为了研究分子伴侣与分子伴侣之间以及分子伴侣与底物之间的相互作用，我们在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中进行合成相互作用筛选，利用RNA干扰结合分子伴侣的轻度突变或过表达，并在整体生物水平上监测组织特异性的蛋白质功能障碍。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质及蛋白质复合物的正确折叠与组装对细胞功能至关重要。细胞通过质量控制通路来修复、隔离或清除受损蛋白质，以维持健康的蛋白质组，从而确保细胞内的蛋白质稳态，并防止进一步的蛋白质损伤。由于蛋白质稳态网络中存在功能冗余，在多细胞生物Caenorhabditis elegans中，通过基因敲低或突变编码分子伴侣的基因进行表型筛选时，大多数情况下仅能观察到微弱或无明显表型。我们开发了一种靶向筛选策略，用于鉴定特定功能所必需的分子伴侣，从而弥合表型与功能之间的鸿沟。具体而言，我们利用RNAi合成相互作用筛选来监测新的分子伴侣相互作用，即在携带编码分子伴侣基因突变或过表达特定分子伴侣的动物中，逐一敲低各个分子伴侣的表达。通过同时干扰两个单独情况下无显著表型的分子伴侣，我们能够发现当两者同时被扰动时会加剧或揭示特定表型的分子伴侣。我们证明，该方法可鉴定出共同作用的一组特定分子伴侣，它们协同调控与特定表型相关的蛋白质或蛋白质复合物的折叠过程。
引言
细胞通过质量控制机制来应对蛋白质损伤，这些机制能够修复、隔离或清除受损蛋白质1,2。蛋白质复合物的折叠和组装由分子伴侣支持，分子伴侣是一类高度保守且种类多样的蛋白质，能够修复或隔离受损蛋白质3,4,5,6,7。受损蛋白质的清除主要由泛素-蛋白酶体系统（UPS）8或自噬机制9介导，并在伴侣蛋白的协同作用下完成10,11,12。因此，蛋白质稳态（proteostasis）由包括折叠和降解机制在内的质量控制网络共同维持3,13。然而，理解体内蛋白质稳态网络中各组分之间相互作用仍是一个重大挑战。尽管蛋白质-....
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方案
1. RNAi 用线虫生长培养基平板的制备
- 在1 L的瓶子中加入3 g NaCl、2.5 g Bacto-Peptone、17 g琼脂，并加入蒸馏水至1 L，然后进行高压灭菌。
- 将瓶子冷却至55 °C。
- 加入25 mL 1 M KH2PO4（pH 6.0）、1 mL 1 M CaCl2、1 mL 1 M MgSO4和1 mL胆固醇溶液（表1），配制成线虫生长培养基（NGM）。
- 加入1 mL氨苄青霉素（100 mg/mL）和0.5 mL 1 M IPTG（表1），制成NGM-RNAi溶液。
注意：常用的HT115(DE3) E. coli细菌含有IPTG可诱导的T7 DNA聚合酶，用于表达编码双链RNA的质粒。这些质粒同时编码氨苄青霉素抗性。 - 通过轻轻旋转瓶子使温热的溶液混合均匀。
- 在生物安全柜中或无菌操作条件下，将NGM溶液倒入培养板中，或使用蠕动泵将溶液分配至培养板中。本实验可使用6孔、12孔、40 mm或60 mm的培养板。琼脂应填充约2/3的板深。
- 将培养板在室温下置于实验台上过夜晾干，期间保持盖子盖好。用于RNAi的NGM平板可在4 °C保存长达一个月。
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结果
利用 UNC-45 的温度敏感型突变，在许可或限制条件下分别筛选加重或缓解的遗传相互作用
肌肉的组装与维持为研究组织特异性分子伴侣相互作用提供了一个有效的体系。收缩肌的功能单位——肌节，其结构蛋白和调控蛋白呈类晶体状排列。运动蛋白肌球蛋白的稳定性及其整合到收缩肌肌节的粗肌丝中，依赖于分子伴侣与泛素-蛋白酶体系统（UPS）组分的协同作用30。其中一个典型的分子伴侣是进化上保守且特化的肌球蛋白分子伴侣 UNC-45，其主要在体壁肌中表达31,32,33,34,35。研究表明，UNC-45 的突变可导致秀丽隐杆线虫（C. elegans）中肌球蛋白排列紊乱以及严重的运动缺陷
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讨论
