Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

استخدام Elegans Caenorhabditis إلى الشاشة لتفاعلات Chaperone الأنسجة محددة

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61140
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Summary

لدراسة مرافق مرافق ومرافق التفاعلات الركيزة، ونحن أداء شاشات التفاعل الاصطناعية في Elegans Caenorhabditis باستخدام تدخل الجيش الملكي النيبالي في تركيبة مع الطفرات الخفيفة أو الإفراط في التعبير عن المرافقين ورصد خلل البروتين الأنسجة محددة على مستوى الكائن الحي.

Abstract

للطي الصحيح وتجميع البروتينات ومجمعات البروتين ضرورية لوظيفة الخلوية. تستخدم الخلايا مسارات مراقبة الجودة التي تصحح البروتينات التالفة أو تعزلها أو تقضي عليها للحفاظ على بروتيوم صحي ، وبالتالي ضمان البروتيستاسيس الخلوي ومنع المزيد من تلف البروتين. بسبب الوظائف الزائدة داخل شبكة البروتيوستاسي ، يؤدي فحص الأنماط الظاهرية القابلة للكشف باستخدام الضربة القاضية أو الطفرات في الجينات ترميز المرافقين في الكائن الحي متعدد الخلايا Caenorhabditis elegans إلى الكشف عن الأنماط الظاهرية البسيطة أو معدومة في معظم الحالات. لقد وضعنا استراتيجية فحص مستهدفة لتحديد المرافقين المطلوبين لوظيفة محددة وبالتالي سد الفجوة بين النمط الظاهري والوظيفة. على وجه التحديد ، نحن نراقب تفاعلات المرافق الجديدة باستخدام شاشات التفاعل الاصطناعية RNAi ، والتعبير عن المرافق ، ومرافق واحد في وقت واحد ، في الحيوانات التي تحمل طفرة في جين ترميز المرافق أو الإفراط في التعبير عن مرافق من الاهتمام. من خلال تعطيل اثنين من المرافقين التي تقدم بشكل فردي أي النمط الظاهري الإجمالي، يمكننا تحديد المرافقين التي تفاقم أو فضح النمط الظاهري محددة عندما يكون كل من المضطربة. ونحن نثبت أن هذا النهج يمكن تحديد مجموعات محددة من المرافقين التي تعمل معا لتعديل طي مجمعات البروتين أو البروتين المرتبطة النمط الظاهري معين.

Introduction

الخلايا التعامل مع تلف البروتين عن طريق استخدام آلات مراقبة الجودة التي إصلاح, عزل أو إزالة أي البروتينات التالفة1,2. ويدعم للطي وتجميع مجمعات البروتين من قبل المرافقين الجزيئية، ومجموعة متنوعة من البروتينات المحفوظة للغاية التي يمكن إصلاح أو عزل البروتينات التالفة3،4،5،6،7. تتم إزالة البروتينات التالفة بوساطة نظام ubiquitin-proteasome (UPS)8 أو بواسطة الآلات autophagy9 بالتعاون مع المرافقين10،11،12. البروتين التوازن (proteostasis) هو، لذلك، التي تحتفظ بها شبكات مراقبة الجودة تتألف من للطي والآلات تدهور3،13. ومع ذلك ، فإن فهم التفاعلات بين المكونات المختلفة لشبكة البروتيوستازي في الجسم الحي هو تحد كبير. في حين أن شاشات التفاعل البروتين البروتين تسهم بمعلومات هامة عن التفاعلات المادية والمجمعاتالمرافقين 14،15، فهم التنظيم وآليات تعويضية داخل شبكات المرافقين الأنسجة الخاصة في الجسم الحي غير موجود.

وغالبا ما تستخدم التفاعلات الجينية كأداة قوية لدراسة العلاقة بين أزواج من الجينات التي تشارك في المسارات البيولوجية المشتركة أو التعويضية16،17،18. ويمكن قياس هذه العلاقات من خلال الجمع بين أزواج من الطفرات وتحديد تأثير طفرة في جين واحد على شدة phenotypic الناجمة عن طفرة في الجين الثاني16. في حين أن معظم هذه المجموعات لا تظهر أي تأثير من حيث النمط الظاهري، يمكن لبعض التفاعلات الجينية إما أن تفاقم أو تخفف من شدة النمط الظاهري المقاس. ويلاحظ الطفرات المشددة عندما يكون النمط الظاهري للحذف المزدوج متحولة أكثر حدة من النمط الظاهري المتوقع ينظر عند الجمع بين المسوخ حذف واحد، مما يعني أن الجينات اثنين تعمل في مسارات متوازية، مما يؤثر معا على وظيفة معينة. في المقابل ، لوحظ تخفيف الطفرات عندما يكون النمط الظاهري للحذف المزدوج متحولة أقل حدة من النمط الظاهري ينظر مع المسوخ حذف واحد ، مما يعني أن الجينين تعمل معا كمعقدة أو المشاركة في نفس المسار16،18. وبناء على ذلك، استخدمت أنماط ظاهرة متنوعة يمكن قياسها كميا، بما في ذلك الأنماط الظاهرية الواسعة، مثل الفتك ومعدلات النمو وحجم الحضنة، فضلا عن أنماط ظاهرة محددة، مثل المراسلين النسخيين، لتحديد التفاعلات الجينية. على سبيل المثال، اعتمد Jonikas وآخرون على مراسل الإجهاد ER لدراسة التفاعلات من Cerevisiae Cerevisiae ER ER تكشفت شبكة الاستجابة البروتينية proteostasis باستخدام تحليلات حذف الجينات pairwise19.

شاشات التفاعل الجيني تنطوي على عبور منهجي الطفرات حذف pairwise لتوليد مجموعة شاملة من المسوخ مزدوجة20. ومع ذلك ، في النماذج الحيوانية ، وتحديدا في C. elegans، هذا النهج على نطاق واسع غير ممكن. بدلا من ذلك، يمكن اختبار السلالات المتحولة لأنماط تفاعلها الجيني عن طريق خفض تنظيم التعبير الجيني باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي (RNAAi)21. C. elegans هو نظام قوي للشاشات على أساس RNAi22،23. في C. elegans، يتم تحقيق تسليم الحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA) عن طريق التغذية البكتيرية ، مما يؤدي إلى انتشار جزيئات dsRNA إلى العديد من الأنسجة. وبهذه الطريقة ، فإن جزيئات dsRNA المقدمة تؤثر على الحيوان عن طريق إجراء سريع وبسيط21. ولذلك، يمكن لشاشة التفاعل الجيني باستخدام RNAi أن تكشف عن تأثير خفض تنظيم مجموعة من الجينات أو معظم جينات ترميز C. elegans باستخدام مكتبات RNAi24. في مثل هذه الشاشة ، يضرب التي تؤثر على سلوك متحولة من الفائدة ولكن ليس سلالة نوع البرية هي المعدلات المحتملة للنمط الظاهري يجري رصدها25. هنا، ونحن نطبق مزيجا من الطفرات وفحص RNAi لرسم خريطة منهجية التفاعلات المرافق الأنسجة محددة في C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد لوحات وسائل الإعلام نمو النيماتودا لRNAi

