Summary
موصوفة هو بروتوكول لإجراء زرع داخل الجسم من الخلايا الوماضة (MSCs) من خلال الحقن داخل المنطقة في الفئران حديثي الولادة مصطلح. هذه التقنية هي خيار قابل للتطبيق سريرياً لإيصال الخلايا الجذعية والأدوية إلى الرئتين الفئران حديثي الولادة لتقييم فعاليتها.
Abstract
يؤدي التعرض لفترات طويلة إلى تركيزات عالية من الأكسجين إلى الالتهاب وإصابة الرئة الحادة ، والتي تشبه خلل التنسج القصبي الرئوي البشري (BPD). في الأطفال الخدج، تعتبر المعالجة بالرضع (BPD) من المضاعفات الرئيسية على الرغم من الاستخدام المبكر للعلاج بالسطح، واستراتيجيات التهوية المثلى، والتهوية الضغطية الإيجابية غير الباضعة. لأن الالتهاب الرئوي يلعب دورا حاسما في التسبب في BPD, استخدام الكورتيكوستيرويد هو واحد العلاج المحتمل لمنعه. ومع ذلك، لا ينصح عادة العلاج الكورتيكوستيرويد الجهازي للرضع الخدج بسبب الآثار الضارة على المدى الطويل. أظهرت الدراسات قبل السريرية والتجارب السريرية للمرحلة الأولى من الإنسان أن استخدام الخلايا الرمزية الميدية السينية (MSCs) في إصابات الرئة الناجمة عن فرط التأكسج وفي الخدج آمن وممكن. وقد ثبت أن زرع MSC داخل الرحم والوريدة يحمي من إصابة الرئة فرط الأكسدة الوليد. ولذلك، ظهرت الإدارة داخل المنطقة من الخلايا الجذعية والعلاج المشترك بين السطح وglucocorcorticoid كاستراتيجية جديدة لعلاج المواليد الجدد الذين يعانون من اضطرابات في الجهاز التنفسي. مرحلة النمو في الرئتين الفئران عند الولادة هو ما يعادل تلك التي في الرئتين البشرية في 26-28 أسبوع من الحمل. وبالتالي، فإن الفئران حديثي الولادة مناسبة لدراسة الإدارة داخل الرحم للرضع الخدج المصابين بضائقة تنفسية لتقييم فعاليتها. هذه تقنية تقطير داخل المختبر هو خيار قابل للتطبيق سريرياً لإيصال الخلايا الجذعية والأدوية إلى الرئتين.
Introduction
وغالبا ما يتطلب الأكسجين التكميلي لعلاج الأطفال حديثي الولادة مع ضيق الجهاز التنفسي1. ومع ذلك، العلاج فرط التأكسده عند الرضع له آثار سلبية على المدى الطويل. التعرض لفترات طويلة لتركيزات عالية من الأكسجين يؤدي إلى التهاب وإصابة الرئة الحادة، وهو مشابه لخلل التنسج القصبي البشري (BPD)2. BPD هو أحد المضاعفات الرئيسية للعلاج فرط التأكسج التي يمكن أن تحدث على الرغم من العلاج السطحي في وقت مبكر، وإجراءات التهوية المثلى، وزيادة استخدام التهوية الضغط الإيجابي غير الباضع في الرضع الخدج. في حين تم الإبلاغ عن العديد من استراتيجيات العلاج لـ BPD3، لا يمكن لأي علاج معروف أن يقلل من هذه المضاعفات.
استخدام الكورتيكوستيرويد هو واحد من العلاجات المحتملة للوقاية من الالتهابات الرئوية، لأن الالتهاب الرئوي يلعب دوراً حاسماً في مرضه. ومع ذلك، لا ينصح عادة العلاج الكورتيكوستيرويد الجهازي للرضع الخدج بسبب الآثار الضارة على المدى الطويل4,5.
