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Biology

Utilisation de Caenorhabditis elegans pour dépister les interactions tissulaires spécifiques des chaperons

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61140
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Summary

Pour étudier les interactions chaperon-chaperon et chaperone-substrat, nous effectuons des écrans d’interaction synthétique chez Caenorhabditis elegans en utilisant l’interférence ARN en combinaison avec des mutations légères ou une sur-expression des chaperons et surveillons le dysfonctionnement protéique spécifique des tissus au niveau de l’organisme.

Abstract

Le repliement et l’assemblage corrects des protéines et des complexes protéiques sont essentiels à la fonction cellulaire. Les cellules utilisent des voies de contrôle de la qualité qui corrigent, séquestrent ou éliminent les protéines endommagées pour maintenir un protéome sain, assurant ainsi la protéostasie cellulaire et prévenant d’autres dommages aux protéines. En raison de fonctions redondantes au sein du réseau de protéostasie, le dépistage des phénotypes détectables à l’aide de knockdown ou de mutations dans des gènes codant pour chaperon dans l’organisme multicellulaire Caenorhabditis elegans entraîne la détection de phénotypes mineurs ou nuls dans la plupart des cas. Nous avons développé une stratégie de dépistage ciblée pour identifier les accompagnateurs nécessaires à une fonction spécifique et ainsi combler le fossé entre le phénotype et la fonction. Plus précisément, nous surveillons de nouvelles interactions de chaperon à l’aide d’écrans d’interaction synthétiques de l’ARNi, renversant l’expression du chaperon, un chaperon à la fois, chez les animaux porteurs d’une mutation dans un gène codant pour chaperon ou surexprimant un chaperon d’intérêt. En perturbant deux chaperons qui ne présentent individuellement aucun phénotype brut, nous pouvons identifier les chaperons qui aggravent ou exposent un phénotype spécifique lorsque les deux sont perturbés. Nous démontrons que cette approche permet d’identifier des ensembles spécifiques d’accompagnateurs qui fonctionnent ensemble pour moduler le repliement d’une protéine ou de complexes protéiques associés à un phénotype donné.

Introduction

Les cellules font face aux dommages causés par les protéines en utilisant des machines de contrôle de la qualité qui réparent, séquestrent ou éliminent toutes les protéines endommagées1,2. Le repliement et l’assemblage des complexes protéiques sont soutenus par des chaperons moléculaires, un groupe diversifié de protéines hautement conservées qui peuvent réparer ou séquestrer les protéines endommagées3,4,5,6,7. L’élimination des protéines endommagées est médiée par le système ubiquitine-protéasome (UPS)8 ou par la machinerie d’autophagie9 en collaboration avec les chaperons10,11,12. L’homéostasie protéique (protéostasie) est donc maintenue par des réseaux de contrôle de la qualité composés de machines de repliement et de dégradation3,13. Cependant, comprendre les interactions entre les différentes composantes du réseau de protéostasie in vivo est un défi majeur. Alors que les écrans d’interaction protéine-protéine fournissent des informations importantes sur les interactions physiques et les complexes chaperons14,15, la compréhension de l’organisation et des mécanismes compensatoires au sein des réseaux de chaperons spécifiques aux tissus in vivo fait défaut.

Les interactions génétiques sont souvent utilisées comme un outil puissant pour examiner la relation entre les paires de gènes impliqués dans les voies biologiques communes ou compensatoires16,17,18. De telles relations peuvent être mesurées en combinant des paires de mutations et en quantifiant l’impact d’une mutation dans un gène sur la gravité phénotypique causée par une mutation dans le second gène16. Bien que la plupart de ces combinaisons ne montrent aucun effet en termes de phénotype, certaines interactions génétiques peuvent aggraver ou atténuer la gravité du phénotype mesuré. Des mutations aggravantes sont observées lorsque le phénotype du mutant à double délétion est plus grave que le phénotype attendu observé lors de la combinaison des mutants de délétion unique, ce qui implique que les deux gènes fonctionnent dans des voies parallèles, affectant ensemble une fonction donnée. En revanche, des mutations atténuantes sont observées lorsque le phénotype du mutant à double délétion est moins sévère que le phénotype observé avec les mutants à délétion simple, ce qui implique que les deux gènes agissent ensemble comme un complexe ou participent à la même voie16,18. En conséquence, divers phénotypes qui peuvent être quantifiés, y compris des phénotypes larges, tels que la létalité, les taux de croissance et la taille du couvain, ainsi que des phénotypes spécifiques, tels que les rapporteurs transcriptionnels, ont été utilisés pour identifier les interactions génétiques. Par exemple, Jonikas et al. se sont appuyés sur un rapporteur de stress ER pour examiner les interactions du réseau de protéostasie de réponse protéique déployée par ER à l’aide d’analyses de délétion de gènes par paires19.

Les tests d’interaction génétique impliquent de croiser systématiquement les mutations de délétion par paires pour générer un ensemble complet de doubles mutants20. Cependant, dans les modèles animaux, et en particulier chez C. elegans,cette approche à grande échelle n’est pas réalisable. Au lieu de cela, les souches mutantes peuvent être testées pour leurs modèles d’interaction génétique en régulant à la baisse l’expression des gènes à l’aide de l’interférence ARN (ARNi)21. C. elegans est un système puissant pour les écrans basé sur l’ARNi22,23. Chez C. elegans,l’administration d’ARN double brin (ARNds) est obtenue par alimentation bactérienne, ce qui conduit à la propagation des molécules d’ARNds à de nombreux tissus. De cette manière, les molécules d’ARNd introduites impactent l’animal via une procédure rapide et simple21. Un criblage d’interaction génétique utilisant l’ARNi peut donc révéler l’impact de la régulation à la baisse d’un ensemble de gènes ou de la plupart des gènes codant pour C. elegans à l’aide de bibliothèques d’ARNi24. Dans un tel écran, les hits qui impactent le comportement du mutant d’intérêt mais pas la souche de type sauvage sont des modificateurs potentiels du phénotype surveillé25. Ici, nous appliquons une combinaison de mutations et de dépistage de l’ARNi pour cartographier systématiquement les interactions de chaperon spécifiques aux tissus chez C. elegans.

