Summary
Beskrevet er en protokoll for å utføre intratrakeal transplantasjon av mesenchymale stromalceller (MSCer) gjennom intratrakeal injeksjon i term neonatal rotter. Denne teknikken er et klinisk levedyktig alternativ for levering av stamceller og legemidler til neonatal rottelunger for å evaluere effekten.
Abstract
Langvarig eksponering for høye konsentrasjoner av oksygen fører til betennelse og akutt lungeskade, som ligner på humant bronkopulmonal dysplasi (BPD). Hos premature spedbarn er BPD en stor komplikasjon til tross for tidlig bruk av overflateaktivt behandling, optimal ventilasjonsstrategier og ikke-invasiv positiv trykkventilasjon. Fordi lungebetennelse spiller en avgjørende rolle i patogenesen av BPD, er kortikosteroidbruk en potensiell behandling for å forhindre det. Likevel anbefales systemisk kortikosteroidbehandling vanligvis ikke for premature spedbarn på grunn av langsiktige bivirkninger. Prekliniske studier og kliniske studier i human fase I viste at bruk av mesenchymale stromalceller (MSCer) ved hyperoksiaindusert lungeskader og hos premature spedbarn er trygt og mulig. Intratrakeal og intravenøs MSC-transplantasjon har vist seg å beskytte mot neonatal hyperoksisk lungeskade. Intratrakeal administrering av stamceller og kombinert overflateaktivt middel og glukokortikoidbehandling har derfor dukket opp som en ny strategi for å behandle nyfødte med respiratoriske lidelser. Utviklingsstadiet av rottelunger ved fødselen tilsvarer det hos humane lunger ved 26-28 svangerskapsuke. Derfor er nyfødte rotter egnet for å studere intratrakeal administrasjon til premature spedbarn med respirasjonssvikt for å evaluere effekten. Denne intratrakeale instillasjonsteknikken er et klinisk levedyktig alternativ for levering av stamceller og legemidler i lungene.
Introduction
Ekstra oksygen er ofte nødvendig for å behandle nyfødte spedbarn med respirasjonsnød1. Hyperoksikbehandling hos spedbarn har imidlertid negative langsiktige effekter. Langvarig eksponering for høye konsentrasjoner av oksygen fører til betennelse og akutt lungeskade, som ligner på humant bronkopulmonal dysplasi (BPD)2. BPD er en stor komplikasjon av hyperoksikbehandling som kan oppstå til tross for tidlig overflateaktivt behandling, optimal ventilasjonsprosedyrer og økt bruk av ikke-invasiv positiv trykkventilasjon hos premature spedbarn. Mens mange behandlingsstrategier er rapportert for BPD3,kan ingen kjent terapi redusere denne komplikasjonen.
Kortikosteroid bruk er en potensiell behandling for å forhindre BPD, fordi lungebetennelse spiller en avgjørende rolle i patogenesen. Systemisk kortikosteroidbehandling anbefales imidlertid vanligvis ikke for premature spedbarn på grunn av langtidsvirkninger4,5.
Mesenchymale stromalceller (MSCer) har pluripotente egenskaper og kan skille seg inn i ulike celletyper, inkludert bein, brusk, fettvev, muskler og sener6. MsCer har immunmodulerende, antiinflammatoriske og regenerative effekter7,og dyrestudier viser de terapeutiske fordelene ved MSCer og deres utskilte komponenter i hyperoksia-indusert lungeskade hos gnagere8,,9. Intratrakeal og intravenøs MSC-transplantasjon har vist seg å beskytte mot neonatal hyperoksisk lungeskade. Intratrakeal administrering av stamceller og kombinert overflateaktivt middel og kortikosteroidbehandling kan derfor være en potensiell behandlingsstrategi for behandling av nyfødte med respirasjonsforstyrrelser. Prekliniske studier har brukt intratrakeal administrering av stamceller og adeno-assosiert virus hos nyfødte rotter10,,11,,12. En trinnvis presentasjon av teknikken og in vivo-sporingen av de transplanterte stamcellene er imidlertid ikke tilgjengelig. Den nyfødte rotten er egnet for å studere effekten av intratrakeal administrasjon på premature spedbarn med respirasjonssvikt fordi det sakulære stadiet av rottelungen ved fødselen tilsvarer den for den menneskelige lunge ved 26-28 uke av svangerskapet13. En effektiv metode for administrasjon i rotterøret er avgjørende for vellykket lungefordeling. Teknikken som presenteres her gjør det mulig for studiet av intratrakeal administrering av celler og/ eller legemidler til behandling av neonatale lungesykdommer ved hjelp av rotter som modell for mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne prosedyren ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved Taipei Medical University.