  1. إلى زجاجة 1 لتر، أضف 3 غرام من NaCl، 2.5 غرام من Bacto-Peptone، 17 غرام من أجار والماء المقطر تصل إلى 1 لتر وautclave.
  2. زجاجة باردة إلى 55 درجة مئوية.
  3. إضافة 25 مل من 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 مل من 1 M CaCl2, 1 مل من 1 M MgSO4, و 1 مل من محلول الكوليسترول (الجدول 1) لجعل وسائل نمو النيماتودا (NGM).
  4. إضافة 1 مل من أمبيسلين (100 ملغم/مل) و 0.5 مل من 1 M IPTG(الجدول 1)لجعل حل NGM-RNAi.
    ملاحظة: تحتوي بكتيريا الإشريكية القولونية HT115(DE3) شائعة الاستخدام على بوليمرات الحمض النووي T7 غير القابلة للانزداع المستخدمة للتعبير عن البلازميدات المشفرة من DsRNA. هذه البلازميدات أيضا ترميز لمقاومة أمبيسلين.
  5. مزيج الحل الدافئ عن طريق تدوير الزجاجة.
  6. في غطاء محرك السيارة أو باستخدام إجراءات معقمة، صب محلول NGM في لوحات أو باستخدام مضخة معج، والاستغناء عن الحل في لوحات. استخدم لوحات 6-well أو 12-well أو 40 مم أو 60 مم لهذه الشاشة. يجب أن تملأ أغار حوالي 2/3 من عمق اللوحة.
  7. دع الأطباق تجف بين عشية وضحاها على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة ، مع الحفاظ على تغطية الأطباق. يمكن تخزين لوحات NGM لRNAi عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر.

2. زراعة البكتيريا RNAi وبذر لوحات

  1. في غطاء محرك السيارة أو باستخدام إجراءات معقمة، إضافة 1 مل من أمبيسلين (100 ملغم / مل) و 2.5 مل من التتراسيكلين (5 ملغم / مل) (الجدول 1) إلى محلول ومزيج ما قبل الاوتوسلاف 1 لتر من LB.
    ملاحظة: HT115 (DE3) شائعة الاستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية مقاومة للتتراسيكلين.
  2. في غطاء محرك السيارة أو باستخدام إجراءات معقمة، أضف 600 ميكرولتر من محلول LB لكل بئر في لوحات معقمة بعمق 2 مل 96 بئرا. فمن الأفضل لاستخدام pipet متعدد القنوات للاستغناء عن وسائل الإعلام.
  3. باستخدام إجراءات معقمة، تلقيح الآبار مع HT115 (DE3) E. البكتيريا القولونية تحولت مع البلازميد dsRNA ترميز تستهدف جين من الفائدة أو البلازميد فارغة، كعنصر تحكم. تغطية لوحات واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. المكتبات التي تتكون من استنساخ البكتيرية التي تعبر عن dsRNA، المقابلة ل~ 94٪ من الجينات المتوقعة C. elegans شيدت سابقا22،23 ومتاحة تجاريا. تم بناء مكتبة المرافق المستخدمة هنا من قبل مختبر الدكتور ريتشارد موريموتو26.
  4. باستخدام إجراءات معقمة، البذور 75، 150 أو 250 ميكرولتر من البكتيريا على 12 جيدا، 40 ملم و 6-جيدا أو 60 ملم NGM RNAi لوحات، على التوالي. وضع علامة واضحة على اسم الجين المستهدف على لوحة. يجب أن تغطي البكتيريا 30-50٪ من سطح أجار ويجب ألا تلمس حواف اللوحة.
  5. السماح لوحات لتجف لمدة يومين على الأقل على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة، والحفاظ على لوحات مغطاة.
    ملاحظة: يمكن احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تأكد من جفاف الآبار الداخلية قبل استخدام أو تخزين الصفائح. لجميع الأغراض طويلة الأجل (أي التجفيف أو التخزين) إبقاء لوحات في الظلام. يمكن تخزين الأطباق المجففة والمصنفة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر.

3. مزامنة غير مرهقة للأجنة

  1. استخدم انتقاء دودة لنقل حوالي 100 بيضة من لوحة دودة غير متزامنة إلى لوحة NGM مصنفة حديثا.
  2. زراعة الحيوانات لمدة 5 أيام عند 15 درجة مئوية، 3.5 أيام في 20 درجة مئوية أو 2.5 يوم عند 25 درجة مئوية. يجب أن تصل الحيوانات إلى اليوم الأول من وضع البيض.
    ملاحظة: تزرع الديدان عادة عند 20 درجة مئوية. ومع ذلك، قد تتطلب سلالات متحولة مرافق مختلفة درجات حرارة زراعة محددة. على سبيل المثال، تزرع العديد من السلالات الحساسة لدرجة الحرارة عند 15 درجة مئوية ولكنها تتحول إلى 25 درجة مئوية لكشف النمط الظاهري لها.
  3. إضافة 1 مل من المخزن المؤقت M9 (الجدول 1) ببطء وبعيدا عن العشب البكتيري. تدوير لوحة بحيث العازلة يغطي تماما لوحة. ثم إمالة إلى جانب واحد وإزالة السائل من لوحة وغسل الحيوانات قبالة لوحة.
    ملاحظة: عند استخدام الحيوانات الحساسة لدرجة الحرارة أو المسوخ المرافقة، فمن الأفضل للحفاظ على المخازن المؤقتة المستخدمة في البروتوكول في درجة حرارة زراعة الحيوانات.
  4. كرر الخطوة 3.3 ثلاث مرات أو حتى يتم غسل جميع الحيوانات من الطبق.
  5. باستخدام طرف بلاستيكي قياسي، اقطع مربعا من أجار من الطبق المغسول حيث يتركز البيض وضع قطعة أغار على طبق NGM المصنف حديثا.
    ملاحظة: يلزم حوالي 200 بيضة لإنتاج ما يكفي من الحيوانات التي تضع البيض؛ الكثير من الحيوانات تستهلك البكتيريا بسرعة كبيرة جدا. انخفاض مستويات الغذاء يمكن أن تؤثر على البروتيوستاسي27.
  6. زراعة الحيوانات لمدة 5 أيام في 15 درجة مئوية، 3.5 أيام في 20 درجة مئوية أو 2.5 أيام في 25 درجة مئوية. عند هذه النقطة، ينبغي أن تكون مغطاة لوحات مع البيض متزامنة.
    ملاحظة: يمكن نقل الحيوانات إلى لوحة جديدة لمدة قصيرة لمزامنة أكثر صرامة. ومع ذلك، من المهم استخدام البالغين فقط في المراحل المبكرة من وضع البيض حيث يمكن للحيوانات الاحتفاظ بالبويضات في رحمها مما يؤثر على المزامنة.
  7. إضافة 1 مل من العازلة M9 ببطء وبعيدا عن العشب البكتيري.
  8. تدوير لوحة بحيث العازلة يغطي تماما لوحة. ثم إمالة إلى جانب واحد وإزالة السائل من لوحة وغسل الحيوانات قبالة لوحة.
  9. كرر الخطوة 3.7 ثلاث مرات أو حتى يتم غسل جميع الحيوانات من الطبق.
  10. إضافة 1 مل من المخزن المؤقت M9 واستخدام مكشطة الخلية للافراج عن البيض من لوحة.
  11. جمع المخزن المؤقت M9 التي تحتوي على البيض من لوحات.
  12. الطرد المركزي العازلة M9 التي تحتوي على البيض في 3000 × غرام لمدة 2 دقيقة.
  13. إزالة supernatant وإضافة المخزن المؤقت M9 للوصول إلى وحدة تخزين 1 مل.
  14. إعادة إنفاق البيض لتعطيل أي قطع من البيض والبكتيريا.
  15. كرر إجراء الغسيل الموضح في الخطوات 3.11-3.13 خمس مرات. يجب أن تظهر بيليه البيض الأبيض. إذا كان لا يزال أصفر / بني، كرر الغسيل حتى يتم تحقيق بيليه أبيض.
    ملاحظة: البكتيريا التي تبقى على البيض يمكن أن تلوث البكتيريا المعبرة عن الحمض النووي الريبي.
  16. إزالة معظم supernatant، وترك حوالي 200 ميكرولتر. يمكن استخدام البيض المتزامن لشاشات RNAi.

