Summary
描述是通过期期新生儿大鼠的四边形注射进行间质质质细胞（MSCs）的腹内移植的协议。这项技术是将干细胞和药物移植到新生儿大鼠肺以评估其疗效的临床可行选择。
Abstract
长时间接触高浓度的氧气会导致炎症和急性肺损伤，这类似于人类支气管肺发育不良（BPD）。在早产儿中，尽管早期使用表面活性剂疗法、最佳通气策略和非侵入性正压通气，但BPD是一个主要并发症。由于肺炎在BPD的发病机制中起着至关重要的作用，皮质类固醇的使用是预防它的潜在治疗方法之一。然而，由于长期不良反应，通常不建议早产儿进行全身皮质类固醇治疗。临床前研究和人类第一阶段临床试验表明，在高氧引起的肺损伤和早产儿中使用间质期频闪细胞（MSCs）是安全和可行的。内切和静脉MSC移植已被证明可以预防新生儿高氧肺损伤。因此，干细胞的腹内给药和表面活性剂和糖皮质激素联合治疗已成为治疗新生儿呼吸系统疾病的新策略。大鼠肺出生时的发育阶段相当于妊娠26~28周时人类肺的发育阶段。因此，新生大鼠适合研究腹内给患呼吸窘迫的早产儿，以评估其疗效。这种中切内注射技术是将干细胞和药物移植到肺部的临床可行选择。
Introduction
治疗患有呼吸窘迫的新生儿时，通常需要补充氧气。然而，婴儿的超氧治疗有长期不利影响。长时间接触高浓度的氧气会导致炎症和急性肺损伤，这类似于人类支气管肺发育不良（BPD）2。BPD 是高氧治疗的主要并发症，尽管早产儿有早期表面活性剂治疗、最佳的通气程序以及使用非侵入性正压通气的增加，但可能会发生这种情况。虽然许多治疗策略已经报告为BPD3，没有已知的治疗可以减少这种并发症。
皮质类固醇的使用是预防BPD的一种潜在治疗方法，因为肺炎在其发病机制中起着至关重要的作用。然而，由于长期不良反应,4，5，通常不建议早产儿进行全身皮质类固醇治疗。4
脑膜状细胞（MSCs）具有多能性特征，可以分化成各种细胞类型，包括骨骼、软骨、脂肪组织、肌肉和肌腱6。MSC具有免疫调节、抗炎和再生作用7，动物研究表明MSCs及其分泌成分在啮齿动物8、9,中高氧引起的肺部损伤中具有治疗作用。内切和静脉MSC移植已被证明可以预防新生儿高氧肺损伤。因此，干细胞的腹内给药和表面活性剂和皮质类固醇联合治疗可能是治疗新生儿呼吸系统疾病的潜在治疗策略。临床前研究在新生大鼠10、11、12,11中使用了干细胞和腺相关病毒的腹内给给。然而，该技术的分步演示和移植干细胞的体内跟踪是不可用的。新生大鼠适合研究腹内给药对患有呼吸窘迫的早产儿的影响，因为大鼠出生时肺的囊期相当于妊娠13的26-28周的人肺的囊期。一种有效的方法，为大鼠气管的药而，是成功进行肺分配的关键。这里介绍的技术允许研究细胞和/或药物的腹内给药，以大鼠为人类模型治疗新生儿肺病。
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Protocol
这一程序得到了台北医科大学动物护理与使用委员会的批准。
注：人类MSC与绿色荧光蛋白（GFP）和萤火虫荧光酶基因（Fluc）稳定地转染，这些基因是从一家商业公司（材料表）获得的。
1. 具有萤火虫荧光酶和绿色荧光蛋白的人类MSC特征
- 在37°C的饱和湿度和5%的CO2中，保持与GP和F1的人类MSC在完整介质中（最低必需的中等鹰-阿尔法修饰[[MEM]，辅以10~15%的胎儿牛血清[FBS]，2mM L-谷氨酰胺，1纳克/mL基本FGF和PSF）。2在±70~90%汇合下通过细胞。
- 在荧光相对比显微镜下观察MSC（图1A），并分析氟化物和GPC14的表达水平。
- 通过使用流式细胞学分析CD44、CD73、CD90、CD105等CD标记的表达来描述MSC（图1B）。诱导干细胞分化到脂肪细胞，软骨细胞和骨细胞，并确认分系分化（图1C）由冯科萨，油红O，和阿尔西安蓝色染色后，商业协议15，16。15,16
2. 大鼠幼崽麻醉
- 允许时间过时的怀孕斯普拉格-道利大鼠在分娩时进行阴道分娩。
- 产后第5天，将老鼠幼崽从笼子里取出。
- 使用麻醉室中的气体麻醉（即 2% 异氟）麻醉大鼠幼崽。
- 通过检查呼吸和反射来确认足够的麻醉。
注意：呼吸应该变得浅，反射应该减少。鼠幼幼保持无意识至少+10分钟与这种异氟浓度。
3. 内切注射
- 麻醉后，将大鼠幼崽抑制在倾斜为 [60° 的插管支架上]，并用实验室标签胶带将幼崽固定到位。四肢上贴着实验室标签胶带。
- 在鼻子下面涂抹胶带固定头部，并精确定位颈部进行穿刺气管切除术。
- 用 75% 的酒精准备垫对切口区域（即颈部）进行消毒。
- 用微切口在气管上方进行 0.3 厘米垂直中线颈部切口，以避免损坏卡罗蒂动脉。
- 解剖脂肪和肌肉层，以定位气管与弯曲尖端锥形钳子没有钩。
- 用弯曲的尖端锥形钳子握住气管。
- 直立握住 100 μL 注射器，在吸入阶段通过 30 G 针头注射器，通过 30 G 针注射器缓慢将 30 μL 的正常盐水（即控制）或 30 μL 标有 MSC（1 x 10 5 细胞）的 Fluc-GFP（1 x 105 细胞）注射到气管中。
- 用一个6-0的丝线缝关闭切口，尽可能小地打结，并尽可能缩短切口。
- 将大鼠放在红外光下或加热垫上以保暖，让它们从麻醉中恢复。
