di luminescenza dai polmoni in base alle regioni automatiche di interesse utilizzando il software di imaging (Tabella dei materiali)17.
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Representative Results
La distribuzione polmonare dell'instillazione intratracheale delle cellule staminali nei ratti neo-neoanati è stata determinata dalle cellule staminali con etichettatura della lucciola luciferasi (Fluc). Le MSC sono state etichettate con Fluc e etichettate con proteine fluorescenti verdi attraverso la trasduzione lentivirale. La figura 1A mostra un alto livello di espressione GFP nelle MSC umane e il 93,7% della popolazione ha mostrato che l'espressione positiva di GFP rilevata dalla citometria del flusso. Le MSC erano caratterizzate dall'analisi dell'espressione dei marcatori CD (ad esempio CD 44, CD73, CD90 e CD105) e dalla capacità di differenziazione del trilineaggio in osteociti, condrociti e adipociti (Figura 1B,C). Per monitorare i MSC umani trapiantati in vivo, l'imaging della luminescenza dei ratti è stato eseguito utilizzando un sistema di imaging di piccoli animali. Le misurazioni sono state prese in modo vendicante. I ratti sono stati fissati con nastro adesivo e successivamente è stata somministrata un'iniezione intraperitale di 30 mg/mL di sale di potassio di luciferina in PBS ad una dose di 125 mg/kg di peso corporeo. Luciferasi si combina con luciferina, ossigeno e ATP, e genera luce attraverso una reazione chimica, con conseguente bioluminescenza18. Durante la procedura di imaging, i ratti sono stati anestesi utilizzando 2% isoflurane somministrato attraverso coni nasali. Le immagini di ratto sono state acquisite 10 min dopo l'amministrazione luciferina. Le immagini sequenziali sono state acquisite a intervalli da 5 a 15 s (nessun ritardo di tempo) per almeno 1 min, con binning medio, 1 f/stop e un campo visivo di 26 cm. Utilizzando i dati di misurazione di una sequenza di immagini spettrali filtrate a diverse lunghezze d'onda (560-660 nm), è stata determinata la profondità e la posizione del reporter bioluminescente. I segnali di luminescenza provenienti dai polmoni sono stati calcolati in base alle regioni automatiche di interesse nella modalità di selezione del cerchio. All'intensità media della luminescenza negli animali normali trattati con salina è stato assegnato un valore di uno, e i dati per ogni animale trattato con MSC sono stati normalizzati a quelli degli animali normali trattati con salina.
La figura 2A mostra un'immagine rappresentativa della luminescenza nei polmoni del ratto. Nelle regioni polmonari dei ratti trattati con normale salina non è stata osservata luminescenza. I ratti trattati con MSC mostravano luminescenza nelle regioni della trachea e del polmone centrale. La quantificazione dell'intensità della luminescenza ha rivelato che i ratti trattati con MSC hanno mostrato un aumento di circa 13 volte dell'attività di luminescenza, rispetto ai ratti trattati con la normale salina da soli (Figura 2B).
Figura 1: Caratterizzazione delle MSC umane.
(A) Espressione GFP nelle MSC umane dopo la trasduzione del lentivirus. (B) Espressione dei marcatori CD specifici di MSC (ad esempio, CD 44, CD73, CD90, CD105). (C) Differenziazione trilineare delle MSC umane.
Figura 2: Monitoraggio della distribuzione polmonare della luminescenza mediante un sistema di imaging di piccoli animali.
(A) Un'immagine rappresentativa della distribuzione polmonare delle MSC etichettate nei ratti. Non è stata osservata luminescenza nella regione polmonare dei ratti trattati con normale salina. I ratti trattati con MSC umani mostravano luminescenza nelle regioni tracheali e polmonari. (B) Quantificazione dell'attività di luminescenza nei polmoni del ratto (n . 4). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. La scala è foton/s/cm2/sr nell'asse Y. < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I neonati con difficoltà respiratorie richiedono comunemente un surfactant intratracheale e/o trattamento corticosteroide19. Gli studi clinici sulla fase i umana hanno dimostrato la sicurezza delle comunicazioni e le comunicazioni amoanzi intratracheali nei neonati pretermine8. Questi studi suggeriscono che la somministrazione intratracheale dei farmaci è un'opzione importante per i neonati con difficoltà respiratorie. Gli studi sui modelli animali sono particolarmente utili se le caratteristiche del modello sono direttamente pertinenti agli esseri umani. I ratti neonati sono modelli utili per le lesioni polmonari pretermine e studi di sviluppo. Tuttavia, le vie aeree superiori dei ratti neonali sono troppo piccole per consentire l'intubazione tracheale diretta eseguita nei ratti adulti20. L'instillazione intratracheale attraverso la tracheotomia è una tecnica alternativa fattibile per la somministrazione intratracheale di cellule staminali o farmaci ai polmoni di ratto neoatale.