4. المقايسات الظاهرية الشائعة

  1. زراعة الحيوانات أثناء التجارب
    1. ضع قطرة من ~ 30 بيضة بالقرب من العشب البكتيري في كل لوحة بذر RNAi. للرجوع إليها، ضع أيضا ~ 30 بيضة على لوحات بذر مع البكتيريا الفارغة التي تحتوي على ناقلات (L4440).
    2. زراعة الحيوانات المتزامنة مع العمر على لوحات NGM RNAi البذور. وستتوقف مدة التجربة على المرحلة التي سيتم فيها رصد الحيوانات ودرجة حرارة زراعتها. ضبط درجة حرارة الزراعة عند استخدام الحيوانات المتحولة الحساسة لدرجة الحرارة. ضبط مدة الزراعة عند استخدام الحيوانات المتحولة تأخر تطوريا.
      ملاحظة: في حين أن التوقيت يمكن أن يختلف، بمجرد أن تصل الحيوانات إلى مرحلة البلوغ، فإن وضع البيض (والاستهلاك السريع للطعام الناتج عن ذلك)، وكذلك انهيار البروتيوستسيس المعتمد على العمر28،يمكن أن يؤثر على النتائج. ومن ثم يوصى بتسجيل الحيوانات قبل بداية وضع البيض (اليوم الأول من البلوغ). الحيوانات البرية نوع تصل إلى هذه المرحلة بعد 4.5 أيام في 15 درجة مئوية، 3 أيام في 20 درجة مئوية أو 2 أيام في 25 درجة مئوية.
    3. وسيتوقف عدد التكرارات المستخدمة على حجم مجموعة الجينات التي تم فحصها. بالنسبة لمكتبة المرافق (97 جينا)، كرر التجارب أربع مرات على الأقل. يعتمد حجم السكان على المقايسة المستخدمة. في المقايسات السلوكية التي نوقشت هنا، يسجل 15 >الحيوانات لكل حالة تجريبية في كل تكرار. كما تعتمد البيانات والتحليلات الإحصائية بشدة على نوع المقايسة المستخدمة. يمكن تقديم البيانات في المقايسات التي تمت مناقشتها هنا كوسيلة ± SEM.
    4. قارن بين الحيوانات المعالجة بالنواقل الفارغة والحيوانات المعالجة بالنواقل كتجمعات سكانية مستقلة. يمكن حساب قيم P باستخدام ANOVA أحادية الاتجاه أو ثنائية الاتجاه، اعتمادا على التغييرات التي تم فحصها، وهي تفاقم أو التخفيف بمفردها أو كليهما. عند فحص علاج RNAi واحد مقابل التحكم ، يمكن حساب قيم P باستخدام اختبار مجموع رتبة Mann-Whitney في اتجاه واحد أو اتجاهين. بخلاف الأهمية الإحصائية، فكر في عتبة للزيارات استنادا إلى درجة التأثير على النمط الظاهري.
  2. توقيف/تأخير في التطوير
    1. زراعة الحيوانات المتزامنة مع العمر كما هو الحال في الخطوة 4.1 حتى الحيوانات التي تزرع على البكتيريا المكافحة الفارغة التي تحتوي على ناقلات تصل إلى مرحلة البلوغ ولكن قبل أن يبدأ وضع البيض.
    2. مراقبة الحيوانات باستخدام المنظار المجستير وإحصاء عدد اليرقات والبالغين لتسجيل نسبة الحيوانات المتأخرة تنمويا. للرجوع إليها، قارن بالحيوانات المتحولة التي تزرع على بكتيريا التحكم الفارغة المحتوية على ناقلات. hsp-1 أو hsp-90 نتائج العلاج RNAi في اعتقال النمو من الحيوانات البرية نوع ويمكن استخدامها كسيطرة إيجابية.
    3. لتسجيل نسبة الحيوانات المتأخرة تنمويا بمرور الوقت، كرر الخطوة 4.2.2.
      ملاحظة: إذا كان هناك بالغين يضعون البيض على اللوحة، قم بنقل الحيوانات المتأخرة تنمويا إلى لوحة NGM-RNAi جديدة تحمل نفس الجين المستهدف لتجنب الارتباك مع ذرية.
  3. عيوب العقم أو وضع البيض
    1. زراعة الحيوانات المتزامنة مع العمر كما هو الحال في الخطوة 4.1 حتى تبدأ الحيوانات التي تزرع على البكتيريا الفارغة لمكافحة ناقلات الأمراض في وضع البيض.
    2. مراقبة الحيوانات باستخدام المنظار المجسم وتسجيل نسبة الحيوانات التي لا يوجد بيض مرئي في رحمها. للرجوع إليها، قارن بالحيوانات المتحولة التي تزرع على البكتيريا الفارغة لمكافحة ناقلات الأمراض.
    3. بالتناوب، رصد الحيوانات باستخدام مجسم وتسجيل النسبة المئوية للحيوانات مع رحم كامل من البيض، ويعرف باسم EGg زرع معيبة (Egl-d) النمط الظاهري29.
  4. الفتك الجنيني
    1. زراعة الحيوانات المتزامنة مع العمر كما هو الحال في الخطوة 4.1 حتى تبدأ الحيوانات في وضع البيض.
    2. نقل ~ 100 بيضة إلى لوحة فارغة. نشر البيض في صفوف لتبسيط العد.
    3. يسجل النسبة المئوية من البيض غير المهتح على الطبق بعد 24-48 ساعة. كمرجع، قارن بيض الحيوانات المعالجة ببكتيريا مكافحة ناقلات فارغة.
  5. فحص الشلل
    1. للبالغين اليوم 1، زراعة الحيوانات المتزامنة مع العمر كما هو الحال في الخطوة 4.1 حتى الحيوانات التي تزرع على البكتيريا الفارغة لمكافحة ناقلات تصل إلى مرحلة البلوغ ولكن قبل بدء وضع البيض.
    2. رسم خط على الجزء الخلفي من لوحة أجار NGM العادية باستخدام علامة غرامة.
    3. ضع 5-10 على الخط المميز.
    4. تعيين جهاز توقيت وانتظر لمدة 10 دقيقة.
    5. تسجيل النسبة المئوية للحيوانات المتبقية على الخط والديدان مشلولة. للرجوع إليها، قارن بالحيوانات المتحولة التي تزرع على البكتيريا الفارغة لمكافحة ناقلات الأمراض. تظهر الحيوانات البرية المعالجة ب unc-45 RNAi النمط الظاهري للشلل الشديد ويمكن استخدامها كتحكم إيجابي.
      ملاحظة: يسلط هذا المقايسة الضوء على الحيوانات التي تظهر شللا متوسطا إلى شديدا. هذه الحيوانات عادة ما تكمن مباشرة على لوحة، بدلا من تقديم الشكل المنحني المشترك. وعلاوة على ذلك ، فإن التصحيح تطهيرها من البكتيريا مرئية حول رؤوس الديدان المشلولة.
  6. فحص الضرب
    1. زراعة الحيوانات المتزامنة مع العمر كما هو الحال في الخطوة 4.1 حتى الحيوانات التي تزرع على البكتيريا الفارغة لمكافحة ناقلات تصل إلى مرحلة البلوغ ولكن قبل أن يبدأ وضع البيض.
    2. Pipet 100 ميكرولتر من العازلة M9 في درجة حرارة زراعة الحيوانات في لوحة 96 جيدا.
    3. ضع ~15 دودة، واحدة لكل بئر، في الآبار المحتوية على المخزن المؤقت M9.
    4. دع الحيوانات تتكيف لمدة 5 دقائق.
    5. فحص كل تحت مجسم، بدء جهاز توقيت العد التنازلي 15 ثانية، وعدد الانحناءات الجسم كل ينفذ في تلك المهلة. القيم التي تم عدها يمكن تطبيعها إلى الانحناءات الجسم في الدقيقة الواحدة. للرجوع إليها، قارن بالحيوانات المتحولة التي تزرع على البكتيريا الفارغة لمكافحة ناقلات الأمراض.
      ملاحظة: هذا المقايسة حركية حساسة جدا ويمكن الكشف عن اختلافات خفيفة جدا بين العلاجات. ومع ذلك، يمكن أن تختلف الحركة في السائل والحركة على أجار.