- 确认大鼠是温暖，粉红色，并有能力自发运动，然后再返回笼子的老鼠。
4. 监测MSC的肺分布
- 为了跟踪移植的人类MSCs，在MSC注射后15分钟以125毫克/千克体重的剂量在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中给大鼠注射荧光素钾盐。
- 通过鼻锥用2%等氟兰麻醉大鼠。
- 使用小动物成像系统（材料表）在荧光素施用后 10 分钟以 5~15 s 的间隔获取顺序图像，使用中等装箱、1 f/stop 和 26 厘米的视野。
- 使用成像软件（材料表）17，根据感兴趣的自动区域量化肺部的发光活性。
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Representative Results
新生儿大鼠中干细胞的脑内注入的肺分布由萤火虫荧光酶（Fluc）标记的干细胞确定。MSC 被标记为 Fluc，并通过延日病毒转导标记绿色荧光蛋白。 图1A 显示人类MSC中的GPC表达水平很高，93.7%的种群显示流量细胞学检测到的GP阳性表达。MSC的特点是分析CD标记（即CD 44、CD73、CD90和CD105）的表达，以及分线分化成骨细胞、软细胞和脂肪细胞的能力（图1B，C）。为了跟踪体内移植的人类MSC，使用小动物成像系统对大鼠进行发光成像。测量是通风进行的。用胶带固定大鼠，随后在PBS中注射30毫克/mL的荧光素钾盐，剂量为125毫克/千克体重。路西法酶与荧光素、氧气和ATP结合，通过化学反应产生光，产生生物发光18。在成像过程中，大鼠使用通过鼻锥施用的2%异氟兰麻醉。鼠图像是在荧光素施用后10分钟采集的。以 5~15 s 的间隔（无时间延迟）采集顺序图像至少 1 分钟，具有中等装箱、1 f/stop 和 26 厘米的视野。利用不同波长（560~660 nm）过滤的光谱图像序列的测量数据，确定了生物发光测量器的深度和位置。来自肺的发光信号是根据圆选择模式下感兴趣的自动区域计算的。正常盐水处理动物的平均发光强度为1，每个MSC处理动物的数据与正常盐水处理动物的数据被规范化为正常盐水处理动物。
图 2A显示了大鼠肺部发光的代表性图像。在用正常盐水治疗的大鼠的肺区域未发现发光。用MSC治疗的大鼠在气管和中肺区域显示出发光。发光强度的量化显示，与仅使用普通盐水治疗的大鼠相比，使用MSC治疗的大鼠的发光活性增加了约13倍（图2B）。
图1：人类MSC的特征。
（A） 扁病毒转导后人类MSC中的GPC表达。（B） 表示人类MSC特异性CD标记（即CD44、CD73、CD90、CD105）。（C） 人类MSCs的会系 区分。请点击这里查看这个数字的较大版本。
图2：使用小动物成像系统监测发光的肺分布。
（A） 大鼠标记的MSC肺分布的代表性图像。在用正常盐水治疗的大鼠的肺区未发现发光。用人类MSC治疗的老鼠在气管和肺区域显示出发光。（B） 大鼠肺发光活性的定量（n = 4）。误差条表示标准偏差。刻度为光子/s/cm2/sr 在 Y 轴中。**P < 0.01. 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
患有呼吸窘迫的新生儿通常需要腹内表面活性剂和/或皮质类固醇治疗19。人类第一阶段的临床试验已经证明了早产儿8期中腹间MSC的安全性。这些研究表明，对患有呼吸窘迫的新生儿来说，在血管内服用药物是一个重要的选择。如果模型特征与人类直接相关，动物模型研究最有帮助。定期新生大鼠是早产肺损伤和发育研究的有用模型。然而，新生儿大鼠的上气道太小，不能像20岁的成年大鼠那样直接插管。通过气管切除术进行中切内注射是将干细胞或药物给新生儿大鼠肺部的特拉切内给药的可行替代技术。
体内生物发光成像是体外和体内监测移植干细胞命运的宝贵工具，通过用荧光素酶报告蛋白21的构成表达标记细胞来完成。路西法酶催化基底（路西法林）的氧化，并释放光作为反应的产物。通过生物发光进行视觉成像，可以对生物体中的疾病过程进行非侵入性和实时分析。生物发光成像用于在体内监测MSC22的迁移、生存和形态分化。这项研究使用体内成像系统评估了移植干细胞在肺部的分布情况。体内生物发光成像依赖于对细胞内粒子的监测。因为这些可能是细胞死亡时吞噬的，它可能导致宿主巨噬细胞的跟踪。因此，在荧光素施用后不到10分钟测量发光。
本研究的局限性是，在 IVIS 图像中感知到动物间变异。因此，来自肺部的发光信号是根据感兴趣的自动区域计算，并使正常盐水处理动物的平均发光强度标准化为一个。
正确有效的内切内注射对于评估新生儿大鼠的MSC疗效至关重要，但它可能可用于测试其他药物治疗。因此，这种大鼠模型技术可以调节到各种肺应用。干细胞或药物的内切内注射是一种相对容易和具有成本效益的肺病治疗。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了台湾台北美利根生物科技有限公司（A-109-008）的赠款的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
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