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Protocol

1. Préparation de plaques de milieux de croissance de nématodes pour l’ARNi

  1. Dans une bouteille de 1 L, ajouter 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-Peptone, 17 g de gélose et d’eau distillée jusqu’à 1 L et autoclave.
  2. Refroidir la bouteille à 55 °C.
  3. Ajouter 25 mL de 1 M KH2PO4,pH 6,0, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4et 1 mL de solution de cholestérol (Tableau 1) pour fabriquer un milieu de croissance des nématodes (NGM).
  4. Ajouter 1 mL d’ampicilline (100 mg/mL) et 0,5 mL de 1 M IPTG (Tableau 1) pour faire une solution de NGM-ARNi.
    REMARQUE: Les bactéries HT115 (DE3) E. coli couramment utilisées contiennent une ADN polymérase T7 inductible IPTG utilisée pour exprimer les plasmides codant pour l’ARNd. Ces plasmides codent également pour la résistance à l’ampicilline.
  5. Mélanger la solution chaude en faisant tourbillonner la bouteille.
  6. Dans la hotte ou en utilisant des procédures stériles, versez la solution de NGM dans des plaques ou à l’aide d’une pompe péristaltique, distribuez la solution dans des plaques. Utilisez des plaques de 6 puits, 12 puits, 40 mm ou 60 mm pour cet écran. La gélose devrait remplir environ 2/3 de la profondeur de la plaque.
  7. Laissez les assiettes sécher pendant la nuit sur le banc à température ambiante, en gardant les plaques couvertes. Les plaques NGM pour ARNi peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à un mois.

2. Cultiver des bactéries ARNi et ensemencer les plaques

  1. Dans la hotte ou à l’aide de procédures stériles, ajouter 1 mL d’ampicilline (100 mg/mL) et 2,5 mL de tétracycline (5 mg/mL)(tableau 1)à une solution et un mélange pré-autoclavés de 1 L de LB.
    REMARQUE: Les bactéries HT115 (DE3) E. coli couramment utilisées sont résistantes à la tétracycline.
  2. Dans la hotte ou à l’aide de procédures stériles, ajouter 600 μL de solution LB à chaque puits dans des plaques stériles de 96 puits de profondeur de 2 mL. Il est préférable d’utiliser une pipette multicanal pour distribuer le média.
  3. À l’aide de procédures stériles, inoculer des puits avec des bactéries HT115(DE3) E. coli transformées avec un plasmide codant pour l’ARNdS ciblant un gène d’intérêt ou un plasmide vide, comme témoin. Couvrir les plaques et incuber à 37 °C pendant la nuit. Les bibliothèques constituées de clones bactériens exprimant l’ARNds, correspondant à environ 94% des gènes prédits de C. elegans, ont été précédemment construites22,23 et sont disponibles dans le commerce. La bibliothèque d’accompagnateurs utilisée ici a été construite par le laboratoire du Dr Richard Morimoto26.
  4. À l’aide de procédures stériles, ensemencez 75, 150 ou 250 μL de bactéries sur les plaques d’ARNi NGM de 12 puits, 40 mm et 6 puits ou 60 mm, respectivement. Marquez clairement le nom du gène cible sur la plaque. Les bactéries doivent couvrir 30 à 50% de la surface de la gélose et ne doivent pas toucher les bords de la plaque.
  5. Laissez les assiettes sécher pendant au moins 2 jours sur le banc à température ambiante, en gardant les plaques couvertes.
    REMARQUE: Les assiettes peuvent être incubées à 37 ° C pendant la nuit. Assurez-vous que les puits intérieurs sont secs avant d’utiliser ou de stocker les plaques. À toutes fins à long terme (c.-à-d. séchage ou entreposage), gardez les plaques dans l’obscurité. Les assiettes séchées et ensemencées peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à un mois.

3. Synchronisation non stressante des embryons

  1. Utilisez un pic à vers pour déplacer environ 100 œufs d’une plaque de ver non synchronisée vers une plaque NGM nouvellement ensemencée.
  2. Cultiver des animaux pendant 5 jours à 15 °C, 3,5 jours à 20 °C ou 2,5 jours à 25 °C. Les animaux devraient atteindre le premier jour de ponte.
    REMARQUE: Les vers sont généralement cultivés à 20 ° C. Cependant, différentes souches mutantes chaperonnes peuvent nécessiter des températures de culture spécifiques. Par exemple, de nombreuses souches sensibles à la température sont cultivées à 15 °C mais décalées à 25 °C pour exposer leur phénotype.
  3. Ajouter 1 mL de tampon M9 (Tableau 1) lentement et loin de la pelouse bactérienne. Faites pivoter la plaque de sorte que le tampon recouvre complètement la plaque. Ensuite, inclinez-le d’un côté et retirez le liquide de la plaque et lavez les animaux de la plaque.
    REMARQUE: Lors de l’utilisation d’animaux sensibles à la température ou de mutants chaperons, il est préférable de maintenir les tampons utilisés dans le protocole à la température de culture des animaux.
  4. Répétez l’étape 3.3 trois fois ou jusqu’à ce que tous les animaux soient lavés de la plaque.
  5. À l’aide d’une pointe en plastique standard, coupez un carré de gélose dans la plaque lavée où les œufs sont concentrés et placez le morceau de gélose sur une plaque NGM nouvellement ensemencée.
    REMARQUE: ~ 200 œufs sont nécessaires pour produire suffisamment d’animaux pondeurs; trop d’animaux consomment les bactéries trop rapidement. De faibles niveaux d’aliments peuvent avoir un impact sur la protéostasie27.
  6. Cultiver les animaux pendant 5 jours à 15 °C, 3,5 jours à 20 °C ou 2,5 jours à 25 °C. À ce stade, les plaques doivent être recouvertes d’œufs synchronisés.
    REMARQUE: Les animaux peuvent être déplacés vers une nouvelle plaque pendant une courte durée pour une synchronisation plus stricte. Cependant, il est important de n’utiliser que des adultes aux premiers stades de la ponte, car les animaux peuvent conserver des œufs dans leur utérus, ce qui a un impact sur la synchronisation.
  7. Ajouter 1 mL de tampon M9 lentement et loin de la pelouse bactérienne.
  8. Faites pivoter la plaque de sorte que le tampon recouvre complètement la plaque. Ensuite, inclinez-le d’un côté et retirez le liquide de la plaque et lavez les animaux de la plaque.
  9. Répétez l’étape 3.7 trois fois ou jusqu’à ce que tous les animaux soient lavés de la plaque.
  10. Ajouter 1 mL de tampon M9 et utiliser un grattoir à cellules pour libérer les œufs de la plaque.
  11. Recueillir le tampon M9 contenant les œufs des assiettes.
  12. Centrifuger le tampon M9 contenant les œufs à 3 000 x g pendant 2 min.
  13. Retirez le surnageant et ajoutez un tampon M9 pour atteindre un volume de 1 mL.
  14. Resuspendez les œufs pour perturber les morceaux d’œufs et de bactéries.
  15. Répétez cinq fois la procédure de lavage décrite aux étapes 3.11 à 3.13. La pastille d’œuf doit apparaître blanche. S’il est encore jaune/brun, répétez le lavage jusqu’à ce qu’une pastille blanche soit obtenue.
    REMARQUE: Les bactéries qui restent sur les œufs peuvent contaminer les bactéries exprimant l’ARNd.
  16. Retirez la majeure partie du surnageant, en laissant environ 200 μL. Les œufs synchronisés peuvent être utilisés pour les écrans aRNi.

