Summary
Terminal neonatal sıçanlarda intratrakeal enjeksiyon yoluyla mezenkimal stromal hücrelerin (MsC) intratrakeal transplantasyonunun yapılan bir protokoldür. Bu teknik, etkinliğini değerlendirmek için kök hücre ve ilaçların yenidoğan sıçan akciğerlerine teslimi için klinik olarak uygun bir seçenektir.
Abstract
Yüksek oksijen konsantrasyonlarına uzun süre maruz kalmak inflamasyona ve akut akciğer hasarına yol açar, bu da insan bronkopulmoner displazisine benzer (BPD). Prematüre bebeklerde, BPD sürfaktan tedavisinin erken kullanımına rağmen önemli bir komplikasyondur, optimal ventilasyon stratejileri, ve noninvaziv pozitif basınç ventilasyon. Pulmoner inflamasyon BPD patogenezinde önemli bir rol oynadığından, kortikosteroid kullanımı bunu önlemek için potansiyel bir tedavi yöntemidir. Bununla birlikte, sistemik kortikosteroid tedavisi genellikle uzun süreli yan etkiler nedeniyle preterm bebekler için tavsiye edilmez. Preklinik çalışmalar ve insan fazı I klinik çalışmalar hiperoksia bağlı akciğer yaralanmalarında ve preterm bebeklerde mezenkimal stromal hücrelerin (MsCs) kullanımının güvenli ve uygulanabilir olduğunu göstermiştir. İntratrakeal ve intravenöz MSC transplantasyonunun neonatal hiperoksik akciğer hasarına karşı koruduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, kök hücrelerin intratrakeal uygulaması ve kombine sürfaktan ve glukokortikoid tedavisi solunum bozuklukları olan yenidoğanların tedavisinde yeni bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Doğumda sıçan akciğerlerinin gelişim evresi 26−28 gebelik haftasında insan akciğerlerinde buna eşdeğerdir. Bu nedenle, yenidoğan sıçanlar etkinliğini değerlendirmek için solunum sıkıntısı olan preterm bebeklere intratrakeal uygulama eğitimi için uygundur. Bu intratrakeal aşılama tekniği kök hücre ve ilaçların akciğerlere teslimi için klinik olarak uygun bir seçenektir.
Introduction
Ek oksijen genellikle solunum sıkıntısı1ile yenidoğan bebeklerin tedavisinde gereklidir. Ancak, bebeklerde hiperoksia tedavisi olumsuz uzun vadeli etkileri vardır. Oksijen yüksek konsantrasyonlarda uzun süreli maruz kalma inflamasyon ve akut akciğer hasarına yol açar, hangi insan bronkopulmoner displazi benzer (BPD)2. BPD erken yüzey aktif tedavi rağmen oluşabilir hiperoksia tedavisinin önemli bir komplikasyondur, optimal ventilasyon prosedürleri, ve prematüre bebeklerde noninvaziv pozitif basınç ventilasyon artan kullanımı. Birçok tedavi stratejileri BPD için bildirilmiştir iken3, bilinen hiçbir tedavi bu komplikasyonu azaltabilir.
Kortikosteroid kullanımı BPD önlemek için potansiyel bir tedaviyöntemidir, pulmoner inflamasyon patogenezinde önemli bir rol oynar çünkü. Ancak, sistemik kortikosteroid tedavisi genellikle uzun süreli yan etkiler nedeniyle preterm bebekler için tavsiye edilmez4,5.