目前仍缺乏对蛋白质稳态网络的整体性认识，特别是其在不同多细胞动物细胞和组织中的组织方式与功能运作机制。为弥补这一不足，亟需获得有关该网络中各种组分（如分子伴侣）在发育和衰老过程中特定组织内相互作用的具体信息。本文展示了如何利用组织特异性扰动来研究特定组织中的伴侣蛋白网络。为探究组织特异性的伴侣蛋白遗传相互作用，我们考虑了三种不同的方法。第一种方法利用UNC-45（一种在肌肉细胞中高表达的伴侣蛋白），通过饲喂法RNAi筛选伴侣蛋白间的相互作用25。尽管使用特化的伴侣蛋白有助于揭示组织特异性，但它仅能反映其自身所参与的特定子网络的情况。需要注意的是，大多数 C. elegans 神经元对基于饲喂的RNAi递送具有抗性50，因此若采用此方法鉴定神经元细胞中的遗传相互作用，需将所研究的伴侣蛋白突变体与一种增强RNAi效应的品系进行杂交51。第二种方法是利用组织特异性启动子驱动伴侣蛋白在肌肉组织中的过表达，从而特异性地影响肌肉细胞的蛋白质折叠环境40<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢由美国国立卫生研究院（NIH）研究资源国家中心（NCRR）资助的秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center）提供部分线虫品系。由H.F. Epstein研发的单克隆抗体购自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank），该库在国立儿童健康与人类发展研究所（NICHD）的指导下建立，并由爱荷华大学（University of Iowa）生物学系负责维护。本研究得到了以色列科学基金会（grant No. 278/18）以及以色列科学部资助项目的资助。 & 技术部以及意大利共和国外交与国际合作部国家推广总局（项目编号：3-14337）提供资助。感谢Ben-Zvi实验室成员在本手稿准备过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12孔板 | SPL | BA3D16B | |
| 40 mm 培养皿 | Greiner Bio-one | 627160 | |
| 60 mm 培养皿 | Greiner Bio-one | 628102 | |
| 6孔板 | Thermo Scientific | 140675 | |
| 96孔 2 mL 128.0/85mm | Greiner Bio-one | 780278 | |
| 琼脂 | Formedium | AGA03 | |
| 氨苄青霉素 | Formedium | 69-52-3 | |
| 溴酚蓝 | Sigma | BO126-25G | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | |
| 相机 | Qimaging | q30548 | |
| 胆固醇 | Amresco | 0433-250G | |
| 共聚焦显微镜 | Leica | DM5500 | |
| 滤器（0.22 µm） | Sigma | SCGPUO2RE | |
| 荧光体视显微镜 | Leica | MZ165FC | |
| 甘油 | Frutarom | 2355519000024 | |
| IPTG | Formedium | 367-93-1 | |
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873.1000 | |
| KOH | Bio-Lab | 001649029100 | |
| MgSO4 | Fisher | 22189-08-8 | 由Morimoto实验室馈赠 |
| 肌球蛋白MHC A（MYO-3）抗体 | Hybridoma Bank | 5-6 | |
| Na2HPO4·7H2O | Sigma | s-0751 | |
| NaCl | Bio-Lab | 001903029100 | |
| 蛋白胨 | Merck | 61930705001730 | |
| 平板倾注泵 | Integra | does it p920 | |
| RNAi分子伴侣文库 | NA | NA | |
| SDS | VWR Life Science | 0837-500 | |
| ß-巯基乙醇 | Bio world | 41300000-1 | |
| 体视显微镜 | Leica | MZ6 | |
| 四环素 | Duchefa Biochemie | 64-75-5 | |
| Tris | Bio-Lab | 002009239100 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 |
参考文献
- Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
- Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E.
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重印与许可