4. Essais phénotypiques courants

  1. Culture d’animaux pendant les expériences
    1. Placez une goutte d’environ 30 œufs près de la pelouse bactérienne dans chaque assiette ensemencée d’ARNi. Pour référence, placez également environ 30 œufs sur des assiettes ensemencées de bactéries vides contenant des vecteurs (L4440).
    2. Cultivez des animaux synchronisés avec l’âge sur des plaques ensemencées d’ARNi NGM. La durée de l’expérience dépendra du stade auquel les animaux doivent être surveillés et de la température de culture. Ajuster la température de culture lors de l’utilisation d’animaux mutants sensibles à la température. Ajuster la durée de culture lors de l’utilisation d’animaux mutants retardés par le développement.
      REMARQUE: Bien que le moment puisse varier, une fois que les animaux atteignent l’âge adulte, la ponte (et la consommation alimentaire rapide qui en résulte), ainsi que la protéostse dépendante de l’âge s’effondrent28, pourraient avoir un impact sur les résultats. Il est donc recommandé de noter les animaux avant le début de la ponte (jour 1 de l’âge adulte). Les animaux de type sauvage atteignent ce stade après 4,5 jours à 15 °C, 3 jours à 20 °C ou 2 jours à 25 °C.
    3. Le nombre de répétitions utilisées dépendra de la taille de l’ensemble de gènes examiné. Pour la bibliothèque de chaperons (97 gènes), répétez les expériences au moins quatre fois. La taille de la population dépend du dosage utilisé. Dans les tests comportementaux discutés ici, le score >15 animaux par condition expérimentale dans chaque répétition. Les données et les analyses statistiques dépendent également fortement du type de test utilisé. Les données des essais discutés ici peuvent être présentées comme des moyens ± SEM.
    4. Comparer les animaux traités par ARNi et les animaux à vecteurs vides en tant que populations indépendantes. Les valeurs P peuvent être calculées à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle, en fonction des changements examinés, à savoir aggraver ou atténuer seul ou les deux. Lors de l’examen d’un seul traitement aRNi par rapport au contrôle, les valeurs de P peuvent être calculées à l’aide d’un test de somme de rang de Mann-Whitney unidirectrotique ou bidirectionnel. Outre la signification statistique, considérez un seuil de résultats en fonction du degré d’impact sur le phénotype.
  2. Arrêt/retard de développement
    1. Cultivez des animaux synchronisés avec l’âge comme à l’étape 4.1 jusqu’à ce que les animaux élevés sur des bactéries témoins contenant des vecteurs vides atteignent l’âge adulte, mais avant le début de la ponte.
    2. Surveillez les animaux à l’aide d’un stéréomicroscope et comptez le nombre de larves et d’adultes pour noter le pourcentage d’animaux ayant un retard de développement. À titre de référence, comparez avec des animaux mutants élevés sur des bactéries témoins vides contenant des vecteurs. Le traitement aRNi hsp-1 ou hsp-90 entraîne l’arrêt du développement des animaux de type sauvage et peut être utilisé comme témoin positif.
    3. Pour noter le pourcentage d’animaux retardés dans le développement au fil du temps, répétez l’étape 4.2.2.
      REMARQUE: S’il y a des adultes pondeurs dans l’assiette, transférez les animaux ayant un retard de développement vers une nouvelle plaque NGM-ARNi étiquetée pour le même gène cible afin d’éviter toute confusion avec la progéniture.
  3. Stérilité ou défauts de ponte
    1. Cultivez des animaux synchronisés avec l’âge comme à l’étape 4.1 jusqu’à ce que les animaux élevés sur des bactéries anti-vecteurs vides commencent à pondre des œufs.
    2. Surveillez les animaux à l’aide d’un stéréomicroscope et notez le pourcentage d’animaux sans œufs visibles dans leur utérus. À titre de référence, comparez avec des animaux mutants élevés sur des bactéries vectorielles vides.
    3. Alternativement, surveillez les animaux à l’aide d’un stéréomicroscope et notez le pourcentage d’animaux avec un utérus plein d’œufs, défini comme EGg Pondeur défectueux (Egl-d) phénotype29.
  4. Létalité embryonnaire
    1. Cultivez des animaux synchronisés avec l’âge comme à l’étape 4.1 jusqu’à ce que les animaux commencent à pondre des œufs.
    2. Transférer environ 100 œufs dans une assiette vide. Étalez les œufs en rangées pour simplifier le comptage.
    3. Marquez le pourcentage d’œufs non échatchés dans l’assiette après 24 à 48 heures. À titre de référence, comparez aux œufs d’animaux traités avec des bactéries antivectorielles vides.
  5. Test de paralysie
    1. Pour les adultes du jour 1, cultivez des animaux synchronisés avec l’âge comme à l’étape 4.1 jusqu’à ce que les animaux élevés sur des bactéries vectorielles vides atteignent l’âge adulte, mais avant le début de la ponte.
    2. Tracez une ligne au dos d’une plaque de gélose NGM ordinaire à l’aide d’un marqueur fin.
    3. Placez 5 à 10 animaux sur la ligne marquée.
    4. Réglez une minuterie et attendez 10 min.
    5. Marquez le pourcentage d’animaux restant sur la ligne en tant que vers paralysés. À titre de référence, comparez avec des animaux mutants élevés sur des bactéries vectorielles vides. Les animaux de type sauvage traités avec de l’ARNi unc-45 présentent un phénotype de paralysie sévère et peuvent être utilisés comme témoin positif.
      REMARQUE: Ce test met en évidence les animaux présentant une paralysie moyenne à sévère. Ces animaux sont généralement allongés droit sur la plaque, plutôt que de présenter la forme incurvée commune. De plus, un patch débarrassé des bactéries est visible autour de la tête des vers paralysés.
  6. Essai de thrashing
    1. Cultivez des animaux synchronisés avec l’âge comme à l’étape 4.1 jusqu’à ce que les animaux élevés sur des bactéries vectorielles vides atteignent l’âge adulte, mais avant le début de la ponte.
    2. Pipet 100 μL de tampon M9 à la température de culture des animaux dans une plaque de 96 puits.
    3. Placez environ 15 vers, un par puits, dans les puits contenant le tampon M9.
    4. Laissez les animaux s’ajuster pendant 5 min.
    5. Examinez chaque animal sous le stéréomicroscope, démarrez un compte à rebours de 15 s et comptez le nombre de flexions corporelles que chaque animal effectue au cours de cette période. Les valeurs comptées peuvent être normalisées en courbes corporelles par minute. À titre de référence, comparez avec des animaux mutants élevés sur des bactéries vectorielles vides.
      REMARQUE: Ce test de motilité est très sensible et peut détecter des différences très légères entre les traitements. Cependant, la motilité dans le liquide et la motilité sur la gélose peuvent différer.