خلايا السترومال Mesenchymal (MSCs) لها خصائص متعددة القدرات ويمكن أن تفرق إلى أنواع الخلايا المختلفة، بما في ذلك العظام والغضاريف والأنسجة الدهنية والعضلات والأوتار6. MSCs لها immunomodulatory, المضادة للالتهابات, والآثار التجديدية7, وتظهر الدراسات الحيوانية الفوائد العلاجية من MSCs ومكوناتها المفرزة في فرطوكسيا الناجمة عن إصابة الرئة في القوارض8,9. وقد ثبت أن زرع MSC داخل الرحم والوريدة يحمي من إصابة الرئة فرط الأكسدة الوليد. ولذلك، قد يكون العلاج داخل الرحم للخلايا الجذعية والعلاج المشترك بين السطح والكورتيكوستيرويد استراتيجية علاج محتملة لعلاج المواليد الجدد الذين يعانون من اضطرابات في الجهاز التنفسي. وقد استخدمت الدراسات قبل الظهرية الإدارة داخل الخلايا الجذعية وفيروس مرتبط أدينو في الفئران حديثي الولادة10,11,12. ومع ذلك، لا يتوفر عرض خطوة بخطوة لهذه التقنية وتتبع في الجسم الحي للخلايا الجذعية المزروعة. يعتبر الجرذ حديث الولادة مناسباً لدراسة آثار الإدارة داخل الرحم على الخدج المصابين بضائقة تنفسية لأن المرحلة الاكسترائية لرئة الفئران عند الولادة تعادل تلك التي في الرئة البشرية في الأسبوع 26-28 من الحمل13. طريقة فعالة لإدارة القصبة الهوائية الفئران أمر حاسم لنجاح توزيع الرئة. تسمح التقنية المعروضة هنا بدراسة الإدارة داخل الجسم للخلايا و/أو الأدوية لعلاج أمراض المواليد الرئوية باستخدام الفئران كنموذج للبشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في جامعة تايبيه الطبية على هذا الإجراء.
ملاحظة: تم الحصول على MSCs الإنسان بشكل ثابت مع البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ومورثات اليراعات luciferase (Fluc) من شركة تجارية (جدول المواد).
1. توصيف MSCs الإنسان مع لوسيفراز اليراعات والبروتين الفلورسنت الأخضر
- الحفاظ على MSCs البشرية مع GFP وFlc في وسائل الإعلام الكاملة (الحد الأدنى من الضروري تعديل النسر ألفا المتوسطة الأساسية [αMEM] ، تستكمل مع 10-15 ٪ مصل الأبقار الجنينية [FBS] ، 2 mM L-الجلوتامين ، 1 نانوغرام / مل FGF الأساسية ، و PSF) في 37 درجة مئوية مع الرطوبة المشبعة و 5 ٪ CO2. خلايا الممر عند التقاء 70%90.
- مراقبة MSCs تحت المجهر الفلوري الفلوري النقيض (الشكل 1A) وتحليل مستويات التعبير من فلوك وGFP14.
- تميز MSCs عن طريق تحليل التعبير عن علامات القرص المضغوط بما في ذلك CD44، CD73، CD90، CD105 باستخدام تدفق قياس الاستئصال(الشكل 1B). الحث على تمايز الخوارق من الخلايا الجذعية إلى الخلايا الدهنية، وchondrocytes، والعظام، وتأكيد تمايز الخط الثلاثي(الشكل 1C)بواسطة فون كوسا، زيت O الأحمر، والأزرق ألسي تلطيخ بعد بروتوكول تجاري15،16.
2. تخدير الجراء الفئران
- السماح للفئران الحامل Sprague-Dawley التي مرّت وقتًا بِهِل الحملِ عن الناحية المهبلية في فترة المدى.
- إزالة الجراء الفئران من القفص في اليوم التالي للولادة 5.
- تخدير الجراء الفئران باستخدام التخدير الغاز (أي، 2٪ isoflurane) في غرفة التخدير.
- تأكد من التخدير الكافي عن طريق التحقق من التنفس وردود الفعل.
ملاحظة: يجب أن يصبح التنفس ضحلاً وينبغي أن تتضاءل ردود الفعل. الجراء الفئران لا تزال فاقد الوعي لمدة لا تقل عن ~ 10 دقيقة مع هذا التركيز isoflurane.
3. تقطير داخلtracheal
- مرة واحدة تخدير، كبح جماح الجراء الفئران على موقف الاحتضان الزاوية في ~ 60 درجة وعقد الجراء في مكان مع شريط وضع العلامات المختبرية على جميع الأطراف الأربعة.
- تطبيق الشريط تحت الأنف لإصلاح الرأس وتحديد الرقبة لثقب القصبة الهوائية.
- تطهير منطقة شق (أي، الرقبة) مع 75٪ الكحول وسادة الإعدادية.