Mezenkimal stromal hücreler (MsCs) pluripotent özelliklere sahip ve kemik, kıkırdak, yağ dokusu, kas vetendonları6 dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri, ayırt edebilirsiniz. MsCs immünomodülatör var, anti-inflamatuar, ve rejeneratif etkileri7, ve hayvan çalışmaları kemirgenler hiperoksia bağlı akciğer yaralanması mscs ve salgılanan bileşenlerin terapötik yararları göstermek8,9. İntratrakeal ve intravenöz MSC transplantasyonunun neonatal hiperoksik akciğer hasarına karşı koruduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, kök hücrelerin intratrakeal uygulama ve kombine sürfaktan ve kortikosteroid tedavisi solunum bozuklukları olan yenidoğantedavisinde potansiyel bir tedavi stratejisi olabilir. Preklinik çalışmalarda yeni doğan sıçanlarda kök hücre ve adeno-ilişkili virüsün intratrakeal uygulaması kullanılmıştır10,11,12. Ancak, tekniğin adım adım sunumu ve nakledilen kök hücrelerin in vivo takibi mevcut değildir. Yenidoğan sıçan, doğumda sıçan akciğerinin saccular evresi 26−28 gebelik haftasında insan akciğerinin ki eşdeğerdir çünkü solunum sıkıntısı olan preterm bebekler de intratrakeal uygulamanın etkilerini incelemek için uygundur13. Sıçan trakeasına uygulama için etkili bir yöntem başarılı pulmoner dağılım için çok önemlidir. Burada sunulan teknik, insanlar için bir model olarak sıçanlar kullanarak neonatal akciğer hastalıklarının tedavisi için hücrelerin ve/veya ilaçların intratrakeal uygulamasının incelenmesine olanak sağlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu prosedür Taipei Tıp Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
NOT: Yeşil floresan protein (GFP) ve ateş böceği luciferase genleri (Fluc) ile transfected İnsan MsC'leri ticari bir şirketten(Tablo Malzemeler)elde edilmiştir.
1. Ateş böceği luciferase ve yeşil floresan protein ile insan MSCs karakterizasyonu
- GFP ve Fluc ile transfected insan MSC'lerini tam ortamda (minimum esaslı orta kartal-alfa modifikasyonu [αMEM], %10−15 fetal sığır serumu [FBS], 2 mM L-glutamin, 1 ng/mL temel FGF ve PSF) ile 37 °C'de doymuş nem ve %5 CO2ile tamamlayın. ~70−90% birleştiğinde geçiş hücreleri.
- Bir floresan faz kontrast mikroskobu(Şekil 1A)altında MSC'leri gözlemleyin ve Fluc ve GFP14'ünifade düzeylerini analiz edin.
- Cd44, CD73, CD90, CD105 dahil CD belirteçlerinin ekspresyonunu akış sitometrisi kullanarak(Şekil 1B)analiz ederek MSC'leri karakterize edin. Alisitler, kondrositler ve osteositler için kök hücrelerin trilineage farklılaşma neden ve trilineage farklılaşma onaylamak(Şekil 1C) von Kossa tarafından, yağ kırmızı O, ve Alcian mavi boyama ticari bir protokol aşağıdaki15,16.
2. Sıçan yavrularının anestezisi
- Zaman tarihli hamile Sprague-Dawley sıçanların dönem vajinal doğum yapmak için izin verin.
- Doğum sonrası 5.
- Bir anestezi odasında gaz anestezisi (yani% 2 isofluran) kullanarak sıçan yavruları anestezi.
- Solunum ve refleksleri kontrol ederek yeterli anesteziyi onaylayın.
NOT: Solunum sığ hale gelmelidir ve refleksler azalmalıdır. Sıçan yavruları bu isofluran konsantrasyonu ile en az ~ 10 dakika boyunca bilinçsiz kalır.
3. İntratrakeal aşılama
- Anestezi yapıldıktan sonra, fare yavrularını ~60° açılı bir entübasyon standında dizginleyin ve dört ekstremitede laboratuvar etiketleme bandı ile yavruları yerinde tutun.
- Baş düzeltmek ve delinme trakeotomi için boyun saptamak için burun altında bant uygulayın.
- Kesi bölgesini (yani boyun) %75 alkol hazırlık pedi ile dezenfekte edin.
- Karotis arterlere zarar vermemek için trakeanın üzerinde mikrosksors ile 0,3 cm dikey orta hat kesisi yapın.
- Bir kanca olmadan kavisli ucu konik cımbız ile trakea bulmak için uzak yağ ve kas katmanları diseksiyon.
- Kavisli uçlu konik cımbızla nefes borusunu tutun.