5. Validation de l’élimination des protéines

  1. Placer 250 à 300 œufs synchronisés sur une plaque NGM-ARNi de 60 mm ensemencée avec la bactérie L4440 (L4440) exprimant l’ARNdS ou contenant un vecteur vide.
    REMARQUE: L’aRNi pourrait entraîner une accumulation aberrante d’embryons, un manque d’embryons ou un arrêt du développement qui pourrait avoir un impact sur l’expression des gènes. Cela doit être pris en compte lors de la détermination de l’âge des animaux à examiner.
  2. Pour les adultes du jour 1, cultiver des animaux pendant 4,5 jours à 15 °C, 3 jours à 20 °C ou 2 jours à 25 °C.
  3. Cueillez et transférez un total de 200 jeunes animaux adultes dans le bouchon d’un tube de remplissage de 1,5 mL avec 200 μL de PBS-T.
    REMARQUE: Lors de l’utilisation d’animaux sensibles à la température ou de mutants chaperons, il est préférable de maintenir les tampons utilisés dans le protocole à la température de culture des animaux.
  4. Fermez soigneusement le bouchon et centrifugez à 1 000 x g pendant 1 min.
  5. Ajouter 800 μL de PBS-T(tableau 1)et centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min.
  6. Retirez délicatement les 900 μL supérieurs.
  7. Répétez les étapes 5.4 à 5.6 trois fois.
  8. Retirer 900 μL, en laissant 100 μL de solution contenant les 200 vers.
  9. Ajouter 25 μL de tampon d’échantillon 5x (Tableau 1).
  10. Chauffer les échantillons pendant 10 min à 92°C tout en agitant à 1000 tr/min. Les échantillons peuvent ensuite être congelés et conservés à -20 °C.
  11. Chargez 20 μL de chaque échantillon et exécutez sur un gel SDS-PAGE.
  12. Effectuer une analyse par transfert western à l’aide d’anticorps appropriés pour déterminer la stabilité relative de la protéine.
  13. Déterminez l’intensité des bandes à l’aide d’un logiciel densitométrie, tel que le module gel ImageJ disponible gratuitement. Normaliser toutes les valeurs par rapport à celles mesurées dans le(s) échantillon(s) témoin(s).
    REMARQUE: L’objectif de l’ARNi dans nos écrans est de réduire les niveaux de protéines d’un chaperon / co-chaperon spécifique. Ainsi, la meilleure façon d’évaluer l’efficacité de l’ARNi knockdown est par l’analyse par transfert western. Cela nécessite des anticorps spécifiques. Alternativement, la qPCR peut être utilisée pour quantifier les niveaux d’ARNm.

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Representative Results

Utilisation de mutations sensibles à la température dans l’UNC-45 pour dépister les interactions aggravantes ou atténuantes dans des conditions permissives ou restrictives, respectivement
L’assemblage et l’entretien musculaires offrent un système efficace pour étudier les interactions des chaperons spécifiques aux tissus. L’unité fonctionnelle des muscles contractiles, le sarcomère, présente un arrangement cristallin de protéines structurelles et régulatrices. La stabilité de la protéine motrice myosine et son incorporation dans les filaments épais des sarcomères musculaires contractiles dépendent de la coopération des chaperons et des composants UPS30. Un exemple d’un tel chaperon est le chaperon de myosine conservé et spécialisé UNC-45 qui est principalement exprimé dans le muscle de la paroi du corps31,32,33,34,35. Il a été démontré que des mutations de l’UNC-45 induisent une désorganisation de la myosine et de graves défauts de motilité chez C. elegans31,36. Les modules tandem UNC-45 s’assemblent en une plate-forme d’amarrage multi-sites37 qui renforce la collaboration entre UNC-45, HSP-90 et HSP-1 et probablement d’autres chaperons et co-chaperons dans l’assemblage de filaments de myosine25,36,37,38. Pour confirmer les interactions connues de l’UNC-45 et identifier de nouvelles interactions génétiques dans la protéostasie musculaire, nous avons établi une stratégie utilisant des mutations unc-45 sensibles à la température de C. elegans comme fond génétique sensibilisé pour le dépistage de l’interaction chaperonne spécifique aux tissus19,25.