MERK: Humane MSCer ble stabilt transfisert med grønt fluorescerende protein (GFP) og firefly luciferase gener (Fluc) ble hentet fra et kommersielt selskap (Tabell over materialer).
1. Karakterisering av humane MSCer med firefly luciferase og grønt fluorescerende protein
- Opprettholde menneskelige MSCer transfected med GFP og Fluc i komplette medier (minimum essensiell medium eagle-alfa modifikasjon [αMEM], supplert med 10-15% foster storfe serum [FBS], 2 mM L-glutamin, 1 ng / ml grunnleggende FGF, og PSF) ved 37 ° C med mettet fuktighet og 5% CO2. Passasjeceller ved ~70−90% samløpet.
- Observer MSCer under et fluorescensfasekontraskop (figur 1A) og analyser uttrykksnivåene til Fluc og GFP14.
- Karakterisere MSCs ved å analysere uttrykket av CD-markører inkludert CD44, CD73, CD90, CD105 ved hjelp av flow cytometri (Figur 1B). Induser trilineage differensiering av stamceller til adicytter, chondrocytes, og osteocytter, og bekreft trilineage differensiering (Figur 1C) av von Kossa, olje rød O, og Alcian blå flekker etter en kommersiellprotokoll 15,16.
2. Bedøvelse av rottevalper
- La tidsdatert gravide Sprague-Dawley rotter levere vaginalt på sikt.
- Fjern rottevalper fra buret på postnatal dag 5.
- Bedøve rotteungene ved hjelp av gassbedøvelse (dvs. 2% isofluran) i et anestesikammer.
- Bekreft tilstrekkelig anestesi ved å kontrollere pust og reflekser.
MERK: Pusten skal bli grunn og reflekser bør avta. Rottevalper forblir bevisstløs i minst ~ 10 min med denne isoflurankonsentrasjonen.
3. Intratrakeal instillasjon
- Når bedøvet, hold rottevalper på en intubasjonsstativ vinklet på ~ 60 ° og hold valper på plass med laboratoriemerking tape på alle fire lemmer.
- Påfør tape under nesen for å fikse hodet og finne nakken for punktering trakeotomi.
- Desinfiser snittområdet (dvs. hals) med en 75% alkohol prep pad.
- Lag et 0,3 cm vertikalt mellomtonehalssnitt over luftrøret med mikroscissors for å unngå å skade carotis arteriene.
- Dissekere fett og muskel lag unna for å finne luftrøret med buet spissen konisk pinsett uten en krok.
- Hold luftrøret med den buede spissen konisk pinsett.
- Hold en 100 μL sprøyte oppreist og injiser 30 μL normal saltvann (dvs. kontroll) eller 30 μL fluc-GFP-merkede mscer (1 x10 5 celler) i luftrøret gjennom en 30 G sprøyte under inspirerende fase.
- Lukk snittet med en 6-0 silkestm, bind knuten så liten som mulig, og kutt endene så korte som mulig.
- Plasser rotter under infrarødt lys eller på en varmepute for å holde varmen og la dem komme seg fra anestesi.
- Bekreft at rottene er varme, rosa og i stand til spontan bevegelse før de returnerer rottene til buret.
4. Overvåking av lungefordelingen av mscs
- For å spore transplanterte humane msCer, injiser rotter intraperitonealt med luciferinkaliumsalt i fosfatbufret saltvann (PBS) i en dose på 125 mg/kg kroppsvekt 15 min etter MSC-injeksjon.
- Bedøve rottene ved hjelp av 2% isofluran gjennom nesekjegler.
- Få sekvensielle bilder med intervaller på 5–15 s 10 minutter etter administrering av luciferin med middels binning, 1 f/stopp og et 26 cm synsfelt ved hjelp av et bildesystem for små dyr (Tabell over materialer).