- 100 μL'lik şırıngayı dik tutun ve inspiratuar faz sırasında 30 G iğne şırıngası ile trakeaya 30 μL normal tuzlu (yani kontrol) veya 30 μL Fluc-GFP etiketli MSC'leri (1 x 105 hücre) yavaşça enjekte edin.
- Kesiyi bir adet 6-0 ipek dikişle kapatın, düğümü mümkün olduğunca küçük bağlayın ve uçları mümkün olduğunca kısa kesti.
- Sıcak tutmak ve onları anestezi kurtarmak için izin vermek için kızılötesi ışık altında veya bir ısıtma yastığı üzerine sıçan yerleştirin.
- Farelerin sıcak, pembe ve fareleri kafese geri döndürmeden önce spontan hareket edebilen olduğunu doğrulayın.
4. MsC'lerin pulmoner dağılımının izlenmesi
- Nakledilen insan MSC'lerini takip etmek için, intraperitoneal olarak msc enjeksiyonundan 15 dk sonra 125 mg/kg vücut ağırlığı dozunda fosfat tamponlu salin (PBS) içinde luciferin potasyum tuzu enjekte edin.
- Burun konileri ile% 2 isoflurane kullanarak sıçanlar anestezik.
- Orta binning, 1 f/stop ve küçük hayvan görüntüleme sistemi(Tablo Malzemeler)kullanarak 26 cm görüş alanı ile luciferin uygulamasından sonra 5-15 s aralıklarla 10 dakika sıralı görüntüler elde edin.
- Görüntüleme yazılımı(Tablo Malzemeler)17kullanarak ilgi otomatik bölgelere dayalı akciğerlerden lüminesans aktivitesi ölçmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neonatal sıçanlar teriminde kök hücrelerin intratrakeal instillasyonunun pulmoner dağılımı ateş böceği luciferase (Fluc) etiketli kök hücreler tarafından belirlendi. MSC'ler Fluc ile etiketlendi ve lentiviral transdüksiyon yoluyla yeşil floresan protein ile etiketlendi. Şekil 1A insan MSC'lerinde yüksek düzeyde GFP ekspresyonu gösterirken, nüfusun %93.7'si akış sitometrisi tarafından saptanan GFP pozitif ekspresyonu göstermiştir. MSC'ler CD belirteçlerinin (cd 44, CD73, CD90 ve CD105) ekspresyonunun ve osteosit, kondrosit ve adipositlere trilinej farklılaşmasının özelliğinin analiz edilmesi ile karakterize edilmiştir (Şekil 1B,C). Nakledilen insan MSC'lerini vivo olarak takip etmek için küçük hayvan görüntüleme sistemi kullanılarak sıçanların lüminesans görüntülemesi yapıldı. Ölçümler ventrally alınmıştır. Sıçanlar yapışkan bant la sabitlendi ve daha sonra PBS'de 125 mg/kg vücut ağırlığı dozunda 30 mg/mL luciferin potasyum tuzu intraperitoneal enjeksiyon uygulandı. Luciferase luciferin ile birleştirir, oksijen, ve ATP, ve bir kimyasal reaksiyon yoluyla ışık üretir, biyolüminesans sonuçlanan18. Görüntüleme işlemi sırasında sıçanlar burun konileri aracılığıyla %2 isofluran kullanılarak anestezi uygulandı. Sıçan görüntüleri luciferin yönetiminden 10 dakika sonra elde edildi. Ardışık görüntüler en az 1 dakika boyunca 5-15 s aralıklarla (zaman gecikmesi yok), orta binning, 1 f/stop ve 26 cm görüş alanı ile elde edildi. Farklı dalga boylarında (560-660 nm) filtrelenen spektral görüntüler dizisinin ölçüm verileri kullanılarak biyolüminesans muhabirin derinliği ve yeri belirlendi. Akciğerlerden gelen lüminesans sinyalleri, daire seçim modundaki otomatik ilgi bölgelerine göre hesaplanmıştır. Normal tuzlu tedavi edilen hayvanlarda ortalama parlaklık yoğunluğu bir değer olarak atandı ve her MSC tedavi edilen hayvan için veriler normal tuzlu tedavi edilen hayvanlara normalleştirildi.