Substitutions d’acides aminés simples dans C. elegans UNC-45 (L822F et E781K, correspondant respectivement aux allèles e286 et m94; unc-45(ts)) sont responsables de défauts de motilité dépendant de la température et de phénotypes de désorganisation de la myosine lorsque les animaux affectés sont élevés dans des conditions restrictives (>22 °C). En revanche, ces mutants unc-45(ts) ne présentent aucun défaut de mouvement ou d’organisation de la myosine à la température permissive (15 °C)31. Dans l’approche proposée, les animaux unc-45(e286) synchronisés avec l’âge au premier stade larvaire (L1) ont été appauvris en différents chaperons moléculaires par l’ARNi (97 gènes), puis surveillés pour les défauts de motilité dans des conditions permissives (15 °C)(figure 1). Nous avons confirmé l’interaction connue des protéines UNC-45 et HSP-90 dans notre criblage des interactions génétiques et identifié trois co-chaperons hsp-90, sti-1, ahsa-1 et daf-41,comme causant spécifiquement un défaut de mouvement synthétique chez les animaux mutants unc-45(ts) mais pas chez les animaux de type sauvage25. Nous avons ensuite examiné si les phénotypes synthétiques associés aux sti-1-, ahsa-1 ou daf-41 étaientcausés par la désorganisation de la myosine en surveillant l’arrangement subcellulaire de la chaîne lourde de myosine A (MYO-3), en utilisant des techniques d’immuno-colorationétablies 39. Alors que le traitement des animaux de type sauvage avec de l’ARNi sti-1, ahsa-1 ou daf-41 n’a pas affecté l’organisation du myofilament, l’épuisement de ces gènes chez les animaux mutants unc-45(e286) a entraîné une perturbation complète des structures sarcomériques et une mauvaiselocalisation de MYO-3, même dans des conditions permissives (15 °C). Cet effet était comparable à ce qui a été observé avec les mutants simples unc-45(e286) cultivés à la température restrictive (25 °C)25. Ces résultats ont été confirmés en utilisant un autre allèle unc-45(ts)-, à savoir les animaux mutants unc-45(m94) 25.

Pour identifier les chaperons qui déstabilisent l’UNC-45, nous avons ensuite sélectionné les chaperons qui amélioraient la motilité des animaux unc-45(286) à 25 °C, en nous appuyant sur l’élimination des gènes par l’ARNi. Alors que les animaux mutants unc-45(e286) présentaient de graves défauts de mouvement à 25 °C, la motilité des animaux traités avec de l’ARNi contre les gènes codant pour quatre des 97 chaperons examinés a été considérablement améliorée. Ici aussi, les résultats ont été confirmés en utilisant des animaux mutants unc-45(m94). Ainsi, l’utilisation de mutations sensibles à la température permet d’établir à la fois des écrans aggravants et soulageants, en fonction de la température à laquelle l’écran est conduit.

Utilisation de la sur-expression tissulaire d’un chaperon pour dépister les interactions aggravantes
Nous avons ensuite utilisé la sur-expression tissulaire d’un seul chaperon comme une légère perturbation du réseau de chaperons musculaires à des fins de dépistage. Plus précisément, nous avons utilisé des animaux surexprimant le type sauvage dnj-24,codant pour l’homologue C. elegans de la protéine Hsp40 DNAJB6 dans le muscle de la paroi corporelle C. elegans (DNJ-24M). Comme ci-dessus, les animaux L1 DNJ-24M ont été traités avec de l’ARNi pour différents chaperons et surveillés pour les défauts de motilité (20 °C) (Figure 1). Alors que les animaux DNJ-24M ne présentaient aucun défaut de motilité notable, trois gènes (sur les 48 gènes codant pour chaperon examinés; 6%), à savoir hsp-1, rme-8et dnj-8, affectaient spécifiquement la motilité des animaux exprimant DNJ-24M, mais pas les animaux de type sauvage. Il est à noter que le test de la spécificité des coups chez des animaux surexprimant un chaperon différent, à savoir HSP-90, dans le muscle (HSP90M), n’a montré aucun effet sur la motilité HSP90M sur le traitement hsp-1, rme-8ou dnj-8 ARNi40. Dans l’ensemble, la plate-forme de dépistage, utilisant une légère perturbation du réseau de chaperons, telle que l’expression de protéines mutantes métastables ou une sur-expression spécifique aux tissus, a entraîné un taux de réussite très spécifique (normalement ~ 5%).

Utilisation d’ARNi spécifiques aux tissus pour dépister les interactions génétiques spécifiques aux tissus
Les souches sensibles à l’ARNi spécifiques aux tissus permettent l’élimination des gènes spécifiques aux tissus tout en utilisant l’alimentation bactérienne pour l’administration d’ARNds. Ces souches sont mutantes de la protéine argonaute RDE-1, un composant majeur de la voie ARNi nécessaire à un silençage génique efficace21. Cependant, l’expression du type sauvage RDE-1 sous le contrôle d’un promoteur spécifique au tissu a conduit à un gène efficace spécifique au tissuknockdown 41,42. Cet outil permet ainsi des écrans d’interaction génétique sans utiliser de chaperons spécifiques aux tissus, tels que UNC-45 ou DNAJ-24M. Par exemple, l’élimination de l’hsp-6 (mortaline) chez les animaux de type sauvage au cours du développement a entraîné un fort arrêt du développement (96±1% des animaux traités à l’ARNi). Dans le même temps, l’élimination de hsp-6 dans une souche exprimant le type sauvage RDE-1 dans le muscle n’a pas provoqué d’arrêt du développement, tandis que l’expression du type sauvage RDE-1 dans les cellules intestinales a entraîné un fort phénotype d’arrêt du développement (90±3%; Figure 2). Ainsi, la fonction HSP-6 dans les cellules intestinales est nécessaire pour un développement normal. Une mutation de hsp-6 (mg585) qui provoque un léger retard de croissance peut donc être utilisée pour dépister les interactions d’accompagnateur aggravant ou atténuant les interactions des chaperons en croisant ce gène muté en une souche d’ARNi spécifique à l’intestin et en examinant la bibliothèque d’ARNi chaperon.

