JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

استخدام Elegans Caenorhabditis إلى الشاشة لتفاعلات Chaperone الأنسجة محددة

Published: June 07, 2020
doi:
10.3791/61140
, , ,
1Department of Life Sciences,Ben-Gurion University of the Negev

Summary

لدراسة مرافق مرافق ومرافق التفاعلات الركيزة، ونحن أداء شاشات التفاعل الاصطناعية في Elegans Caenorhabditis باستخدام تدخل الجيش الملكي النيبالي في تركيبة مع الطفرات الخفيفة أو الإفراط في التعبير عن المرافقين ورصد خلل البروتين الأنسجة محددة على مستوى الكائن الحي.

Abstract

للطي الصحيح وتجميع البروتينات ومجمعات البروتين ضرورية لوظيفة الخلوية. تستخدم الخلايا مسارات مراقبة الجودة التي تصحح البروتينات التالفة أو تعزلها أو تقضي عليها للحفاظ على بروتيوم صحي ، وبالتالي ضمان البروتيستاسيس الخلوي ومنع المزيد من تلف البروتين. بسبب الوظائف الزائدة داخل شبكة البروتيوستاسي ، يؤدي فحص الأنماط الظاهرية القابلة للكشف باستخدام الضربة القاضية أو الطفرات في الجينات ترميز المرافقين في الكائن الحي متعدد الخلايا Caenorhabditis elegans إلى الكشف عن الأنماط الظاهرية البسيطة أو معدومة في معظم الحالات. لقد وضعنا استراتيجية فحص مستهدفة لتحديد المرافقين المطلوبين لوظيفة محددة وبالتالي سد الفجوة بين النمط الظاهري والوظيفة. على وجه التحديد ، نحن نراقب تفاعلات المرافق الجديدة باستخدام شاشات التفاعل الاصطناعية RNAi ، والتعبير عن المرافق ، ومرافق واحد في وقت واحد ، في الحيوانات التي تحمل طفرة في جين ترميز المرافق أو الإفراط في التعبير عن مرافق من الاهتمام. من خلال تعطيل اثنين من المرافقين التي تقدم بشكل فردي أي النمط الظاهري الإجمالي، يمكننا تحديد المرافقين التي تفاقم أو فضح النمط الظاهري محددة عندما يكون كل من المضطربة. ونحن نثبت أن هذا النهج يمكن تحديد مجموعات محددة من المرافقين التي تعمل معا لتعديل طي مجمعات البروتين أو البروتين المرتبطة النمط الظاهري معين.

Introduction

الخلايا التعامل مع تلف البروتين عن طريق استخدام آلات مراقبة الجودة التي إصلاح, عزل أو إزالة أي البروتينات التالفة1,2. ويدعم للطي وتجميع مجمعات البروتين من قبل المرافقين الجزيئية، ومجموعة متنوعة من البروتينات المحفوظة للغاية التي يمكن إصلاح أو عزل البروتينات التالفة3،4،5،6،7. تتم إزالة البروتينات التالفة بوساطة نظام ubiquitin-proteasome (UPS)8 أو بواسطة الآلات autophagy9 بالتعاون مع المرافقين10،11،12. البروتين التوازن (proteostasis) هو، لذلك، التي تحتفظ بها شبكات مراقبة الجودة تتألف من للطي والآلات تدهور3،13. ومع ذلك ، فإن فهم التفاعلات بين المكونات المختلفة لشبكة البروتيوستازي في الجسم الحي هو تحد كبير. في حين أن شاشات التفاعل البروتين البروتين تسهم بمعلومات هامة عن التفاعلات المادية والمجمعاتالمرافقين 14،15، فهم التنظيم وآليات تعويضية داخل شبكات المرافقين الأنسجة الخاصة في الجسم الحي غير موجود.

وغالبا ما تستخدم التفاعلات الجينية كأداة قوية لدراسة العلاقة بين أزواج من الجينات التي تشارك في المسارات البيولوجية المشتركة أو التعويضية16،17،18. ويمكن قياس هذه العلاقات من خلال الجمع بين أزواج من الطفرات وتحديد تأثير طفرة في جين واحد على شدة phenotypic الناجمة عن طفرة في الجين الثاني16. في حين أن معظم هذه المجموعات لا تظهر أي تأثير من حيث النمط الظاهري، يمكن لبعض التفاعلات الجينية إما أن تفاقم أو تخفف من شدة النمط الظاهري المقاس. ويلاحظ الطفرات المشددة عندما يكون النمط الظاهري للحذف المزدوج متحولة أكثر حدة من النمط الظاهري المتوقع ينظر عند الجمع بين المسوخ حذف واحد، مما يعني أن الجينات اثنين تعمل في مسارات متوازية، مما يؤثر معا على وظيفة معينة. في المقابل ، لوحظ تخفيف الطفرات عندما يكون النمط الظاهري للحذف المزدوج متحولة أقل حدة من النمط الظاهري ينظر مع المسوخ حذف واحد ، مما يعني أن الجينين تعمل معا كمعقدة أو المشاركة في نفس المسار16،18. وبناء على ذلك، استخدمت أنماط ظاهرة متنوعة يمكن قياسها كميا، بما في ذلك الأنماط الظاهرية الواسعة، مثل الفتك ومعدلات النمو وحجم الحضنة، فضلا عن أنماط ظاهرة محددة، مثل المراسلين النسخيين، لتحديد التفاعلات الجينية. على سبيل المثال، اعتمد Jonikas وآخرون على مراسل الإجهاد ER لدراسة التفاعلات من Cerevisiae Cerevisiae ER ER تكشفت شبكة الاستجابة البروتينية proteostasis باستخدام تحليلات حذف الجينات pairwise19.