Şekil 2A sıçan akciğerlerindeki parlaklığın temsili bir görüntüsünü gösterir. Normal salin ile tedavi edilen sıçanların akciğer bölgelerinde lüminesans gözlenmedi. MSK ile tedavi edilen sıçanlar trakea ve merkezi akciğer bölgelerinde parlaklık sergiledi. Lüminesans yoğunluğunun ölçülmesi, MSC'ler ile tedavi edilen sıçanların sadece normal tuzlu ile tedavi edilen sıçanlarla karşılaştırıldığında, lüminesans aktivitesinde yaklaşık 13 kat artış sergilediğini ortaya koymuştur(Şekil 2B).
Şekil 1: İnsan MSC'lerinin karakterizasyonu.
(A) Lentivirus transdüksiyonundan sonra insan MSC'lerinde GFP ekspresyonu. (B) İnsan MSC'ye özgü CD işaretçilerin ifadesi (cd 44, CD73, CD90, CD105). (C) İnsan MSC'lerinin trilineage farklılaşması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Küçük hayvan görüntüleme sistemi kullanılarak lüminesansın pulmoner dağılımının izlenmesi.
(A) Sıçanlarda etiketli MSC'lerin pulmoner dağılımının temsili bir görüntüsü. Normal salin ile tedavi edilen sıçanların akciğer bölgesinde lüminesans gözlenmedi. İnsan MSC'leri ile tedavi edilen sıçanlar trakeal ve akciğer bölgelerinde parlaklık sergilediler. (B) Sıçan akciğerlerindeki lüminesans aktivitesinin niceliği (n = 4). Hata çubukları standart sapmayı temsil ediyor. Ölçek Y ekseninde foton/s/cm2/sr'dir. **P < 0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Solunum sıkıntısı olan yenidoğan bebekler genellikle intratrakeal yüzey aktif ve /veya kortikosteroid tedavisi gerektirir19. İnsan fazı I klinik çalışmalar preterm bebeklerde intratrakeal MSCs güvenliğini göstermiştir8. Bu çalışmalar, ilaçların intratrakeal uygulamasısolunum sıkıntısı olan yenidoğan bebekler için önemli bir seçenek olduğunu göstermektedir. Model özellikleri doğrudan insanlar için uygun ise Hayvan modeli çalışmaları en yararlıdır. Dönem yenidoğan sıçanlar erken akciğer hasarı ve gelişim çalışmaları için yararlı modellerdir. Ancak, yenidoğan sıçanların üst hava yolu yetişkin sıçanlarda yapılan doğrudan trakeal entübasyon ait çok küçük20. Trakeotomi yoluyla intratrakeal aşılama, kök hücrelerin veya ilaçların neonatal sıçan akciğerlerine intratrakeal uygulanması için uygulanabilir bir alternatif tekniktir.
In vivo biyolüminesans görüntüleme in vitro ve nakledilen kök hücrenin kaderini in vivo izleme için değerli bir araçtır, bir luciferase muhabiri protein kurucu ifadesi ile hücreleri etiketleme tarafından gerçekleştirilir21. Luciferase enzimleri bir substrat oksidasyon katalize (luciferin), ve reaksiyon un bir ürünü olarak ışık serbest. Biyolüminesans yoluyla görsel görüntüleme, canlı organizmalardaki hastalık süreçlerinin noninvaziv ve gerçek zamanlı analizini sağlar. Bioluminescence görüntüleme,MSC'leringöç, sağkalım ve morfolojik farklılaşmasının in vivo izlenmesi için kullanılmıştır 22 . Bu çalışmada in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak akciğerlerde nakledilen kök hücrelerin dağılımı değerlendirildi. In vivo biyolüminesans görüntüleme hücre içeren parçacıkların izlenmesine dayanır. Bunlar hücre ölümü üzerine fagositositolabileceğinden, konak makrofajlarının izlenmesine yol açabilir. Bu nedenle lüminesans luciferin uygulamasından sonra 10 dk'dan az ölçüldü.