- جعل 0.3 سم شق الرقبة المتوسطة الرأسية فوق القصبة الهوائية مع ميكروسيسور لتجنب إتلاف الشرايين السباتية.
- تشريح الدهون والعضلات طبقات بعيدا لتحديد موقع القصبة الهوائية مع ملاقط مدبب طرف منحنية دون هوك.
- أمسك القصبة الهوائية مع ملاقط مدببة الرأس المنحنية.
- عقد حقنة 100 ميكرولتر تستقيم وحقن ببطء 30 ميكرولتر من المالحة العادية (أي، السيطرة) أو 30 ميكرولتر من Fluc-GFP المسمى MSCs (1 × 105 خلايا) في القصبة الهوائية من خلال حقنة إبرة 30 G خلال مرحلة الوسخ.
- إغلاق شق مع واحد 6-0 غرزة الحرير، وربط عقدة صغيرة قدر الإمكان، وقطع نهايات قصيرة قدر الإمكان.
- ضع الفئران تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء أو على وسادة التدفئة للحفاظ على الدفء والسماح لهم بالتعافي من التخدير.
- تأكد من أن الفئران دافئة وزهرية وقادرة على الحركة العفوية قبل إعادة الفئران إلى القفص.
4. رصد التوزيع الرئوي ل MSCs
- لتتبع MSCs البشرية المزروعة، حقن intraperitoneally الفئران مع ملح البوتاسيوم لوسفيرين في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) بجرعة من 125 ملغ/كجم من وزن الجسم 15 دقيقة بعد حقن MSC.
- تخدير الفئران باستخدام 2٪ isoflurane من خلال مخاريط الأنف.
- الحصول على الصور التسلسلية في فترات 5-15 s 10 دقيقة بعد إدارة لوسيفرين مع binning المتوسطة، 1 و / توقف، و 26 سم من حقل الرؤية باستخدام نظام تصوير الحيوانات الصغيرة (جدول المواد).
- كمي نشاط الإنارة من الرئتين على أساس المناطق التلقائية من الفائدة باستخدام برامج التصوير (جدول المواد)17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تحديد التوزيع الرئوي للغرس داخل الخلايا الجذعية في مصطلح الفئران الوليدية بواسطة الخلايا الجذعية المسماة بـ Fluc. تم تصنيف MSCs مع Fluc وموسومة بالبروتين الفلوري الأخضر من خلال تحويل فيروسات العدسي. يوضح الشكل 1A مستوى عال من التعبير GFP في MSCs البشرية، وأظهر 93.7٪ من السكان تعبيرًا إيجابيًا من GFP تم اكتشافه بواسطة قياس تدفق الدراجات. وتميزت MSCs بتحليل التعبير عن علامات CD (أي CD 44، CD73، CD90، وDD105) وقدرة تمايز الهجرات الثلاثية إلى خلايا أوستيا، وشوكوروليكيت، وأديباً(الشكل 1B، C). لتتبع MSCs البشرية المزروعة في الجسم الحي، تم إجراء التصوير الإنارة للفئران باستخدام نظام تصوير الحيوانات الصغيرة. وقد اتخذت القياسات ventrally. تم إصلاح الفئران مع شريط لاصق وبعد ذلك حقن داخل الصفتون من 30 ملغ /مليلتر من ملح البوتاسيوم لوسفيرين في برنامج تلفزيوني جرعة من 125 ملغ/كغ من وزن الجسم. لوسيفيراز يجمع مع لوسيفرين والأكسجين و ATP، ويولد الضوء من خلال تفاعل كيميائي، مما أدى إلى الإضاءة الحيوية18. أثناء إجراء التصوير، تم تخدير الفئران باستخدام 2٪ isoflurane تدار من خلال مخاريط الأنف. تم الحصول على صور الفئران 10 دقيقة بعد إدارة لوسيفيرين. تم الحصول على صور متسلسلة على فترات 5-15 s (بدون تأخير زمني) لمدة 1 دقيقة على الأقل، مع 1 f/stop، و 1 f/stop، و 26 سم من مجال الرؤية. وباستخدام بيانات القياس من سلسلة من الصور الطيفية التي تمت تصفيتها في أطوال موجية مختلفة (560-660 نانومتر)، تم تحديد عمق وموقع المراسل الإنارة الحيوية. تم حساب إشارات الإنارة من الرئتين على أساس المناطق التلقائية ذات الاهتمام في وضع اختيار الدائرة. تم تعيين متوسط كثافة الإنارة في الحيوانات المعالجة بالملاط العادية قيمة واحدة ، وتم تطبيع البيانات الخاصة بكل يعالج MSC إلى تلك الخاصة بالحيوانات المعالجة بالملوحة العادية.