Surveillance des changements dépendant de l’âge dans l’environnement de repliement à l’aide d’interactions génétiques
Les animaux montrent un déclin de la motilité dépendant de l’âge qui est associé à une désorganisation sarcomérique43,44,45. Les changements dans la capacité de repliement des protéines coïncident avec une régulation et une composition modifiées de la machinerie de protéostasie cellulaire28, y compris des niveaux modifiés de UNC-45, CHN-1 et UFD-2, protéines de la machinerie de contrôle de la qualité musculaire46. En accord, le repliement et la dégradation de la myosine sont affectés par des altérations de la capacité protéostatique au passage à l’âge adulte47. Nous avons donc demandé si de tels changements pouvaient avoir un impact sur les interactions des accompagnateurs. Par exemple, nous avons surveillé l’impact de sti-1, ahsa-1 et daf-41 knockdown sur la motilité au fil du temps. Nous avons constaté que bien que les animaux traités sti-1-, ahsa-1- et daf-41-ARNi présentaient une motilité réduite au cours du développement larvaire, la motilité diminuait fortement chez les vers adultes unc-45 (ts). De plus, l’organisation de MYO-3 chez les animaux mutants unc-45(ts) traités avec de l’ARNi sti-1, ahsa-1 ou daf-41 était similaire à celle des vers de type sauvage au quatrième stade larvaire (L4), bien que les mutants aient présenté des sarcomères perturbés après que les animaux aient atteint l’âge adulte(Figure 3). En revanche, les animaux mutants unc-45(ts) traités avec un vecteur de contrôle vide et les animaux de type sauvage sont restés inchangés (Figure 3). Ainsi, la dynamique de la protéostase en fonction de l’âge ou des conditionsenvironnementales 27,45,46,48,49 pourrait avoir un impact critique sur les interactions des accompagnateurs.

Figure 1
Figure 1 : Mise en place d’écrans d’interaction synthétique de l’ARNi à l’aide de C. elegans porteur d’une mutation dans un gène codant pour un chaperon d’intérêt. (A) Représentation schématique de la configuration de base des écrans d’interaction chaperon ciblés. (B) La validation de l’ARNi nécessite la confirmation de l’interaction génétique à l’aide d’un autre mutant chaperon, ainsi que la validation de la spécification de l’ARNi knockdown. (C-D) Des lectures simples, telles que les défauts de motilité, peuvent être quantifiées pour déterminer les interactions aggravantes ou atténuantes, en utilisant respectivement des tests de paralysie ou de battement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : L’ARNi spécifique au tissu du chaperon mitochondrial hsp-6 peut être utilisé pour examiner les interactions génétiques dans un tissu. Les souches d’ARNi spécifiques de type intestin et musculaire sauvage ont été traitées avec de l’ARNi hsp-6 et (A) un retard de développement a été noté ou (B) des images ont été prises le premier jour de l’âge adulte. Les données sont moyennes ± SEM, N =6. La barre d’échelle est de 1 mm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Effets de l’ARNi dépendant de l’âge. (A) Motilité avec l’âge. Des embryons de type sauvage ou unc-45(e286) ont été placés sur des plaques ensemencées d’ARNi sti-1, ahsa-1 ou daf-41 à 15 °C et marqués pour la motilité à l’aide d’un test de battement à chaque stade de développement, L1-L4, jeune adulte et jour 1 de l’âge adulte. Les données sont moyennes ± SEM, N = 15. (B) Images confocales du muscle de la paroi corporelle. Les animaux ont été traités comme dans A et fixés au stade L4, jeune adulte et jour 1 de l’âge adulte et immuno-colorés avec des anticorps anti-MYO-3. La barre d’échelle est de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Solution Instructions de préparation Stockage
1 m CaCl2 (1 L) Ajouter 147,01 g caCl2·2H2O Magasin chez RT
Ajouter dH2O à 1 L
Autoclave ou filtre (0,22 μm)
1 M KH2PO4, pH 6,0 (1 L) Ajouter 136,09 g KH2PO4 Magasin chez RT
Ajouter 800 mL dH2O
Mélanger à l’aide d’un agitateur magnétique jusqu’à dissolution
Titrer le pH à l’aide de KOH
Ajouter dH2O à 1 L
Autoclave ou filtre (0,22 μm)
1 m MgSO4 (1 l) Ajouter 248,58 g MgSO4·7H2O Magasin chez RT
Ajouter dH2O à 1 L
Autoclave ou filtre (0,22 μm)
Solution de cholestérol (50 mL) Ajouter 250 mg de cholestérol à un tube Falcon de 50 mL Conserver à -20 °C
Dissoudre complètement dans 40 mL d’éthanol
Ajouter l’éthanol à 50 mL
1 M IPTG (50 mL) Ajouter 11,9 g d’IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) à un tube Falcon de 50 mL Conserver dans l’obscurité à -20 °C
Dissoudre complètement dans 40 mL dH2O
Ajouter dH2O à 50 mL
Filtre (0,22 μm), tubes aliquotes de 1 mL
Stock d’ampicilline (50 mL) Ajouter 5 g d’ampicilline dans un tube Falcon de 50 mL Conserver à -20 °C
Dissoudre complètement dans 40 mL dH2O
Ajouter dH2O à 50 mL
Filtre (0,22 μm), répartir 1 mL d’aliquote dans les tubes d’Eppendorf
Stock de tétracycline (50 mL) Ajouter 250 mg de tétracycline dans un tube Falcon de 50 mL Conserver à -20 °C
Dissoudre complètement dans 40 mL d’éthanol
Ajouter l’éthanol à 50 mL
Aliquote 1 mL tubes
Tampon M9 (1 L) Ajouter 5,8 g de Na2HPO4·7H2O Magasin chez RT
Ajouter 3 g de KH2PO4
Ajouter 5 g de NaCl
Ajouter 0,25 g MgSO4·7H2O
Ajouter dH2O à 1 L
Filtre (0,22 μm)
1X PBS-T (pH 7,4) ( 1 L) Ajouter 8 g de NaCl Magasin chez RT
Ajouter 200 mg de KCl
Ajouter 1,44 g de Na2HPO4·7H2O
Ajouter 240 mg KH2PO4
Dissoudre complètement dans 800 mL dH2O
Titrer le pH à l’aide de KOH tp pH 7,4
Ajouter 500 μL Tween-20
Ajouter dH2O à 1 L
5x tampon d’échantillon Ajouter 6,8 mL dH2O Conserver à -20 °C
Ajouter 2 mL 0.5M Tris pH 6.8
Ajouter 3,2 mL de glycérol
Ajouter 1,6 mL 20 % de FDS
Ajouter 0,8 mL de ß-mercaptoéthanol
1% de bleu de bromophénol