Bu çalışmanın sınırlaması, hayvanlar arası varyasyonun IVIS görüntülerinde algılandığıdır. Bu nedenle, akciğerlerden gelen lüminesans sinyalleri otomatik ilgi bölgelerine göre hesaplanmış ve normal tuzlu tedavi edilen hayvanlarda ortalama lüminesans yoğunluğunormalleştirilmeye başlanmıştır.
Doğru ve etkili intratrakeal aşılama yenidoğan sıçanlarda MSC etkinliğinin değerlendirilmesi için gereklidir, ancak diğer tıbbi tedavilerin test edilmesinde de yararlı olabilir. Bu nedenle, bu sıçan modeli tekniği pulmoner uygulamaların çeşitli ayarlanabilir olabilir. Kök hücre veya ilaçların intratrakeal aşılama pulmoner hastalıkların nispeten kolay ve uygun maliyetli bir tedavi temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Meridigen Biotech Co, Ltd Taipei, Tayvan (A-109-008) bir hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
- Ramanathan, R., Bhatia, J. J., Sekar, K., Ernst, F. R. Mortality in preterm infants with respiratory distress syndrome treated with poractant alfa, calfactant or beractant: a retrospective study. Journal of Perinatology. 33, 119-125 (2013).
- Gien, J., Kinsella, J. P. Pathogenesis and treatment of bronchopulmonary dysplasia. Current Opinion in Pediatrics. 23, 305-313 (2011).
- Pasha, A. B., Chen, X. Q., Zhou, G. P. Bronchopulmonary dysplasia: Pathogenesis and treatment. Experimental and Therapeutic. 16, 4315-4321 (2018).
- Committee on Fetus and Newborn. Postnatal corticosteroids to treat or prevent chronic lung disease in preterm infants. Pediatrics. 109, 330-338 (2002).
- Watterberg, K. L. American Academy of Pediatrics; Committee on Fetus and Newborn. Policy statement-postnatal corticosteroids to prevent or treat bronchopulmonary dysplasia. Pediatrics. 126, 800-808 (2010).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)- dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (2), 42-49 (2009).
- Chou, H. C., Li, Y. T., Chen, C. M. Human mesenchymal stem cells attenuate experimental bronchopulmonary dysplasia induced by perinatal inflammation and hyperoxia. American Journal of Translational Research. 8, 342-353 (2016).
- Chen, C. M., Chou, H. C., Lin, W., Tseng, C. Surfactant effects on the viability and function of human mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo assessment. Stem Cell Research & Therapy. 8, 180 (2017).
- Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80, 415-424 (2016).
- Fleurence, E., et al. Comparative efficacy of intratracheal adeno-associated virus administration to newborn rats. Human Gene Therapy. 16, 1298-1306 (2005).
- Waszak, P., et al. Effect of intratracheal adenoviral vector administration on lung development in newborn rats. Human Gene Therapy. 13, 1873-1885 (2002).
- O'Reilly, M., Thébaud, B. Animal models of bronchopulmonary dysplasia. The term rat models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307, 948 (2014).
- Yu, J., et al. GFP labeling and hepatic differentiation potential of human placenta-derived mesenchymal stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 35, 2299-2308 (2015).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells. Stem Cells. 27, 126-137 (2009).
- Huang, L. T., et al. Effect of surfactant and budesonide on pulmonary distribution of fluorescent dye in mice. Pediatric and Neonatology. 56, 19-24 (2015).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18, 164-172 (2012).
- Yeh, T. F., et al. Intra-tracheal administration of budesonide/surfactant to prevent bronchopulmonary dysplasia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193, 86-95 (2016).
- Nguyen, J. Q., et al. Intratracheal inoculation of Fischer 344 rats with Francisella tularensis. Journal of Visualized Experiments. (127), e56123 (2017).
- de Almeida, P. E., van Rappard, J. R., Wu, J. C. In vivo bioluminescence for tracking cell fate and function. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 663-671 (2011).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49, 3-10 (2011).