5. التحقق من صحة ضربة قاضية البروتين

  1. ضع 250-300 بيضة متزامنة على لوحة NGM-RNAi مقاس 60 مم بذرت مع البكتيريا ذات الصلة المعبرة عن الحمض النووي الريبي أو الفارغة التي تحتوي على ناقلات (L4440).
    ملاحظة: يمكن أن تؤدي الضربة القاضية ل RNAi إلى تراكم أجنة منحرفة، أو نقص الأجنة أو في الاعتقال التنموي الذي يمكن أن يؤثر على التعبير الجيني. وينبغي النظر في ذلك عند تحديد عمر الحيوانات التي يتعين فحصها.
  2. للبالغين اليوم 1، زراعة الحيوانات لمدة 4.5 يوما في 15 درجة مئوية، 3 أيام في 20 درجة مئوية أو 2 أيام في 25 درجة مئوية.
  3. اختيار ونقل ما مجموعه 200 من الحيوانات البالغة الشباب في سقف أنبوب 1.5 مل ملء مع 200 ميكروغرام من برنامج تلفزيوني تي.
    ملاحظة: عند استخدام الحيوانات الحساسة لدرجة الحرارة أو المسوخ المرافقة، فمن الأفضل للحفاظ على المخازن المؤقتة المستخدمة في البروتوكول في درجة حرارة زراعة الحيوانات.
  4. أغلق الغطاء بعناية واغلق جهاز الطرد المركزي عند 1000 × غرام لمدة دقيقة واحدة.
  5. إضافة 800 ميكرولتر من PBS-T (الجدول 1) والطرد المركزي في 1000 x ز لمدة دقيقة واحدة.
  6. إزالة بعناية أعلى 900 ميكرولتر.
  7. كرر الخطوات 5.4-5.6 ثلاث مرات.
  8. إزالة 900 ميكرولتر، وترك 100 ميكرولتر من محلول يحتوي على 200 الديدان.
  9. إضافة 25 ميكرولتر من 5x عينة المخزن المؤقت (الجدول 1).
  10. سخني العينات لمدة 10 دقائق عند 92 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 1000 دورة في الدقيقة. ويمكن بعد ذلك تجميد العينات والاحتفاظ بها عند -20 درجة مئوية.
  11. تحميل 20 ميكرولتر من كل عينة وتشغيلها على هلام SDS-PAGE.
  12. إجراء تحليل لطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة المناسبة لتحديد الاستقرار النسبي للبروتين.
  13. تحديد كثافة النطاقات باستخدام برامج الكثافة، مثل وحدة جل ImageJ المتوفرة بحرية. تطبيع كافة القيم إلى تلك التي تم قياسها في نموذج (عينات) عنصر التحكم.
    ملاحظة: الهدف من الضربة القاضية RNAi في شاشاتنا هو خفض مستويات البروتين من مرافق معين / مرافق مشارك. وبالتالي ، فإن أفضل طريقة لتقييم كفاءة ضربة قاضية RNAi هي عن طريق تحليل البقع الغربية. وهذا يتطلب أجسام مضادة محددة. بالتناوب، يمكن استخدام qPCR لتحديد مستويات الحمض النووي الريبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدام الطفرات الحساسة لدرجة الحرارة في UNC-45 للكشف عن تفاقم أو تخفيف التفاعلات في ظل ظروف متساهلة أو تقييدية، على التوالي
تجميع العضلات وصيانتها توفر نظاما فعالا لدراسة التفاعلات المرافق الأنسجة محددة. الوحدة الوظيفية للعضلات المتقلصة، الساركومير، تقدم ترتيبا يشبه البلورية من البروتينات الهيكلية والتنظيمية. استقرار المايوسين البروتين الحركي وإدماجها في خيوط سميكة من ساركومير العضلات المنكمشة يعتمد على تعاون المرافقين ومكونات UPS30. مثال واحد من هذه المرافق هو المحافظة والمتخصصة مرافقة الميوسين UNC-45 التي يتم التعبير عنها أساسا في الجسم جدار العضلات31,32,33,34,35. وقد ثبت الطفرات في قيادة الأمم المتحدة-45 للحث على عدم تنظيم myosin وعيوب الحركة الشديدة في C. إليغانس31،36. تجمع وحدات ترادف UNC-45 في منصة إرساء متعددة المواقع37 تفرض التعاون بين UNC-45 و HSP-90 و HSP-1 والمرافقين الآخرين المحتملين والمرافقين المشاركين في تجميع خيوط الميوسين25و36و37و38. لتأكيد التفاعلات المعروفة UNC-45 وتحديد التفاعلات الجينية الجديدة في النتوء العضلي، وضعنا استراتيجية باستخدام C. elegans الحساسة لدرجة الحرارة unc-45 الطفرات كخلفية وراثية حساسة لفحص التفاعل المرافق الأنسجة الخاصة19،25.