Tableau 1 : Recettes de solutions

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Discussion

Une image intégrée du réseau de protéostasie reflétant son organisation et son fonctionnement dans différentes cellules et tissus métazoaires fait toujours défaut. Pour remédier à cette lacune, des informations spécifiques sur les interactions des différents composants de ce réseau, tels que les chaperons moléculaires, dans des tissus spécifiques au cours du développement et du vieillissement sont nécessaires. Ici, nous avons montré comment l’utilisation de perturbations spécifiques aux tissus nous a permis d’examiner le réseau de chaperons dans un tissu donné. Pour explorer les interactions génétiques des chaperons spécifiques aux tissus, trois approches différentes ont été envisagées. Dans la première approche, UNC-45, un chaperon fortement exprimé dans les cellules musculaires, a été utilisé pour dépister les interactions des chaperons via l’alimentation-ARNi25. Bien que l’utilisation d’un chaperon spécialisé permette de discerner la spécificité tissulaire, il ne peut rendre compte que du sous-réseau hautement ciblé auquel il contribue. Notez que la plupart des neurones de C. elegans sont résistants à l’administration d’ARNi50 à base d’alimentation et donc l’utilisation de cette approche pour identifier les interactions génétiques dans les cellules neuronales nécessite de croiser le chaperon mutant examiné avec une souche51améliorée par l’ARNi. Dans une deuxième approche, un promoteur spécifique au tissu a été utilisé pour conduire la sur-expression d’un chaperon dans le muscle et ainsi affecter spécifiquement l’environnement de repliement musculaire40. Cependant, la sur-expression d’un seul chaperon pourrait généralement être bénéfique pour l’environnement de pliage et donc masquer la perturbation causée par les deux chaperons ensemble. La troisième approche s’appuyait sur l’ARNi spécifique aux tissus pour examiner les interactions des chaperons dans un tissu41donné. L’un des avantages de cette approche est qu’elle permet de cibler les cellules neuronales résistantes à l’administration d’ARNi via l’alimentation42. Néanmoins, cette approche nécessite l’utilisation d’un mutant léger (bien que non spécialisé), ainsi que le croisement de ce mutant en un mutant nul rde-1 portant un gène de secours rde-1 spécifique au tissu. Il est important de savoir si ces approches peuvent être combinées de manière à moduler potentiellement la fonction du chaperon dans un seul tissu ou même une seule cellule.

La machinerie de contrôle de la qualité peut avoir un impact sur la fonction de nombreux produits génétiques en perturbant la protéostase. Il s’agit d’un défi majeur lors de l’utilisation des interactions génétiques pour explorer le réseau de contrôle de la qualité18. Par exemple, l’expression chronique de protéines sujettes à l’agrégation ou l’effondrement de la protéostasie dans le vieillissement a entraîné une aggravation phénotypique de nombreuses protéines métastables non apparentées chez C. elegans et la levure45,52,53. De plus, l’endocytose médiée par la clathrine dans les cellules de mammifères a été inhibée lors de la séquestration fonctionnelle de Hsc70 dans les agrégats de protéines. Pourtant, il a été démontré que l’endocytose pouvait être sauvée par la sur-expression de Hsc70, alors que l’agrégation ne pouvait pas54,55. De même, un cribage génétique chez la drosophile conçu pour découvrir les régulateurs de la réponse au choc thermique a identifié une mutation faux sensée de l’actine musculaire de vol qui a activé de manière constitutive la réponse au choc thermique56. Dans l’ensemble, la perturbation du réseau de protéostasie peut exposer des protéines métastables ou induire un stress pouvant avoir un impact sur la spécificité du résultat. Néanmoins, l’analyse des interactions génétiques peut donner des informations très spécifiques et fonctionnelles. Par exemple, des analyses épistatiques des gènes de levure nécessaires au repliement dans le réticulum endoplasmique ont permis d’identifier des interactions génétiques spécifiques entre chaperons moléculaires qui ont ensuite été validées19. De même, un dépistage aggravant pour les accompagnateurs qui améliorent la toxicité de deux modèles sujets à l’agrégation (mesurée par la motilité) a identifié un sous-ensemble spécifique de 18 chaperons, dont les orthologues ont eu un impact sur l’agrégation de la huntingtine dans les cellules humaines26. Ici, nous avons montré que diverses perturbations du réseau de protéostasie peuvent révéler des interactions spécifiques et fonctionnelles avec des chaperons.