- Kvantifiser luminescensaktiviteten fra lungene basert på de automatiske interesseområdene ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare (Tabell over materialer)17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lungefordelingen av intratrakeal instillasjon av stamceller i begrepet nyfødte rotter ble bestemt av firefly luciferase (Fluc)-merkede stamceller. MsCs ble merket med Fluc og merket med grønt fluorescerende protein gjennom lentiviral transduksjon. Figur 1A viser et høyt nivå av GFP-uttrykk hos menneskelige msCer, og 93,7 % av befolkningen viste GFP-positivt uttrykk som ble påvist av strømningscytometri. MsCs ble preget av å analysere uttrykket av CD-markører (dvs. CD 44, CD73, CD90 og CD105) og evnen til trilineage differensiering i osteocytter, kondrocytter, og adipocytes (Figur 1B, C). For å spore de transplanterte humane MSCs in vivo, ble luminescensavbildning av rotter utført ved hjelp av et lite dyr bildesystem. Målingene ble tatt ventrally. Rottene ble festet med tape og deretter ble det administrert en intraperitoneal injeksjon på 30 mg/ml luciferinkaliumsalt i PBS med en dose på 125 mg/kg kroppsvekt. Luciferase kombinerer med luciferin, oksygen og ATP, og genererer lys gjennom en kjemisk reaksjon, noe som resulterer i bioluminescens18. Under bildebehandlingsprosedyren ble rottene bedøvet ved hjelp av 2 % isofluran administrert gjennom nesekjegler. Rottebilder ble kjøpt 10 minutter etter luciferin administrasjon. Sekvensielle bilder ble anskaffet med 5-15 s intervaller (ingen tidsforsinkelse) i minst 1 min, med middels binning, 1 f / stopp, og et 26 cm synsfelt. Ved hjelp av måledata fra en sekvens av spektrale bilder filtrert ved forskjellige bølgelengder (560–660 nm), ble dybden og plasseringen til den bioluminescerende reporteren bestemt. Luminescence signaler fra lungene ble beregnet basert på de automatiske områdene av interesse i sirkelvalgmodus. Gjennomsnittlig luminescensintensitet hos normale saltvannsbehandlede dyr ble tildelt en verdi på ett, og data for hvert MSC-behandlede dyr ble normalisert til de av normale saltvannbehandlede dyr.
Figur 2A viser et representativt bilde av luminescens i rottelungene. Ingen luminescens ble observert i lungeområdene til rotter behandlet med normal saltvann. Rottene behandlet med mscs viste luminescens i luftrøret og sentrale lungeregioner. Kvantifisering av luminescensintensiteten viste at rotter behandlet med mscer viste en ca. 13 ganger økning i luminescensaktivitet, sammenlignet med rotter behandlet med normal saltvann alene (figur 2B).
Figur 1: Karakterisering av menneskelige msCer.
(A) GFP uttrykk i menneskelige msCs etter lentivirus transduction. (B) Uttrykk for humane MSC-spesifikke CD-markører (dvs. CD 44, CD73, CD90, CD105). (C)Trilineage differensiering av menneskelige MSCer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Overvåking av lungefordeling av luminescens ved hjelp av et bildesystem for små dyr.
(A) Et representativt bilde av lungefordelingen av de merkede mscene hos rotter. Ingen luminescens ble observert i lungeområdet av rotter behandlet med normal saltvann. Rotter behandlet med humane mscer viste luminescens i trakeal- og lungeområdene. (B) Kvantifisering av luminescensaktivitet i rottelungene (n = 4). Feilfeltene representerer standardavvik. Vekten er fotoner/s/cm2/sri Y-aksen. **P < 0,01. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nyfødte spedbarn med respirasjonssvikt krever vanligvis intratrakeal overflateaktivt middel og/eller kortikosteroidbehandling19. Kliniske studier i human fase I har vist sikkerheten til intratrakeale mscer hos premature spedbarn8. Disse studiene tyder på at intratrakeal administrering av legemidler er et viktig alternativ for nyfødte spedbarn med respiratorisk nød. Dyremodellstudier er mest nyttige hvis modellfunksjonene er direkte relevante for mennesker. Term nyfødte rotter er nyttige modeller for preterm lungeskade og utviklingsstudier. Imidlertid er den øvre luftveiene av nyfødte rotter for liten til å tillate direkte trakeal intubasjon som utføres hos voksne rotter20. Intratrakeal instillasjon gjennom trakeotomi er en mulig alternativ teknikk for intratrakeal administrering av stamceller eller legemidler til neonatale rottelunger.