استبدال واحد من الأحماض الأمينية في C. elegans UNC-45 (L822F و E781K، المقابلة لe286 و m94 أليليس، على التوالي؛ unc-45(ts)) هي المسؤولة عن عيوب الحركة التي تعتمد على درجة الحرارة والأنماط الظاهرية عدم تنظيم الميسين عندما تزرع الحيوانات المتضررة في ظل ظروف تقييدية (>22 درجة مئوية). في المقابل، هذه المسوخ unc-45(ts) تظهر أي حركة أو عيوب تنظيم الميوسين في درجة الحرارة المتساهلة (15 درجة مئوية)31. في النهج المقترح، استنفدت الحيوانات غير المتزامنة مع العمر unc-45 (e286) في مرحلة اليرقات الأولى (L1) من المرافقين الجزيئيين المختلفين بواسطة RNAi (97 جينا) ثم تم رصدها بحثا عن عيوب الحركة في ظل ظروف متساهلة (15 درجة مئوية)(الشكل 1). أكدنا التفاعل المعروف بين بروتينات UNC-45 و HSP-90 في شاشة التفاعلات الجينية وحددنا ثلاثة مرافقين مشاركين في Hsp-90 ، sti-1، ahsa-1 ، و daf-41، على أنها تسبب على وجه التحديد عيبا في الحركة الاصطناعية في الحيوانات المتحولة unc-45 (ts) ولكن ليس في الحيوانات البرية25. ذهبنا إلى دراسة ما إذا كان سبب الأنماط الظاهرية الاصطناعية المرتبطة sti-1-، ahsa-1 - أو daf-41 -بسبب عدم تنظيم الميوزين من خلال مراقبة الترتيب دون الخلوي لسلسلة الميوزين الثقيلة A (MYO-3) ، باستخدام تقنيات تلطيخ المناعة الراسخة39. في حين أن علاج الحيوانات البرية من النوع مع sti-1، ahsa-1 أو daf-41 RNAi لم يؤثر على تنظيم myofilament ، أدى استنفاد هذه الجينات في الحيوانات المتحولة unc-45 (e286) إلى تعطيل كامل للهياكل الساركوميرية و MYO-3 سوء الحساب ، حتى في ظل ظروف متساهلة (15 درجة مئوية). وكان هذا التأثير مماثلا لما شوهد مع unc-45 (e286) المسوخ واحد نمت في درجة الحرارة التقييدية (25 درجة مئوية)25. تم تأكيد هذه النتائج باستخدام آخر unc-45(ts)-allele، وهي unc-45(m94) متحولة25.

ولتحديد المرافقين الذين يزعزعون استقرار UNC-45، قمنا بعد ذلك بفحص المرافقين الذين حسنوا حركة حيوانات unc-45 (286) عند 25 درجة مئوية، معتمدين على الضربة القاضية الجينية من قبل RNAi. في حين أن الحيوانات المتحولة unc-45 (e286) أظهرت عيوب حركة شديدة عند 25 درجة مئوية ، تم تحسين حركة الحيوانات المعالجة بالرنانة ضد الجينات التي تترميز أربعة من المرافقين ال 97 الذين تم فحصهم بشكل كبير. هنا أيضا، تم تأكيد النتائج باستخدام الحيوانات المتحولة unc-45(m94). وبالتالي ، فإن استخدام الطفرات الحساسة لدرجة الحرارة يسمح بإنشاء شاشات مشددة وخففة ، اعتمادا على درجة الحرارة التي يتم بها إجراء الشاشة.

استخدام الإفراط في التعبير عن المرافق الخاص بالأنسجة لفحص التفاعلات المشددة
نحن المقبل استخدام الأنسجة محددة الإفراط في التعبير عن مرافق واحد كما اضطراب خفيف من شبكة مرافق العضلات لأغراض الفحص. على وجه التحديد، ونحن تستخدم الحيوانات الإفراط في التعبير عن نوع البرية dnj-24،ترميز C. elegans homolog من بروتين Hsp40 DNAJB6 في C. elegans عضلة جدار الجسم (DNJ-24M). كما ذكر أعلاه، عولجت L1 DNJ-24M بالرناي لمرافقين مختلفين وتم رصدها بحثا عن عيوب الحركة (20 درجة مئوية)(الشكل 1). في حين أن الحيوانات DNJ-24M لم تظهر أي عيوب ملحوظة في الحركة ، فإن ثلاثة جينات (من بين جينات ترميز المرافقين ال 48 التي تم فحصها ؛ 6٪) ، وهي hsp-1 و rme-8و dnj-8 ، أثرت على وجه التحديد على حركية الحيوانات المعبرة عن DNJ-24M ولكن ليس الحيوانات البرية. ومن الجدير بالذكر أن اختبار خصوصية يضرب باستخدام الحيوانات الإفراط في التعبير عن مرافق مختلف، وهي HSP-90، في العضلات (HSP90M)، وأظهرت أي تأثير على حركية HSP90M على hsp-1، rme-8،أو dnj-8 علاج RNAi40. إذا ما أخذت معا، فإن منصة الفحص، التي تستخدم اضطرابا خفيفا في شبكة المرافقين، مثل التعبير عن البروتينات المتحولة الميتاستابل أو الإفراط في التعبير عن الأنسجة، أسفرت عن معدل إصابة محدد للغاية (عادة ~ 5٪).

استخدام RNAi خاص بالأنسجة لفحص التفاعلات الجينية الخاصة بالأنسجة
تسمح السلالات الحساسة للرناي الخاصة بالأنسجة بضرب الجينات بالأنسجة الخاصة بينما لا تزال تستخدم التغذية البكتيرية لتسليم الحمض النووي الريبي. هذه السلالات هي متحولة لبروتين أرغونات RDE-1، وهو عنصر رئيسي في مسار RNAi المطلوب لإسكات الجينات الفعالة21. ومع ذلك ، فإن التعبير عن النوع البري RDE-1 تحت سيطرة مروج خاص بالأنسجة أدى إلى ضربة قاضية جينية فعالة خاصة بالأنسجة41،42. وهكذا تسمح هذه الأداة بشاشات التفاعل الجيني دون استخدام مرافقين محددين بالأنسجة، مثل UNC-45 أو DNAJ-24M. على سبيل المثال، أدى الضربة القاضية Hsp-6 (mortalin) في الحيوانات البرية أثناء التنمية إلى توقف نمو قوي (96±1٪ من الحيوانات المعالجة بالرناي). وفي الوقت نفسه، لم تتسبب الضربة القاضية Hsp-6 في سلالة تعبر عن النوع البري RDE-1 في العضلات في توقف النمو، في حين أدى التعبير عن النوع البري RDE-1 في الخلايا المعوية إلى نمط الظاهري قوي في التوقيف التنموي (90±3٪؛ الشكل 2). وبالتالي، مطلوب HSP-6 وظيفة في الخلايا المعوية للتنمية الطبيعية. ولذلك، يمكن استخدام طفرة في hsp-6 (mg585) تسبب تأخيرا خفيفا في النمو لفحص تفاعلات المرافقين المشددة أو التخفيف من حدتها عن طريق عبور الجين المتحول إلى سلالة RNAi خاصة بالأمعاء وفحص مكتبة RNAi المرافقة.