Le principal avantage de l’utilisation d’écrans d’interaction génétique basés sur l’alimentation en ARNi est la simplicité relative de la méthode. Même l’utilisation d’un résultat comportemental général, tel que la motilité, peut révéler de nouvelles interactionsgénétiques (Figure 3). Cependant, la variabilité et les effets partiels de l’expression knockdown peuvent limiter la robustesse et la spécificité des résultats57. De plus, les interactions génétiques ne sont pas révélatrices d’interactions physiques et la relation entre deux gènes pourrait donc être indirecte. L’exploration de la nature des interactions et l’élimination des interactions non spécifiques peuvent prendre beaucoup de temps57,58,59. Il s’agit d’une préoccupation qui doit être abordée dans la configuration et la validation de l’écran. Par exemple, l’utilisation d’allèles nuls dans le dépistage génétique permet de déterminer si ces gènes fonctionnent dans les mêmes voies ou dans des voies distinctes dans un processus biologique donné. Cependant, l’utilisation d’une perte partielle de la fonction génique, d’allèles hypomorphes, tels que les allèles sensibles à la température ou d’une régulation descendante de l’expression dépendante de l’ARNi, entraîne des activités résiduelles qui peuvent produire des phénotypes aggravants ou soulageants, que les gènes agissent dans les mêmes voies ou dans des voies parallèles59. Ainsi, la nature de toute interaction nécessite une analyse plus approfondie. Cependant, l’utilisation d’allèles hypomorphes et d’ARNi pourrait identifier un large éventail d’interacteurs, y compris des gènes dans le même complexe protéique ou voie ou dans une voie redondante59. Bien que cette plus grande portée d’interactions possibles puisse donner plus de résultats dans un écran génétique, elle peut également conduire à des interactions non spécifiques, telles que, par exemple, l’exposition non spécifique d’allèles sensibles à la température dans l’effondrement de la protéostasie45,53.

La validation des résultats et les interactions non spécifiques peuvent être examinées de plusieurs manières. Le nombre de visites devrait être faible. Par exemple, la régulation à la baisse de l’expression des chaperons dans un fond de mutant unc-45 a entraîné un faible pourcentage de résultats (4%), la plupart des gènes des chaperons ne montrant aucun effet sur la motilité. Un taux similaire a été observé lorsque DNJ-24M était sur-exprimé (6%). Comme indiqué ci-dessus, un dépistage des interactions des chaperons avec des protéines sujettes à l’agrégation a permis d’identifier 18 chaperons sur 219 dépistés (8 %).

Plusieurs allèles mutants, lignes de sur-expression ou modèles de maladies doivent être utilisés. L’utilisation de différents allèles mutants qui ont des impacts différents sur la fonction des chaperons, ainsi que de différentes souches avec des antécédents génétiques différents, peut soutenir la spécificité de tous les coups d’écran. Alternativement, l’utilisation d’une mutation ou d’une sur-expression d’un chaperon différent qui ne conduit pas à une perturbation similaire peut servir de contrôle négatif. Par exemple, unc-45(e286) et unc-45(m94) ont montré un comportement aggravant lorsque sti-1, ahsa-1 ou daf-41 ont été régulés à la baisse. De plus, une interaction similaire a été observée lorsque des animaux porteurs du mutant de délétion ahsa-1(ok3501) ont été traités avec de l’ARNi hsp-90 25.

L’identité des coups d’accompagnateur et leurs interactions connues doivent être examinées. Par exemple, les chaperons identifiés dans un écran aggravant unc-45 sont un ensemble très spécifique de chaperons requis pour le cycle ATPase HSP-90, y compris ceux qui encodent un recruteur client (STI-1), un co-chaperon remodelant (AHSA-1) et un co-chaperon de maturation client (DAF-41). En fait, cet ensemble de co-chaperons forme un cycle de pliage complet HSP-9060. De même, un écran DNJ-24M a identifié HSP-1, le principal partenaire chaperon de Hsp40s40.

Les changements dans les interactions au cours de la durée de vie de l’animal doivent également être examinés. Par exemple, les accompagnateurs identifiés dans le dépistage aggravant unc-45 ont fortement eu un impact sur la motilité et l’organisation de la myosine à l’âge adulte, mais ont eu un effet plus léger au cours du développement. Cela pourrait être dû à des changements dans le réseau de protéostasie à l’âge adulte28 ou à des changements dans les besoins de repliement de la myosine entre le repliement des myofibres et l’entretien.

Utilisez des approches biochimiques complémentaires pour examiner directement les interactions entre les protéines, ainsi que leur localisation dans la cellule. Par exemple, les co-chaperons HSP-90, STI-1, AHSA-1 et DAF-41, sont localisés au sarcomère où ils interagissent avec la myosine25.

C. elegans est un modèle métazoaire bien établi pour la surveillance du contrôle de la qualité. Il est souvent utilisé pour surveiller la protéostasie cellulaire et de l’organisme à l’aide d’une boîte à outils variable de biologie cellulaire, d’approches biochimiques et génétiques. Ici, nous avons utilisé des approches de dépistage génétique et des outils disponibles57,58,59, tels qu’une banque de mutants, des bibliothèques d’ARNi disponibles22,23 et des souches d’ARNi spécifiques aux tissus41,42, pour surveiller les interactions des chaperons chez un animal vivant pendant le développement et le vieillissement. L’utilisation de tests comportementaux simples, tels que la motilité, simplifie le dépistage de nombreuses paires de gènes possibles pour explorer de nouvelles interactions génétiques. Cela peut ensuite servir de plate-forme pour explorer davantage la localisation des chaperons et les interactions physiques à l’aide d’outils biochimiques pour étudier mécaniquement leurs interactions potentielles in vivo et in vitro. Le protocole décrit ici a été utilisé avec succès pour identifier de nouvelles interactions de chaperon dans le muscle de la paroi corporelle de C. elegans 25,40.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions le Caenorhabditis Genetics Center, financé par le NIH National Center for Research Resources (NCRR), pour certaines des souches de nématodes. Les anticorps monoclonaux développés par H.F. Epstein ont été obtenus à partir de la Developmental Studies Hybridoma Bank développée sous les auspices du NICHD et maintenue par le Département de biologie de l’Université de l’Iowa. Cette recherche a été soutenue par une subvention de la Fondation israélienne pour la science (subvention n° 278/18) et par une subvention du ministère israélien de la Science et de la Technologie et du ministère des Affaires étrangères et de la Coopération internationale, Direction générale de la promotion des pays, République italienne (subvention n° 3-14337). Nous remercions les membres du laboratoire Ben-Zvi pour leur aide dans la préparation de ce manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologie Numéro 160 Caenorhabditis elegans chaperon interactions génétiques protéostase ARNi écran sensible à la température
Utilisation de <em>Caenorhabditis elegans</em> pour dépister les interactions tissulaires spécifiques des chaperons
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Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., … More

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).

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