ويبين الشكل 2A صورة تمثيلية للإنارة في الرئتين الفئران. ولم يلاحظ أي إنارة في مناطق الرئة للفئران المعالجة بالملوحة المالحة العادية. أظهرت الفئران المعالجة بـ MSCs الإنارة في القصبة الهوائية ومناطق الرئة الوسطى. وكشف القياس الكمي لكثافة الإنارة أن الفئران المعالجة بـ MSCs أظهرت زيادة 13 ضعفًا تقريبًا في نشاط الإنارة ، مقارنة بالجرذان المعالجة بالملوحة المالحة الطبيعية وحدها (الشكل 2B).
الشكل 1: توصيف حالات التصليحات البشرية.
(A) GFP التعبير في MSCs الإنسان بعد تحويل الفيروسة العدسي. (B) تعبير عن علامات CD خاصة بـ MSC (أي CD 44، CD73، CD90، CD105). (C ) التمييز بين التمايز بين الـ MSCs البشري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. C
الشكل 2: رصد التوزيع الرئوي للإنارة باستخدام نظام تصوير الحيوانات الصغيرة.
(أ) صورة تمثيلية للتوزيع الرئوي لـ MSCs المسمى في الفئران. لم يلاحظ أي إنارة في منطقة الرئة من الفئران المعالجة المالحة العادية. أظهرت الفئران المعالجة بـ MSCs البشرية الإنارة في مناطق القصبة الهوائية والرئة. (B) القياس الكمي لنشاط الإنارة في الرئتين الفئران (ن = 4). تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. المقياس هو فوتونات / s / cm2/ sr في محور Y. **P < 0.01. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الرضع حديثي الولادة مع ضيق الجهاز التنفسي تتطلب عادة السطح السطحي داخل المناطق التي تقع في المناطق التي تقع في المناطق التي تقع في المناطق التي تعاني من19. وقد أظهرت التجارب السريرية المرحلة الأولى الإنسان سلامة MSCs داخل المنطقة في الخدجالرضع 8. وتشير هذه الدراسات إلى أن تناول الأدوية داخل منطقة الرَّاَبِل هو خيار مهم للمواليد الجدد المصابين بضائقة تنفسية. دراسات نموذج الحيوان هي مفيدة للغاية إذا كانت ميزات النموذج هي ذات الصلة مباشرة للبشر. الجرذان حديثي الولادة على المدى هي نماذج مفيدة لإصابات الرئة المبتسرة ودراسات التنمية. ومع ذلك، فإن المجرى الهوائي العلوي للفئران الوليدية صغير جداً بحيث لا يسمح بالانكتروب القصبي المباشر كما هو مُجري في الفئران البالغة20. 12- إن تقطير الخلايا داخل الجسم من خلال القصبة الهوائية هو تقنية بديلة مجدية لإدارة الخلايا الجذعية أو الأدوية داخل الجسم في الرئتين الجرذين الوليديين.
في التصوير الحيوي vivo هو أداة قيمة لفي المختبر وفي الجسم الحي رصد مصير الخلايا الجذعية المزروعة، التي أنجزتها تسمية الخلايا مع التعبير التأسيسي لبروتين مراسل لوسيفيراز21. لوسيفيراز الإنزيمات تحفيز أكسدة الركيزة (لوسيفرين)، وإطلاق الضوء كمنتج من رد الفعل. التصوير البصري من خلال الإضاءة الحيوية يسمح بإجراء تحليل غير الباضع وفي الوقت الحقيقي لعمليات المرض في الكائنات الحية. تم استخدام التصوير الاحتياد الحيوي في مراقبة الجسم الحي للهجرة والبقاء والتمايز المورفولوجي لـ MSCs22. قيمت هذه الدراسة توزيع الخلايا الجذعية المزروعة في الرئتين باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي. في التصوير الاحيائي الحيوي يعتمد على رصد الجسيمات التي تحتوي على الخلايا. لأن هذه قد تكون phagocytosed على موت الخلية، فإنه يمكن أن يؤدي إلى تتبع الضامة المضيف. لذلك، تم قياس الإنارة أقل من 10 دقيقة بعد إدارة لوسيفيرين.