رصد التغيرات المعتمدة على العمر في البيئة القابلة للطي باستخدام التفاعلات الجينية
تظهر الحيوانات انخفاضا يعتمد على العمر في الحركة يرتبط بعدم التنظيم الساركوميري43،44،45. التغيرات في قدرة طي البروتين تتزامن مع تغيير تنظيم وتكوين الآلات28proteostasis الخلوية , بما في ذلك تغيير مستويات UNC-45, CHN-1, وUFD-2, بروتينات العضلات لمراقبة الجودة الآلات46. في الاتفاق, myosin للطي وتدهور تتأثر التعديلات في القدرة البروتيوستاتيكي في الانتقال إلى مرحلة البلوغ47. ولذلك، سألنا عما إذا كانت هذه التغييرات يمكن أن تؤثر على التفاعلات المرافقة. على سبيل المثال، رصدنا تأثير STI-1و ahsa-1 و daf-41 بالضربة القاضية على الحركة بمرور الوقت. وجدنا أنه على الرغم من أن STI-1-، ahsa-1- و daf-41-أظهرت الحيوانات المعالجة RNAi انخفاض الحركة أثناء تطور اليرقات، انخفضت الحركة بشدة في الديدان البالغة unc-45(ts). وعلاوة على ذلك، فإن منظمة MYO-3 في unc-45 (ts) الحيوانات المتحولة المعالجة بالستي-1، الأحساء-1 أو daf-41 RNAi كانت مشابهة لتلك التي كانت الديدان البرية في مرحلة اليرقات الرابعة (L4)، على الرغم من أن المسوخ أظهرت ساركومير تعطلت بعد أن وصلت الحيوانات إلى مرحلة البلوغ(الشكل 3). وعلى النقيض من ذلك، ظلت الحيوانات المتحولة unc-45(ts) المعالجة بمكافحة ناقلات فارغة والحيوانات البرية من النوع غير متأثرة(الشكل 3). وهكذا، فإن ديناميات البروتيوستاسي كدالة للعمر أو الظروف البيئية27،45،46،48،49 يمكن أن تؤثر بشكل خطير على تفاعلات المرافق.

Figure 1
الشكل 1: إعداد شاشات التفاعل الاصطناعية RNAi باستخدام C. elegans تحمل طفرة في الجينات ترميز مرافق من الفائدة. (أ) تمثيل تخطيطي للإعداد الأساسي لشاشات التفاعل المرافق المستهدفة. (ب)التحقق من صحة ضرب يتطلب تأكيدا للتفاعل الجيني باستخدام متحولة مرافق آخر، فضلا عن التحقق من صحة تحديد الضربة القاضية RNAi. (C-D) يمكن تحديد قراءات بسيطة، مثل عيوب الحركة، لتحديد التفاعلات المشددة أو التخفيف، باستخدام الشلل أو المقايسات السحقية، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: يمكن استخدام الحمض النووي الريبي الخاص بالأنسجة من مرافق الميتوكوندريا hsp-6 لفحص التفاعلات الجينية في نسيج واحد. تم علاج سلالات RNAi البرية من النوع الأمعاء والعضلات محددة مع hsp-6 RNAi و (A) تم تسجيل تأخير في النمو أو (ب) تم التقاط الصور في اليوم الأول من مرحلة البلوغ. البيانات متوسطة ± SEM، N =6. شريط المقياس هو 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الآثار المعتمدة على العمر من RNAi. (أ)الحركة مع التقدم في السن. تم وضع نوع البرية أو unc-45 (e286) الأجنة على STI-1، ahsa-1 أو daf-41 لوحات RNAi المصنفة في 15 درجة مئوية وسجل لحركية باستخدام المقايسة سحق في كل مرحلة من مراحل النمو، L1-L4، الشباب البالغين واليوم 1 من مرحلة البلوغ. البيانات متوسطة ± SEM، N= 15. (ب) صور Confocal من عضلة جدار الجسم. تم التعامل مع الحيوانات كما هو الحال في A وثابتة في L4، والشباب البالغين واليوم 1 من مراحل البلوغ والملطخة بالمناعة مع الأجسام المضادة المضادة MYO-3. شريط المقياس هو 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حل تعليمات التحضير خزن
1 م كاكل2 (1 لتر) إضافة 147.01 غرام كاتل2· 2H2O المتجر في RT
إضافة dH2O إلى 1 L
الأوتوكلاف أو الفلتر (0.22 ميكرومتر)
1 M KH2PO4, pH 6.0 (1 لتر) إضافة 136.09 غرام KH2PO4 المتجر في RT
إضافة 800 مل dH2O
مزيج باستخدام الستيرر المغناطيسي حتى يذوب
معدل الحموضة باستخدام KOH
إضافة dH2O إلى 1 L
الأوتوكلاف أو الفلتر (0.22 ميكرومتر)
1 م ملغسو4 (1 لتر) إضافة 248.58 غ مغسو4· 7H2O المتجر في RT
إضافة dH2O إلى 1 L
الأوتوكلاف أو الفلتر (0.22 ميكرومتر)
محلول الكوليسترول (50 مل) إضافة 250 ملغ الكوليسترول إلى أنبوب فالكون 50 مل يخزن عند -20 درجة مئوية
حل تماما في الإيثانول 40 مل
إضافة الإيثانول إلى 50 مل
1 M IPTG (50 مل) إضافة 11.9 غرام IPTG (ايزوبروبيل β-D-thiogalactopyranoside) إلى أنبوب فالكون 50 مل يخزن في الظلام عند -20 درجة مئوية
حل تماما في 40 مل dH2O
إضافة dH2O إلى 50 مل
فلتر (0.22 ميكرومتر), أنابيب عليكوت 1mL
مخزون أمبيسلين (50 مل) إضافة 5 غرام أمبيسلين إلى أنبوب فالكون سعة 50 مل يخزن عند -20 درجة مئوية
حل تماما في 40 مل dH2O
إضافة dH2O إلى 50 مل
فلتر (0.22 ميكرومتر)، توزيع 1 مل عليكوت في أنابيب إيبيندورف
سهم التتراسيكلين (50 مل) إضافة 250 ملغ تتراسيكلين إلى أنبوب فالكون 50 مل يخزن عند -20 درجة مئوية
حل تماما في الإيثانول 40 مل
إضافة الإيثانول إلى 50 مل
أنابيب عليكوت 1 مل
المخزن المؤقت M9 (1 لتر) أضف 5.8 غ Na2HPO4·7H2O المتجر في RT
إضافة 3 غ KH2PO4
إضافة 5 غ NaCl
إضافة 0.25 غ مغسو4· 7H2O
إضافة dH2O إلى 1 L
فلتر (0.22 ميكرومتر)
1X برنامج تلفزيوني تي (رقم الحموضة 7.4) ( 1 لتر) إضافة 8 غرام من NaCl المتجر في RT
إضافة 200 ملغ من KCl
إضافة 1.44 غنا 2HPO4· 7H2O
إضافة 240 ملغ KH2PO4
حل تماما في 800 مل dH2O
معدل الحموضة باستخدام KOH tp pH 7.4
إضافة 500 ميكرولتر توين-20
إضافة dH2O إلى 1 L
المخزن المؤقت لعينة 5x إضافة 6.8 مل dH2O يخزن عند -20 درجة مئوية
إضافة 2 مل 0.5M تريس pH 6.8
إضافة 3.2 مل غليسيرول
إضافة 1.6 مل 20٪ SDS
إضافة 0.8 مل ß-ميركابتوثانول
1٪ بروموفينول أزرق