شاشات التفاعل الجيني تنطوي على عبور منهجي الطفرات حذف pairwise لتوليد مجموعة شاملة من المسوخ مزدوجة20. ومع ذلك ، في النماذج الحيوانية ، وتحديدا في C. elegans، هذا النهج على نطاق واسع غير ممكن. بدلا من ذلك، يمكن اختبار السلالات المتحولة لأنماط تفاعلها الجيني عن طريق خفض تنظيم التعبير الجيني باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي (RNAAi)21. C. elegans هو نظام قوي للشاشات على أساس RNAi22،23. في C. elegans، يتم تحقيق تسليم الحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA) عن طريق التغذية البكتيرية ، مما يؤدي إلى انتشار جزيئات dsRNA إلى العديد من الأنسجة. وبهذه الطريقة ، فإن جزيئات dsRNA المقدمة تؤثر على الحيوان عن طريق إجراء سريع وبسيط21. ولذلك، يمكن لشاشة التفاعل الجيني باستخدام RNAi أن تكشف عن تأثير خفض تنظيم مجموعة من الجينات أو معظم جينات ترميز C. elegans باستخدام مكتبات RNAi24. في مثل هذه الشاشة ، يضرب التي تؤثر على سلوك متحولة من الفائدة ولكن ليس سلالة نوع البرية هي المعدلات المحتملة للنمط الظاهري يجري رصدها25. هنا، ونحن نطبق مزيجا من الطفرات وفحص RNAi لرسم خريطة منهجية التفاعلات المرافق الأنسجة محددة في C. elegans.

Protocol

1. إعداد لوحات وسائل الإعلام نمو النيماتودا لRNAi إلى زجاجة 1 لتر، أضف 3 غرام من NaCl، 2.5 غرام من Bacto-Peptone، 17 غرام من أجار والماء المقطر تصل إلى 1 لتر وautclave. زجاجة باردة إلى 55 درجة مئوية. إضافة 25 مل من 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 مل من 1 M CaCl2, 1 مل من 1 M MgSO4, و 1 مل من محلول الكوليست?…

Representative Results

استخدام الطفرات الحساسة لدرجة الحرارة في UNC-45 للكشف عن تفاقم أو تخفيف التفاعلات في ظل ظروف متساهلة أو تقييدية، على التواليتجميع العضلات وصيانتها توفر نظاما فعالا لدراسة التفاعلات المرافق الأنسجة محددة. الوحدة الوظيفية للعضلات المتقلصة، الساركومير، تقدم ترتيبا يشبه البلورية …

Discussion

لا تزال هناك صورة متكاملة لشبكة البروتيوستازي تعكس كيفية تنظيمها ووظائفها في خلايا وأنسجة ميتازوان مختلفة. ولمعالجة هذا القصور، يلزم الحصول على معلومات محددة عن تفاعلات مختلف مكونات هذه الشبكة، مثل المرافقين الجزيئيين، في أنسجة محددة أثناء التطور والشيخوخة. هنا، أظهرنا كيف أن استخدام ا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر مركز علم الوراثة في Caenorhabditis ، الممول من المركز الوطني لموارد البحوث في المعاهد القومية للصحة (NCRR) ، على بعض سلالات النيماتودا. تم الحصول على الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي طورها H.F. Epstein من بنك الدراسات التنموية الهجين الذي تم تطويره تحت رعاية NICHD وصيانته من قبل قسم البيولوجيا في جامعة أيوا. وقد تم دعم هذا البحث بمنحة من مؤسسة العلوم الإسرائيلية (المنحة رقم 278/18) ومنحة من وزارة العلوم والتكنولوجيا الإسرائيلية ووزارة الخارجية والتعاون الدولي، المديرية العامة لتعزيز الدولة، الجمهورية الإيطالية (المنحة رقم 3-14337). نشكر أعضاء مختبر بن زفي على مساعدتهم في إعداد هذه المخطوطة.

Materials

12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O’Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Tags

Caenorhabditis ElegansEmbryo SynchronizationM9 BufferNGM PlateCell ScraperCentrifugationSynchronized NematodesRNAiEmbryonic Lethality

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image