In vivo bioluminescence imaging er et verdifullt verktøy for in vitro og in vivo overvåking av skjebnen til den transplanterte stamcelle, oppnås ved å merke celler med det konstitutive uttrykket av en luciferase reporter protein21. Luciferase enzymer katalyser oksidasjon av et substrat (luciferin), og slipp lys som et produkt av reaksjonen. Visuell avbildning gjennom bioluminescens tillater en ikke-invasiv og sanntidsanalyse av sykdomsprosesser i levende organismer. Bioluminescence imaging ble brukt til in vivo overvåking av migrasjon, overlevelse og morfologiske differensiering av MSCs22. Denne studien evaluerte fordelingen av transplanterte stamceller i lungene ved hjelp av et in vivo-bildesystem. In vivo bioluminescence imaging er avhengig av overvåking av celleholdige partikler. Fordi disse kan være fagocytosed ved celledød, kan det føre til sporing av vertsmakrofager. Derfor ble luminescens målt mindre enn 10 minutter etter administrering av luciferin.
Begrensningen av denne studien er at interanimal variasjon ble oppfattet i IVIS-bildene. Derfor ble luminescenssignalene fra lungene beregnet basert på de automatiske interesseområdene og normaliseringen av gjennomsnittlig luminescensintensitet til en hos normale saltvannsbehandlede dyr.
Korrekt og effektiv intratrakeal instillasjon er avgjørende for evaluering av MSC-effekt hos nyfødterotter, men det kan også være nyttig for testing av andre medisinske behandlinger. Derfor kan denne rottemodellteknikken være justerbar til en rekke lungeapplikasjoner. Intratrakeal instillasjon av stamceller eller legemidler representerer en relativt enkel og kostnadseffektiv behandling av lungesykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble delvis støttet av et stipend fra Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan (A-109-008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
- Ramanathan, R., Bhatia, J. J., Sekar, K., Ernst, F. R. Mortality in preterm infants with respiratory distress syndrome treated with poractant alfa, calfactant or beractant: a retrospective study. Journal of Perinatology. 33, 119-125 (2013).
- Gien, J., Kinsella, J. P. Pathogenesis and treatment of bronchopulmonary dysplasia. Current Opinion in Pediatrics. 23, 305-313 (2011).
- Pasha, A. B., Chen, X. Q., Zhou, G. P. Bronchopulmonary dysplasia: Pathogenesis and treatment. Experimental and Therapeutic. 16, 4315-4321 (2018).
- Committee on Fetus and Newborn. Postnatal corticosteroids to treat or prevent chronic lung disease in preterm infants. Pediatrics. 109, 330-338 (2002).
- Watterberg, K. L. American Academy of Pediatrics; Committee on Fetus and Newborn. Policy statement-postnatal corticosteroids to prevent or treat bronchopulmonary dysplasia. Pediatrics. 126, 800-808 (2010).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)- dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (2), 42-49 (2009).
- Chou, H. C., Li, Y. T., Chen, C. M. Human mesenchymal stem cells attenuate experimental bronchopulmonary dysplasia induced by perinatal inflammation and hyperoxia. American Journal of Translational Research. 8, 342-353 (2016).
- Chen, C. M., Chou, H. C., Lin, W., Tseng, C. Surfactant effects on the viability and function of human mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo assessment. Stem Cell Research & Therapy. 8, 180 (2017).
- Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80, 415-424 (2016).
- Fleurence, E., et al. Comparative efficacy of intratracheal adeno-associated virus administration to newborn rats. Human Gene Therapy. 16, 1298-1306 (2005).
- Waszak, P., et al. Effect of intratracheal adenoviral vector administration on lung development in newborn rats. Human Gene Therapy. 13, 1873-1885 (2002).
- O'Reilly, M., Thébaud, B. Animal models of bronchopulmonary dysplasia. The term rat models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307, 948 (2014).
- Yu, J., et al. GFP labeling and hepatic differentiation potential of human placenta-derived mesenchymal stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 35, 2299-2308 (2015).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells. Stem Cells. 27, 126-137 (2009).
- Huang, L. T., et al. Effect of surfactant and budesonide on pulmonary distribution of fluorescent dye in mice. Pediatric and Neonatology. 56, 19-24 (2015).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18, 164-172 (2012).
- Yeh, T. F., et al. Intra-tracheal administration of budesonide/surfactant to prevent bronchopulmonary dysplasia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193, 86-95 (2016).
- Nguyen, J. Q., et al. Intratracheal inoculation of Fischer 344 rats with Francisella tularensis. Journal of Visualized Experiments. (127), e56123 (2017).
- de Almeida, P. E., van Rappard, J. R., Wu, J. C. In vivo bioluminescence for tracking cell fate and function. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 663-671 (2011).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49, 3-10 (2011).