الجدول 1: وصفات الحل

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لا تزال هناك صورة متكاملة لشبكة البروتيوستازي تعكس كيفية تنظيمها ووظائفها في خلايا وأنسجة ميتازوان مختلفة. ولمعالجة هذا القصور، يلزم الحصول على معلومات محددة عن تفاعلات مختلف مكونات هذه الشبكة، مثل المرافقين الجزيئيين، في أنسجة محددة أثناء التطور والشيخوخة. هنا، أظهرنا كيف أن استخدام الاضطرابات الخاصة بالأنسجة مكننا من فحص شبكة المرافقين في نسيج معين. ولاستكشاف التفاعلات الجينية للوصينة الخاصة بالأنسجة، تم النظر في ثلاثة نهج مختلفة. في النهج الأول، تم استخدام UNC-45، مرافق التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في خلايا العضلات، لفحص التفاعلات المرافقين عن طريق تغذية RNAi25. وفي حين أن استخدام مرافق متخصص يسمح بخصوصية الأنسجة المميزة، فإنه لا يمكن إلا أن يقدم تقريرا عن تلك الشبكة الفرعية الشديدة التركيز التي يسهم فيها. لاحظ أن معظم الخلايا العصبية C. elegans مقاومة لتغذية القائم على تسليم RNAi50 وبالتالي استخدام هذا النهج لتحديد التفاعلات الجينية في الخلايا العصبية يتطلب عبور مرافق متحولة فحصها مع سلالة RNAiالمحسنة 51. في النهج الثاني، تم استخدام المروج الأنسجة محددة لدفع الإفراط في التعبير عن مرافق في العضلات، وبالتالي تؤثر على وجه التحديد في بيئة العضلات للطي40. ومع ذلك ، يمكن أن يكون الإفراط في التعبير عن مرافق واحد مفيدا بشكل عام للبيئة القابلة للطي وبالتالي يخفي الاضطراب الناجم عن المرافقين معا. اعتمد النهج الثالث على الأنسجة محددة RNAi الضربة القاضية لفحص التفاعلات المرافق في نسيج معين41. ميزة واحدة من هذا النهج هو أنه يسمح لاستهداف الخلايا العصبية التي تقاوم تسليم RNAi عن طريق تغذية42. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يتطلب استخدام متحولة خفيفة (وإن لم تكن متخصصة) ، فضلا عن أن يتم عبور هذا المتحول إلى متحولة فارغة rde-1 تحمل جين إنقاذ rde-1 خاص بالأنسجة. الأهم من ذلك، يمكن الجمع بين هذه النهج وذلك لتعديل وظيفة المرافق المحتمل في نسيج واحد أو حتى خلية واحدة.

يمكن أن تؤثر آلات مراقبة الجودة على وظيفة العديد من المنتجات الجينية عن طريق اضطراب البروتيوستاسي. هذا هو التحدي الرئيسي عند استخدام التفاعلات الجينية لاستكشاف شبكة مراقبة الجودة18. على سبيل المثال، أدى التعبير المزمن عن البروتينات المعرضة للتجميع أو انهيار البروتيوستاسي في الشيخوخة إلى تفاقم منشط الذهن للعديد من البروتينات الميتاستابل غير ذات الصلة في C. elegans والخميرة 45،52،53. وعلاوة على ذلك، تم منع الغدد الصماء بوساطة الكلاترين في خلايا الثدييات عند عزل وظيفي من Hsc70 إلى مجاميع البروتين. ومع ذلك ، فقد تبين أن الغدد الصماء يمكن إنقاذها من قبل Hsc70 الإفراط في التعبير ، في حين أن التجميع لا يمكن54،55. وبالمثل، حددت شاشة وراثية في Drosophila تهدف إلى الكشف عن المنظمين للاستجابة للصدمة الحرارية طفرة missense في أكتين عضلة الطيران التي تنشيط تشكلي استجابة صدمة الحرارة56. إذا أخذنا معا، يمكن أن يؤدي اضطراب شبكة البروتيوستاسي إلى كشف البروتينات الميتاستابل أو الحث على الإجهاد الذي يمكن أن يؤثر على خصوصية النتيجة. ومع ذلك، فإن تحليل التفاعلات الجينية يمكن أن يسفر عن رؤية محددة ووظيفية للغاية. على سبيل المثال، حددت التحليلات الظهارية لجينات الخميرة المطلوبة للطي في الشبكية الإنتوبلازمية تفاعلات جينية محددة بين المرافقين الجزيئيين التي تم التحقق من صحتها في وقت لاحق19. وبالمثل، حددت شاشة مشددة للمرافقين التي تعزز سمية نموذجين عرضة للتراكم (كما تقاس الحركة) مجموعة فرعية محددة من 18 مرافقا، أثرت تقويم العظام منها على تجميع هنتنغتين في الخلايا البشرية26. هنا ، أظهرنا أن الاضطرابات المختلفة لشبكة proteostasis يمكن أن تكشف عن تفاعلات مرافق محددة ووظيفية.