L'imaging a bioluminescenza in vivo è uno strumento prezioso per il monitoraggio in vitro e in vivo del destino delle cellule staminali trapiantate, realizzato etichettando le cellule con l'espressione generativa di una proteina reporter luciferale21. Gli enzimi Luciferasi catalizzano l'ossidazione di un substrato (luciferina) e rilasciano la luce come prodotto della reazione. L'imaging visivo attraverso la bioluminescenza consente un'analisi non invasiva e in tempo reale dei processi della malattia negli organismi viventi. L'imaging a bioluminescenza è stato utilizzato per il monitoraggio in vivo della migrazione, della sopravvivenza e della differenziazione morfologica dei MSC22. Questo studio ha valutato la distribuzione delle cellule staminali trapiantate nei polmoni utilizzando un sistema di imaging in vivo. L'imaging a bioluminescenza in vivo si basa sul monitoraggio delle particelle contenute nelle cellule. Poiché questi possono essere fagocitosi alla morte delle cellule, potrebbe portare al monitoraggio dei macrofagi ospiti. Pertanto, la luminescenza è stata misurata meno di 10 min dopo la somministrazione di luciferina.
La limitazione di questo studio è che la variazione interanimale è stata percepita nelle immagini IVIS. Di conseguenza, i segnali di luminescenza provenienti dai polmoni sono stati calcolati in base alle regioni automatiche di interesse e normalizzando l'intensità media della luminescenza a una negli normali animali trattati con salina.
L'instillazione intratracheale corretta ed efficace è essenziale per la valutazione dell'efficacia di MSC nei ratti neoologati, ma può essere utile anche per testare altri trattamenti medicinali. Quindi, questa tecnica del modello di ratto può essere regolabile per una varietà di applicazioni polmonari. L'instillazione intratracheale di cellule staminali o farmaci rappresenta un trattamento relativamente facile ed economico delle malattie polmonari.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato in parte sostenuto da una sovvenzione di Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan (A-109-008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
- Ramanathan, R., Bhatia, J. J., Sekar, K., Ernst, F. R. Mortality in preterm infants with respiratory distress syndrome treated with poractant alfa, calfactant or beractant: a retrospective study. Journal of Perinatology. 33, 119-125 (2013).
- Gien, J., Kinsella, J. P. Pathogenesis and treatment of bronchopulmonary dysplasia. Current Opinion in Pediatrics. 23, 305-313 (2011).
- Pasha, A. B., Chen, X. Q., Zhou, G. P. Bronchopulmonary dysplasia: Pathogenesis and treatment. Experimental and Therapeutic. 16, 4315-4321 (2018).
- Committee on Fetus and Newborn. Postnatal corticosteroids to treat or prevent chronic lung disease in preterm infants. Pediatrics. 109, 330-338 (2002).
- Watterberg, K. L. American Academy of Pediatrics; Committee on Fetus and Newborn. Policy statement-postnatal corticosteroids to prevent or treat bronchopulmonary dysplasia. Pediatrics. 126, 800-808 (2010).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)- dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (2), 42-49 (2009).
- Chou, H. C., Li, Y. T., Chen, C. M. Human mesenchymal stem cells attenuate experimental bronchopulmonary dysplasia induced by perinatal inflammation and hyperoxia. American Journal of Translational Research. 8, 342-353 (2016).
- Chen, C. M., Chou, H. C., Lin, W., Tseng, C. Surfactant effects on the viability and function of human mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo assessment. Stem Cell Research & Therapy. 8, 180 (2017).
- Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80, 415-424 (2016).
- Fleurence, E., et al. Comparative efficacy of intratracheal adeno-associated virus administration to newborn rats. Human Gene Therapy. 16, 1298-1306 (2005).
- Waszak, P., et al. Effect of intratracheal adenoviral vector administration on lung development in newborn rats. Human Gene Therapy. 13, 1873-1885 (2002).
- O'Reilly, M., Thébaud, B. Animal models of bronchopulmonary dysplasia. The term rat models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307, 948 (2014).
- Yu, J., et al. GFP labeling and hepatic differentiation potential of human placenta-derived mesenchymal stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 35, 2299-2308 (2015).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells. Stem Cells. 27, 126-137 (2009).
- Huang, L. T., et al. Effect of surfactant and budesonide on pulmonary distribution of fluorescent dye in mice. Pediatric and Neonatology. 56, 19-24 (2015).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18, 164-172 (2012).
- Yeh, T. F., et al. Intra-tracheal administration of budesonide/surfactant to prevent bronchopulmonary dysplasia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193, 86-95 (2016).
- Nguyen, J. Q., et al. Intratracheal inoculation of Fischer 344 rats with Francisella tularensis. Journal of Visualized Experiments. (127), e56123 (2017).
- de Almeida, P. E., van Rappard, J. R., Wu, J. C. In vivo bioluminescence for tracking cell fate and function. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 663-671 (2011).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49, 3-10 (2011).