وفيما يتعلق بالقيود التي تحدّ من هذه الدراسة، فإن الاختلاف بين مختلف الأعراق كان مُلَهَماً في صور IVIS. وبالتالي، تم حساب إشارات الإنارة من الرئتين على أساس المناطق التلقائية من الفائدة وتطبيع كثافة الإضاءة المتوسطة إلى واحد في الحيوانات المعالجة بالملاح العادي.
إن تقطير الزرع داخل الرحم الصحيح والفعال ضروري لتقييم فعالية MSC في فئران حديثي الولادة ، ولكنه قد يكون مفيدًا لاختبار العلاجات الطبية الأخرى أيضًا. وبالتالي، قد تكون تقنية نموذج الفئران هذه قابلة للتعديل لمجموعة متنوعة من التطبيقات الرئوية. ويمثل غرس الخلايا الجذعية أو الأدوية داخل الجسم علاجاً سهلاً نسبياً وفعالاً من حيث التكلفة للأمراض الرئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعمت هذه الدراسة جزئيا من منحة من شركة Meridigen للتكنولوجيا الحيوية المحدودة تايبيه ، تايوان (A-109-008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
- Ramanathan, R., Bhatia, J. J., Sekar, K., Ernst, F. R. Mortality in preterm infants with respiratory distress syndrome treated with poractant alfa, calfactant or beractant: a retrospective study. Journal of Perinatology. 33, 119-125 (2013).
- Gien, J., Kinsella, J. P. Pathogenesis and treatment of bronchopulmonary dysplasia. Current Opinion in Pediatrics. 23, 305-313 (2011).
- Pasha, A. B., Chen, X. Q., Zhou, G. P. Bronchopulmonary dysplasia: Pathogenesis and treatment. Experimental and Therapeutic. 16, 4315-4321 (2018).
- Committee on Fetus and Newborn. Postnatal corticosteroids to treat or prevent chronic lung disease in preterm infants. Pediatrics. 109, 330-338 (2002).
- Watterberg, K. L. American Academy of Pediatrics; Committee on Fetus and Newborn. Policy statement-postnatal corticosteroids to prevent or treat bronchopulmonary dysplasia. Pediatrics. 126, 800-808 (2010).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)- dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (2), 42-49 (2009).
- Chou, H. C., Li, Y. T., Chen, C. M. Human mesenchymal stem cells attenuate experimental bronchopulmonary dysplasia induced by perinatal inflammation and hyperoxia. American Journal of Translational Research. 8, 342-353 (2016).
- Chen, C. M., Chou, H. C., Lin, W., Tseng, C. Surfactant effects on the viability and function of human mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo assessment. Stem Cell Research & Therapy. 8, 180 (2017).
- Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80, 415-424 (2016).
- Fleurence, E., et al. Comparative efficacy of intratracheal adeno-associated virus administration to newborn rats. Human Gene Therapy. 16, 1298-1306 (2005).
- Waszak, P., et al. Effect of intratracheal adenoviral vector administration on lung development in newborn rats. Human Gene Therapy. 13, 1873-1885 (2002).
- O'Reilly, M., Thébaud, B. Animal models of bronchopulmonary dysplasia. The term rat models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307, 948 (2014).
- Yu, J., et al. GFP labeling and hepatic differentiation potential of human placenta-derived mesenchymal stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 35, 2299-2308 (2015).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells. Stem Cells. 27, 126-137 (2009).
- Huang, L. T., et al. Effect of surfactant and budesonide on pulmonary distribution of fluorescent dye in mice. Pediatric and Neonatology. 56, 19-24 (2015).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18, 164-172 (2012).
- Yeh, T. F., et al. Intra-tracheal administration of budesonide/surfactant to prevent bronchopulmonary dysplasia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193, 86-95 (2016).
- Nguyen, J. Q., et al. Intratracheal inoculation of Fischer 344 rats with Francisella tularensis. Journal of Visualized Experiments. (127), e56123 (2017).
- de Almeida, P. E., van Rappard, J. R., Wu, J. C. In vivo bioluminescence for tracking cell fate and function. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 663-671 (2011).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49, 3-10 (2011).