الميزة الرئيسية لاستخدام شاشات التفاعل الجيني القائمة على تغذية RNAi هي البساطة النسبية للطريقة. حتى توظيف الناتج السلوكي العام، مثل الحركة، يمكن أن تكشف عن التفاعلات الجينية الجديدة(الشكل 3). ومع ذلك ، يمكن أن يحد التباين والآثار الجزئية لضربة قاضية التعبير من متانة وخصوصية النتائج57. وعلاوة على ذلك، فإن التفاعلات الجينية لا تدل على التفاعلات الفيزيائية، وبالتالي فإن العلاقة بين جينين يمكن أن تكون غير مباشرة. استكشاف طبيعة التفاعلات والتخلص من التفاعلات غير المحددة يمكن أن يستغرق وقتا طويلا57،58،59. هذا هو مصدر قلق التي تحتاج إلى معالجة في إعداد الشاشة والتحقق من الصحة. على سبيل المثال، استخدام الأليل الخالية في الفحص الجيني يسمح بتحديد ما إذا كانت هذه الجينات تعمل في نفس المسارات أو مسارات متميزة في عملية بيولوجية معينة. ومع ذلك ، باستخدام فقدان جزئي لوظيفة الجينات ، تؤدي الأليلات غير المتبلورة ، مثل الأليل الحساسة لدرجة الحرارة ، أو تنظيم التعبير المعتمد على RNAi ، إلى أنشطة متبقية يمكن أن تسفر عن تفاقم أو تخفيف الأنماط الظاهرية ، بغض النظر عما إذا كانت الجينات تعمل في نفس المسارات أو في مسارات متوازية59. وبالتالي، فإن طبيعة أي تفاعل تتطلب المزيد من التحليل. ومع ذلك ، يمكن استخدام أليليس hypomorphic وRNAi تحديد مجموعة واسعة من المتفاعلين ، بما في ذلك الجينات في نفس مجمع البروتين أو المسار أو في مسار زائدة عن الحاجة59. في حين أن هذا النطاق الأكبر من التفاعلات الممكنة يمكن أن تسفر عن المزيد من الزيارات في الشاشة الوراثية ، فإنه يمكن أن يؤدي أيضا إلى تفاعلات غير محددة ، مثل ، على سبيل المثال ، التعرض غير المحدد للأليلات الحساسة لدرجة الحرارة في انهيار البروتيوستاسي45،53.

يمكن فحص التحقق من الصحة والتفاعلات غير المحددة بعدة طرق. يجب أن يكون عدد مرات الدخول منخفضا. على سبيل المثال، أدى انخفاض تنظيم التعبير المرافق في خلفية متحولة unc-45 إلى نسبة صغيرة من الزيارات (4٪)، مع عدم إظهار معظم الجينات المرافقة لأي تأثير على الحركة. ولوحظ معدل مماثل عندما كان التعبير عن DNJ-24M مفرطا (6 في المائة). كما ذكر أعلاه، حددت شاشة لتفاعلات المرافقين مع البروتينات المعرضة للتراكم 18 مرافقا من 219 تم فحصهم (8٪).

وينبغي استخدام العديد من الأليل متحولة، وخطوط الإفراط في التعبير أو نماذج المرض. استخدام الأليل متحولة مختلفة لها تأثيرات مختلفة على وظيفة المرافق، فضلا عن سلالات مختلفة مع خلفيات وراثية مختلفة، يمكن أن تدعم خصوصية أي يضرب الشاشة. بدلا من ذلك، يمكن استخدام طفرة أو الإفراط في التعبير عن مرافق مختلفة التي لا تؤدي إلى اضطراب مماثل بمثابة السيطرة السلبية. على سبيل المثال، أظهرت كل من unc-45(e286) و unc-45(m94) سلوكا مشددا عندما تم تنظيم sti-1أو ahsa-1 أو daf-41. وعلاوة على ذلك، لوحظ تفاعل مماثل عندما عولجت الحيوانات التي تحمل متحولة حذف ahsa-1 (ok3501) ب hsp-90 RNAi25.

وينبغي فحص هوية المرافق يضرب وتفاعلاتها المعروفة. على سبيل المثال، المرافقين المحددة في شاشة تفاقم unc-45 هي مجموعة محددة للغاية من المرافقين المطلوبة لدورة ATPase HSP-90، بما في ذلك تلك ترميز المجند العميل (STI-1)، وإعادة عرض مرافق مشارك (AHSA-1)، ونضوج العميل مرافق مشارك (DAF-41). في الواقع، هذه المجموعة من المرافقين المشاركين يشكل دورة كاملة HSP-90 للطي60. وبالمثل، حددت شاشة DNJ-24M HSP-1، الشريك الرئيسي لمرافق Hsp40s40.

وينبغي أيضا دراسة التغيرات في التفاعلات على مدى عمر الحيوان. على سبيل المثال، المرافقين المحددة في شاشة غير 45 تفاقم أثرت بقوة الحركة وتنظيم الميوسين في مرحلة البلوغ ولكن كان لها تأثير أكثر اعتدالا أثناء التنمية. قد يكون هذا بسبب التغيرات في شبكة البروتيوستازي في مرحلة البلوغ28 أو إلى التغيرات في متطلبات طي الميوسين بين طي ألياف الميو وصيانتها.

استخدام النهج الكيميائية الحيوية التكميلية لدراسة مباشرة التفاعلات بين البروتينات، فضلا عن توطينها في الخلية. على سبيل المثال، HSP-90 المرافقين المشاركين، STI-1، AHSA-1 و DAF-41، يتم توطينها إلى ساركومير حيث تتفاعل مع الميسين25.

C. elegans هو نموذج ميتازوان راسخ لرصد مراقبة الجودة. وغالبا ما يستخدم لرصد البروتيوستاسيس الخلوية والكائنة باستخدام مجموعة أدوات متغيرة من بيولوجيا الخلايا والنهج الكيميائية الحيوية والجينية. هنا، قمنا بتوظيف نهج الفحص الجيني والأدوات المتاحة57،58،59، مثل بنك متحول ، مكتبات RNAi المتاحة22،23 وسلالات RNAi الخاصة بالأنسجة41،42، لمراقبة تفاعلات المرافق في حي أثناء النمو والشيخوخة. إن استخدام المقايسات السلوكية البسيطة، مثل الحركة، يبسط شاشة العديد من أزواج الجينات الممكنة لاستكشاف التفاعلات الجينية الجديدة. ويمكن أن يكون ذلك بعد ذلك بمثابة منصة لمواصلة استكشاف توطين المرافق والتفاعلات الفيزيائية باستخدام الأدوات الكيميائية الحيوية لدراسة تفاعلاتها المحتملة ميكانيكيا في الجسم الحي وفي المختبر. وقد تم استخدام البروتوكول الموصوف هنا بنجاح لتحديد التفاعلات المرافق الرواية في C. elegans الجسم جدار العضلات25,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

نشكر مركز علم الوراثة في Caenorhabditis ، الممول من المركز الوطني لموارد البحوث في المعاهد القومية للصحة (NCRR) ، على بعض سلالات النيماتودا. تم الحصول على الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي طورها H.F. Epstein من بنك الدراسات التنموية الهجين الذي تم تطويره تحت رعاية NICHD وصيانته من قبل قسم البيولوجيا في جامعة أيوا. وقد تم دعم هذا البحث بمنحة من مؤسسة العلوم الإسرائيلية (المنحة رقم 278/18) ومنحة من وزارة العلوم والتكنولوجيا الإسرائيلية ووزارة الخارجية والتعاون الدولي، المديرية العامة لتعزيز الدولة، الجمهورية الإيطالية (المنحة رقم 3-14337). نشكر أعضاء مختبر بن زفي على مساعدتهم في إعداد هذه المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O'Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Tags

علم الأحياء، العدد 160، Caenorhabditis elegans، مرافق ، التفاعلات الجينية ، البروتيوستاسي ، RNAi ، الشاشة ، حساسة لدرجة الحرارة
استخدام <em>Elegans Caenorhabditis</em> إلى الشاشة لتفاعلات Chaperone الأنسجة محددة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., … More

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter