Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Caenorhabditis elegans gebruiken om te screenen op weefselspecifieke chaperonne-interacties

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61140
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Summary

Om chaperonne-chaperonne- en chaperonne-substraatinteracties te bestuderen, voeren we synthetische interactiescreenings uit in Caenorhabditis elegans met behulp van RNA-interferentie in combinatie met milde mutaties of overexpressie van chaperonnes en monitoren we weefselspecifieke eiwitdisfunctie op organismaal niveau.

Abstract

Correcte vouwing en assemblage van eiwitten en eiwitcomplexen zijn essentieel voor de cellulaire functie. Cellen maken gebruik van kwaliteitscontroleroutes die beschadigde eiwitten corrigeren, sequesteren of elimineren om een gezond proteoom te behouden, waardoor cellulaire proteostase wordt gewaarborgd en verdere eiwitschade wordt voorkomen. Vanwege redundante functies binnen het proteostasenetwerk resulteert screening op detecteerbare fenotypes met behulp van knockdown of mutaties in chaperonne-coderende genen in het meercellige organisme Caenorhabditis elegans in de meeste gevallen in de detectie van kleine of geen fenotypen. We hebben een gerichte screeningsstrategie ontwikkeld om chaperones te identificeren die nodig zijn voor een specifieke functie en zo de kloof tussen fenotype en functie te overbruggen. In het bijzonder monitoren we nieuwe chaperonne-interacties met behulp van synthetische interactieschermen van RNAi, knock-down chaperone-expressie, één chaperone tegelijk, bij dieren die een mutatie dragen in een chaperonne-coderend gen of een chaperonne van belang overexpressie. Door twee chaperones te verstoren die individueel geen grof fenotype vertonen, kunnen we chaperones identificeren die een specifiek fenotype verergeren of blootleggen wanneer beide verstoord zijn. We tonen aan dat deze benadering specifieke sets chaperones kan identificeren die samen functioneren om de vouwing van een eiwit of eiwitcomplexen geassocieerd met een bepaald fenotype te moduleren.

Introduction

Cellen gaan om met eiwitschade door gebruik te maken van kwaliteitscontrolemachines die beschadigde eiwitten repareren, opsnijven of verwijderen1,2. Vouwen en assembleren van eiwitcomplexen worden ondersteund door moleculaire chaperonnes, een diverse groep van sterk geconserveerde eiwitten die beschadigde eiwitten kunnen herstellen of afslinden3,4,5,6,7. De verwijdering van beschadigde eiwitten wordt gemedieerd door het ubiquitine-proteasoomsysteem (UPS)8 of door de autofagiemachines9 in samenwerking met chaperones10,11,12. Eiwithomeostase (proteostase) wordt daarom in stand gehouden door kwaliteitscontrolenetwerken die bestaan uit vouw- en afbraakmachines3,13. Het begrijpen van de interacties tussen de verschillende componenten van het proteostasenetwerk in vivo is echter een grote uitdaging. Hoewel eiwit-eiwitinteractieschermen belangrijke informatie bijdragen over fysieke interacties en chaperonnecomplexen14,15, ontbreekt het aan inzicht in de organisatie en compensatiemechanismen binnen weefselspecifieke chaperonnenetwerken in vivo.

Genetische interacties worden vaak gebruikt als een krachtig hulpmiddel om de relatie te onderzoeken tussen paren van genen die betrokken zijn bij gemeenschappelijke of compenserende biologische routes16,17,18. Dergelijke relaties kunnen worden gemeten door paren van mutaties te combineren en de impact van een mutatie in één gen op de fenotypische ernst veroorzaakt door een mutatie in het tweede gen te kwantificeren16. Hoewel de meeste van dergelijke combinaties geen effect hebben in termen van fenotype, kunnen sommige genetische interacties de ernst van het gemeten fenotype verergeren of verlichten. Verergerende mutaties worden waargenomen wanneer het fenotype van de dubbele deletiemutant ernstiger is dan het verwachte fenotype dat wordt gezien bij het combineren van de mutanten met enkele deletie, wat impliceert dat de twee genen in parallelle routes functioneren, samen een bepaalde functie beïnvloeden. Daarentegen worden verlichtende mutaties waargenomen wanneer het fenotype van de dubbele deletiemutant minder ernstig is dan het fenotype dat wordt gezien met de mutanten met enkele deletie, wat impliceert dat de twee genen samen als een complex werken of deelnemen aan dezelfde route16,18. Dienovereenkomstig zijn diverse fenotypen die kunnen worden gekwantificeerd, waaronder brede fenotypen, zoals letaliteit, groeisnelheden en broedgrootte, evenals specifieke fenotypen, zoals transcriptionele verslaggevers, gebruikt om genetische interacties te identificeren. Jonikas et al. vertrouwden bijvoorbeeld op een ER-stressverslaggever om interacties van het Saccharomyces cerevisiae ER ontvouwde eiwitresponsproteostase-netwerk te onderzoeken met behulp van paarsgewijze gendeletieanalyses19.

Genetische interactieschermen omvatten het systematisch kruisen van paarsgewijze deletiemutaties om een uitgebreide set dubbele mutanten te genereren20. In diermodellen, en specifiek in C. elegans, is deze grootschalige aanpak echter niet haalbaar. In plaats daarvan kunnen gemuteerde stammen worden getest op hun genetische interactiepatronen door genexpressie te downreguleren met behulp van RNA-interferentie (RNAi)21. C. elegans is een krachtig systeem voor schermen op basis van RNAi22,23. In C. eleganswordt dubbelstrengs RNA (dsRNA) levering bereikt door bacteriële voeding, wat leidt tot de verspreiding van dsRNA-moleculen naar talrijke weefsels. Op deze manier beïnvloeden de geïntroduceerde dsRNA-moleculen het dier via een snelle en eenvoudige procedure21. Een genetische interactiescreening met behulp van RNAi kan daarom de impact onthullen van het downreguleren van een set genen of de meeste C. elegans-coderende genen met behulp van RNAi-bibliotheken24. In zo'n scherm zijn hits die van invloed zijn op het gedrag van de mutant van belang, maar niet de wildtype stam potentiële modifiers van het fenotype die worden gecontroleerd25. Hier passen we een combinatie van mutaties en RNAi-screening toe om systematisch weefselspecifieke chaperonne-interacties in C. elegansin kaart te brengen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van nematodengroeimediaplaten voor RNAi

  1. Voeg aan een fles van 1 L 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Pepton, 17 g agar en gedestilleerd water tot 1 L en autoclaaf toe.
  2. Koel fles tot 55 °C.
  3. Voeg 25 ml 1 M KH2PO4,pH 6,0, 1 ml 1 m CaCl2,1 ml 1 m MgSO4en 1 ml cholesteroloplossing(tabel 1)toe om nematodengroeimedia (NGM) te maken.
  4. Voeg 1 ml ampicilline (100 mg/ml) en 0,5 ml 1 m IPTG(tabel 1)toe om NGM-RNAi-oplossing te maken.
    OPMERKING: Veelgebruikte HT115 (DE3) E. coli-bacteriën bevatten een IPTG-induceerbare T7 DNA-polymerase dat wordt gebruikt voor het tot expressie brengen van de dsRNA-coderende plasmiden. Deze plasmiden coderen ook voor ampicillineresistentie.
  5. Meng de warme oplossing door de fles te draaien.
  6. Giet in de kap of met behulp van steriele procedures de NGM-oplossing in platen of gebruik een peristaltische pomp, dispenseer de oplossing in platen. Gebruik 6-well, 12-well, 40 mm of 60 mm platen voor dit scherm. Agar moet ongeveer 2/3 van de plaatdiepte vullen.
  7. Laat de borden een nacht drogen op de bank op kamertemperatuur, waarbij de borden bedekt blijven. NGM-platen voor RNAi kunnen maximaal een maand bij 4 °C worden bewaard.

2. RNAi-bacteriën kweken en de platen zaaien

  1. Voeg in de kap of met behulp van steriele procedures 1 ml ampicilline (100 mg / ml) en 2,5 ml tetracycline (5 mg / ml) (tabel 1) toe aan een gepreclaveerde 1 l LB-oplossing en mix.
    OPMERKING: Veelgebruikte HT115 (DE3) E. coli-bacteriën zijn tetracycline-resistent.
  2. Voeg in de kap of met behulp van steriele procedures 600 μL LB-oplossing toe aan elke put in 2 ml diepe steriele platen met 96 putten. Het is het beste om een meerkanaals pipet te gebruiken voor het doseren van de media.
  3. Met behulp van steriele procedures, ent putten met HT115 (DE3) E. coli bacteriën getransformeerd met een dsRNA-coderend plasmide gericht op een gen van belang of een leeg plasmide, als een controle. Dek de platen af en incubeer een nacht bij 37 °C. Bibliotheken die bestaan uit bacteriële klonen die dsRNA tot expressie brengen, overeenkomend met ~ 94% van de voorspelde C. elegans-genen, werden eerder geconstrueerd22,23 en zijn commercieel beschikbaar. De chaperonnebibliotheek die hier wordt gebruikt, is gebouwd door dr. Richard Morimoto laboratorium26.
  4. Met behulp van steriele procedures zaait u 75, 150 of 250 μL bacteriën op respectievelijk de 12-well, 40 mm en 6-well of 60 mm NGM RNAi-platen. Markeer duidelijk de naam van het doelgen op de plaat. Bacteriën moeten 30-50% van het agaroppervlak bedekken en mogen de randen van de plaat niet raken.
  5. Laat de borden minstens 2 dagen drogen op de bank bij kamertemperatuur, waarbij de platen bedekt blijven.
    OPMERKING: Platen kunnen 's nachts bij 37 °C worden geïncubeerd. Zorg ervoor dat de binnenputten droog zijn voordat u de platen gebruikt of opbergt. Voor alle doeleinden op lange termijn (d.w.z. drogen of opslaan) houdt u de platen in het donker. Gedroogde, gezaaide platen kunnen maximaal een maand bij 4 °C worden bewaard.

3. Niet-stressvolle synchronisatie van embryo's

  1. Gebruik een wormenpluk om ongeveer 100 eieren van een niet-gesynchroniseerde wormplaat naar een nieuw gezaaide NGM-plaat te verplaatsen.
  2. Kweek dieren gedurende 5 dagen bij 15 °C, 3,5 dagen bij 20 °C of 2,5 dagen bij 25 °C. Dieren moeten de eerste dag van het leggen van eieren bereiken.
    OPMERKING: Wormen worden gewoonlijk gekweekt bij 20 °C. Verschillende chaperonnemutante stammen kunnen echter specifieke teelttemperaturen vereisen. Veel temperatuurgevoelige soorten worden bijvoorbeeld gekweekt bij 15 °C, maar verschoven naar 25 °C om hun fenotype bloot te leggen.
  3. Voeg 1 ml M9-buffer(tabel 1)langzaam en uit de buurt van het bacteriële gazon toe. Draai de plaat zo dat de buffer de plaat volledig bedekt. Kantel het vervolgens naar één kant en verwijder de vloeistof van het bord en was de dieren van het bord.
    OPMERKING: Bij het gebruik van temperatuurgevoelige dieren of chaperonnemutanten is het het beste om de buffers die in het protocol worden gebruikt op de kweektemperatuur van de dieren te houden.
  4. Herhaal stap 3.3 drie keer of totdat alle dieren van het bord zijn gewassen.
  5. Snijd met behulp van een standaard plastic punt een vierkant agar uit de gewassen plaat waar eieren worden geconcentreerd en plaats het stuk agar op een nieuw gezaaide NGM-plaat.
    OPMERKING: ~ 200 eieren zijn nodig om voldoende eierleggende dieren te produceren; te veel dieren consumeren de bacterie te snel. Lage voedselniveaus kunnen van invloed zijn op de proteostase27.
  6. Kweek de dieren gedurende 5 dagen bij 15 °C, 3,5 dagen bij 20 °C of 2,5 dagen bij 25 °C. Op dit punt moeten de platen worden bedekt met gesynchroniseerde eieren.
    OPMERKING: Dieren kunnen voor een korte duur naar een nieuwe plaat worden verplaatst voor een strengere synchronisatie. Het is echter belangrijk om alleen volwassenen te gebruiken in de vroege stadia van het leggen van eieren, omdat dieren eieren in hun baarmoeder kunnen behouden, wat de synchronisatie beïnvloedt.
  7. Voeg langzaam 1 ml M9-buffer toe en uit de buurt van het bacteriële gazon.
  8. Draai de plaat zo dat de buffer de plaat volledig bedekt. Kantel het vervolgens naar één kant en verwijder de vloeistof van het bord en was de dieren van het bord.
  9. Herhaal stap 3.7 drie keer of totdat alle dieren van het bord zijn gewassen.
  10. Voeg 1 ml M9-buffer toe en gebruik een celschraper om de eieren van de plaat los te maken.
  11. Verzamel de M9-buffer met de eieren van de platen.
  12. Centrifugeer de M9-buffer met de eieren gedurende 2 minuten bij 3.000 x g.
  13. Verwijder het supernatant en voeg M9-buffer toe om een volume van 1 ml te bereiken.
  14. Resuspend de eieren om eventuele brokken eieren en bacteriën te verstoren.
  15. Herhaal de wasprocedure die wordt beschreven in stappen 3.11-3.13 vijf keer. De eikorrel moet er wit uit zien. Als het nog steeds geel/bruin is, herhaal dan de was totdat een witte pellet is bereikt.
    OPMERKING: Bacteriën die op de eieren achterblijven, kunnen de dsRNA-tot expressie brengende bacteriën besmetten.
  16. Verwijder het grootste deel van het supernatant en laat ongeveer 200 μL over. Gesynchroniseerde eieren kunnen worden gebruikt voor RNAi-schermen.

4. Gemeenschappelijke fenotypische assays

  1. Teelt van dieren tijdens experimenten
    1. Plaats een druppel van ~ 30 eieren dicht bij het bacteriële gazon in elke RNAi-gezaaide plaat. Plaats ter referentie ook ~ 30 eieren op platen gezaaid met lege vectorbevattende (L4440) bacteriën.
    2. Cultiveer leeftijdsgesynchroniseerde dieren op NGM RNAi-gezaaide platen. De duur van het experiment hangt af van het stadium waarin de dieren moeten worden gecontroleerd en de temperatuur van de teelt. Pas de teelttemperatuur aan bij gebruik van temperatuurgevoelige mutante dieren. Pas de teeltduur aan bij gebruik van ontwikkelingsverachterstand gemuteerde dieren.
      OPMERKING: Hoewel de timing kan variëren, zodra dieren de volwassenheid bereiken, kan het leggen van eieren (en de resulterende snelle voedselconsumptie), evenals leeftijdsafhankelijke proteostsis-ineenstorting28,de resultaten beïnvloeden. Het wordt daarom aanbevolen om dieren te scoren voor het begin van het leggen van eieren (dag 1 van volwassenheid). Wilde dieren bereiken dit stadium na 4,5 dagen bij 15 °C, 3 dagen bij 20 °C of 2 dagen bij 25 °C.
    3. Het aantal gebruikte herhalingen is afhankelijk van de grootte van de onderzochte genenset. Herhaal voor de chaperonnebibliotheek (97 genen) experimenten minstens vier keer. De grootte van de populatie hangt af van de gebruikte test. In de gedragstests die hier worden besproken, score >15 dieren per experimentele toestand in elke herhaling. Gegevens en statistische analyses zijn ook sterk afhankelijk van het type test dat wordt gebruikt. Gegevens in de hier besproken assays kunnen worden gepresenteerd als middel ± SEM.
    4. Vergelijk de met RNAi en lege vectorcontrole behandelde dieren als onafhankelijke populaties. P-waarden kunnen worden berekend met behulp van eenrichtings- of tweerichtings-ANOVA, afhankelijk van de onderzochte veranderingen, namelijk alleen verergeren of verlichten of beide. Bij het onderzoeken van een enkele RNAi-behandeling versus controle, kunnen P-waarden worden berekend met behulp van eenrichtings- of tweerichtings Mann-Whitney-rangsomtest. Anders dan statistische significantie, overweeg een drempel voor hits op basis van de mate van impact op het fenotype.
  2. Ontwikkelingsstilstand/-vertraging
    1. Kweek leeftijdsgesynchroniseerde dieren zoals in stap 4.1 totdat dieren die zijn gekweekt op lege vectorbevattende controlebacteriën volwassen zijn, maar voordat het leggen van eieren begint.
    2. Monitor dieren met behulp van een stereomicroscoop en tel het aantal larven en volwassenen om het percentage dieren met ontwikkelingsachterstand te scoren. Ter referentie, vergelijk met gemuteerde dieren gekweekt op lege vectorbevattende controlebacteriën. hsp-1 of hsp-90 RNAi behandeling resulteert in ontwikkelingsstilstand van wilde dieren en kan worden gebruikt als een positieve controle.
    3. Om het percentage ontwikkelingsver vertraagde dieren in de loop van de tijd te scoren, herhaalt u stap 4.2.2.
      OPMERKING: Als er eierleggende volwassenen op de plaat zijn, breng dan de ontwikkelingsver vertraagde dieren over naar een nieuwe NGM-RNAi-plaat die is gelabeld voor hetzelfde doelgen om verwarring met het nageslacht te voorkomen.
  3. Steriliteit of eierleggingsdefecten
    1. Kweek leeftijdsgesynchroniseerde dieren zoals in stap 4.1 totdat dieren die zijn gekweekt op lege vectorcontrolebacteriën eieren beginnen te leggen.
    2. Monitor dieren met behulp van een stereomicroscoop en scoor het percentage dieren zonder zichtbare eieren in hun baarmoeder. Ter referentie, vergelijk met gemuteerde dieren gekweekt op lege vector-controle bacteriën.
    3. Als alternatief, controleer dieren met behulp van een stereomicroscoop en scoor het percentage dieren met een baarmoeder vol eieren, gedefinieerd als EGg Laying defect (Egl-d) fenotype29.
  4. Embryonale letaliteit
    1. Kweek leeftijdsgesynchroniseerde dieren zoals in stap 4.1 totdat de dieren eieren beginnen te leggen.
    2. Breng ~100 eieren over op een lege plaat. Verdeel de eieren in rijen om het tellen te vereenvoudigen.
    3. Scoor het percentage niet-gehate eieren op het bord na 24-48 uur. Ter referentie, vergelijk met eieren van dieren behandeld met lege vector-controle bacteriën.
  5. Verlammingstest
    1. Kweek voor volwassenen van dag 1 leeftijdsgesynchroniseerde dieren zoals in stap 4.1 totdat dieren die zijn gekweekt op lege vectorcontrolebacteriën de volwassenheid bereiken, maar voordat het leggen van eieren begint.
    2. Teken een lijn op de achterkant van een gewone NGM-agarplaat met behulp van een fijne marker.
    3. Plaats 5-10 dieren op de gemarkeerde lijn.
    4. Stel een timer in en wacht 10 minuten.
    5. Scoor het percentage dieren dat aan de lijn blijft als verlamde wormen. Ter referentie, vergelijk met gemuteerde dieren gekweekt op lege vector-controle bacteriën. Wilde dieren behandeld met unc-45 RNAi vertonen een ernstig verlammingsfenotype en kunnen worden gebruikt als een positieve controle.
      OPMERKING: Deze test benadrukt dieren die gemiddelde tot ernstige verlamming vertonen. Dergelijke dieren liggen meestal recht op de plaat, in plaats van de gemeenschappelijke gebogen vorm te presenteren. Bovendien is een van bacteriën ontruimde plek zichtbaar rond de hoofden van verlamde wormen.
  6. Thrashing assay
    1. Kweek leeftijdsgesynchroniseerde dieren zoals in stap 4.1 totdat dieren die zijn gekweekt op lege vectorcontrolebacteriën volwassen zijn, maar voordat het leggen van eieren begint.
    2. Pipetteer 100 μL M9-buffer bij de kweektemperatuur van de dieren in een plaat met 96 putten.
    3. Plaats ~15 wormen, één per put, in de M9-bufferbevattende putten.
    4. Laat de dieren zich 5 min aanpassen.
    5. Onderzoek elk dier onder de stereomicroscoop, start een timer die 15 s aftelt en tel het aantal lichaamsbuigingen dat elk dier in die tijdspanne uitvoert. De getelde waarden kunnen worden genormaliseerd naar lichaamsbochten per minuut. Ter referentie, vergelijk met gemuteerde dieren gekweekt op lege vector-controle bacteriën.
      OPMERKING: Deze motiliteitstest is zeer gevoelig en kan zeer milde verschillen tussen behandelingen detecteren. Motiliteit in vloeistof en motiliteit op agar kunnen echter verschillen.

5. Validatie van eiwit knockdown

  1. Plaats 250-300 gesynchroniseerde eieren op een 60 mm NGM-RNAi-plaat gezaaid met de relevante dsRNA-tot expressie brengende of lege vectorbevattende (L4440) bacteriën.
    OPMERKING: RNAi knockdown kan resulteren in afwijkende accumulatie van embryo's, in een gebrek aan embryo's of in ontwikkelingsstilstand die de genexpressie kan beïnvloeden. Hiermee moet rekening worden gehouden bij het bepalen van de leeftijd van de te onderzoeken dieren.
  2. Voor volwassenen van dag 1, kweek dieren gedurende 4,5 dagen bij 15 °C, 3 dagen bij 20 °C of 2 dagen bij 25 °C.
  3. Pluk en breng in totaal 200 jongvolwassen dieren over in de dop van een buisvulling van 1,5 ml met 200 μL PBS-T.
    OPMERKING: Bij het gebruik van temperatuurgevoelige dieren of chaperonnemutanten is het het beste om de buffers die in het protocol worden gebruikt op de kweektemperatuur van de dieren te houden.
  4. Sluit de dop voorzichtig en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.000 x g.
  5. Voeg 800 μL PBS-T(tabel 1)toe en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.000 x g.
  6. Verwijder voorzichtig de bovenste 900 μL.
  7. Herhaal stap 5.4-5.6 drie keer.
  8. Verwijder 900 μL en laat 100 μL oplossing achter die de 200 wormen bevat.
  9. Voeg 25 μL 5x monsterbuffer toe(tabel 1).
  10. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten bij 92°C terwijl u schudt bij 1000 tpm. Monsters kunnen vervolgens worden ingevroren en bij -20 °C worden bewaard.
  11. Laad 20 μL van elk monster en voer uit op een SDS-PAGE-gel.
  12. Voer western blot-analyse uit met behulp van geschikte antilichamen om de relatieve stabiliteit van het eiwit te bepalen.
  13. Bepaal de intensiteit van de banden met behulp van densitometrische software, zoals de vrij verkrijgbare ImageJ-gelmodule. Normaliseer alle waarden naar de waarden die in de controlesteekproef(en) zijn gemeten.
    OPMERKING: Het doel van RNAi knockdown in onze schermen is om het eiwitgehalte van een specifieke chaperonne / co-chaperonne te verlagen. De beste manier om de efficiëntie van de RNAi-knockdown te beoordelen, is dus door western blot-analyse. Hiervoor zijn specifieke antistoffen nodig. Als alternatief kan qPCR worden gebruikt om mRNA-niveaus te kwantificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gebruik van temperatuurgevoelige mutaties in UNC-45 om te screenen op verergerende of verlichtende interacties onder respectievelijk tolerante of beperkende omstandigheden
Spierassemblage en -onderhoud bieden een effectief systeem om weefselspecifieke chaperonne-interacties te bestuderen. De functionele eenheid van contractiele spieren, het sarcomeer, presenteert een kristallijne opstelling van structurele en regulerende eiwitten. De stabiliteit van het motoreiwit myosine en de opname ervan in de dikke filamenten van contractiele spiersarcoeren hangt af van de samenwerking van chaperonnes en UPS-componenten30. Een voorbeeld van zo'n chaperonne is de geconserveerde en gespecialiseerde myosine chaperonne UNC-45 die voornamelijk tot expressie komt in lichaamswandspier31,32,33,34,35. Van mutaties in UNC-45 is aangetoond dat ze myosine-desorganisatie en ernstige motiliteitsdefecten in Cveroorzaken. Elegans31,36. UNC-45 tandemmodules assembleren tot een multi-site dockingplatform37 dat samenwerking afdwingt tussen UNC-45, HSP-90 en HSP-1 en waarschijnlijk andere chaperones en co-chaperones in myosine filamentassemblage25,36,37,38. Om bekende UNC-45-interacties te bevestigen en nieuwe genetische interacties in spierproteostase te identificeren, hebben we een strategie vastgesteld met behulp van C. elegans temperatuurgevoelige unc-45-mutaties als een gesensibiliseerde genetische achtergrond voor weefselspecifieke chaperonne-interactiescreening19,25.

Enkelvoudige aminozuursubstituties in C. elegans UNC-45 (L822F en E781K, overeenkomend met respectievelijk de e286- en m94-allelen; unc-45(ts)) zijn verantwoordelijk voor temperatuurafhankelijke motiliteitsdefecten en myosine-desorganisatiefenotypen wanneer aangetaste dieren worden gekweekt onder beperkende omstandigheden (>22 °C). Daarentegen vertonen deze unc-45(ts) mutanten geen beweging of myosine organisatie defecten bij de permissieve temperatuur (15 °C)31. In de voorgestelde aanpak werden leeftijdsgesynchroniseerde unc-45 (e286) dieren in het eerste larvale stadium (L1) door RNAi (97 genen) uitgeput van verschillende moleculaire chaperonnes en vervolgens gecontroleerd op motiliteitsdefecten onder tolerante omstandigheden (15 °C) (figuur 1). We bevestigden de bekende interactie van UNC-45- en HSP-90-eiwitten in ons genetische interactiesscherm en identificeerden drie hsp-90 co-chaperones, sti-1, ahsa-1 en daf-41, als specifiek het veroorzaken van een synthetisch bewegingsdefect bij unc-45 (ts) mutante dieren, maar niet bij dieren van het wilde type25. We gingen verder met te onderzoeken of sti-1-, ahsa-1- of daf-41-geassocieerde synthetische fenotypen werden veroorzaakt door myosine-desorganisatie door de subcellulaire opstelling van myosine zware keten A (MYO-3) te monitoren, met behulp van gevestigde immunokleuringstechnieken39. Terwijl de behandeling van wilde dieren met sti-1, ahsa-1 of daf-41 RNAi de myofilamentorganisatie niet beïnvloedde, resulteerde uitputting van deze genen in unc-45 (e286) mutante dieren in volledige verstoring van sarcomerische structuren en MYO-3 mislokalisatie, zelfs onder permissieve omstandigheden (15 °C). Dit effect was vergelijkbaar met wat werd gezien met unc-45 (e286) enkele mutanten gekweekt bij de beperkende temperatuur (25 °C)25. Deze resultaten werden bevestigd met behulp van een ander unc-45(ts)-allel, namelijk unc-45(m94) mutant dieren25.

Om chaperones te identificeren die UNC-45 destabiliseren, hebben we vervolgens gescreend op chaperones die de beweeglijkheid van unc-45 (286) dieren bij 25 ° C verbeterden, afhankelijk van gen knockdown door RNAi. Terwijl unc-45(e286) gemuteerde dieren ernstige bewegingsdefecten vertoonden bij 25 °C, was de beweeglijkheid van dieren behandeld met RNAi tegen genen die coderen voor vier van de 97 gescreende chaperones aanzienlijk verbeterd. Ook hier werden de resultaten bevestigd met behulp van unc-45(m94) gemuteerde dieren. Het gebruik van temperatuurgevoelige mutaties maakt het dus mogelijk om zowel verzwarende als verlichtende schermen in te stellen, afhankelijk van de temperatuur waarbij het scherm wordt uitgevoerd.

Weefselspecifieke overexpressie van een chaperonne gebruiken om te screenen op verergerende interacties
Vervolgens gebruikten we weefselspecifieke overexpressie van een enkele chaperonne als een milde verstoring van het spier chaperonnenetwerk voor screeningsdoeleinden. In het bijzonder gebruikten we dieren die het wilde type dnj-24over-expressie riepen, wat codeert voor de C. elegans-homoloog van het Hsp40-eiwit DNAJB6 in de C. elegans-lichaamswandspier (DNJ-24M). Zoals hierboven vermeld, werden L1 DNJ-24M-dieren behandeld met RNAi voor verschillende chaperonnes en gecontroleerd op motiliteitsdefecten (20 °C) (figuur 1). Hoewel DNJ-24M-dieren geen opmerkelijke motiliteitsdefecten vertoonden, beïnvloedden drie genen (van de 48 onderzochte chaperonne-coderende genen; 6%), namelijk hsp-1, rme-8en dnj-8, specifiek de beweeglijkheid van DNJ-24M-tot expressie brengende dieren, maar niet van het wilde type dieren. Het is van belang dat het testen van de specificiteit van de treffers met behulp van dieren die een andere chaperonne, namelijk HSP-90, in spieren (HSP90M) over-expressie brengen, geen effect op de beweeglijkheid van HSP90M op hsp-1, rme-8of dnj-8 RNAi-behandeling 40heeft aangetoond . Alles bij elkaar resulteerde het screeningsplatform, dat milde verstoring van het chaperonnenetwerk gebruikte, zoals de expressie van metastabieuze mutante eiwitten of weefselspecifieke overexpressie, in een zeer specifieke hit rate (normaal ~ 5%).

Weefselspecifieke RNAi gebruiken om te screenen op weefselspecifieke genetische interacties
Weefselspecifieke RNAi-gevoelige stammen zorgen voor weefselspecifieke knockdown van genen terwijl nog steeds bacteriële voeding wordt gebruikt voor dsRNA-afgifte. Deze stammen zijn gemuteerd voor het RDE-1 argonaute-eiwit, een belangrijke component in de RNAi-route die nodig is voor effectieve gen-uitschakeling21. Het tot expressie brengen van wild type RDE-1 onder controle van een weefselspecifieke promotor leidde echter tot effectieve weefselspecifieke gen knockdown41,42. Deze tool maakt dus genetische interactiescreenings mogelijk zonder weefselspecifieke chaperones te gebruiken, zoals UNC-45 of DNAJ-24M. Bijvoorbeeld, hsp-6 (mortaline) knockdown bij wilde dieren tijdens de ontwikkeling resulteerde in een sterke ontwikkelingsstilstand (96±1% van de met RNAi behandelde dieren). Tegelijkertijd veroorzaakte hsp-6 knockdown in een stam die wild type RDE-1 in spieren tot expressie kwam geen ontwikkelingsstilstand, terwijl het tot expressie brengen van wild type RDE-1 in darmcellen resulteerde in een sterk ontwikkelingsstilstandfenotype (90±3%; Figuur 2). De HSP-6-functie in darmcellen is dus vereist voor een normale ontwikkeling. Een mutatie in hsp-6 (mg585) die een milde groeiachterstand veroorzaakt, kan daarom worden gebruikt om te screenen op verergerende of verlichtende chaperonne-interacties door dat gemuteerde gen over te steken in een darmspecifieke RNAi-stam en de chaperonne-RNAi-bibliotheek te screenen.

Monitoring van leeftijdsafhankelijke veranderingen in de vouwomgeving met behulp van genetische interacties
Dieren vertonen een leeftijdsafhankelijke afname van de beweeglijkheid die gepaard gaat met sarcomerische desorganisatie43,44,45. Veranderingen in eiwitvouwingscapaciteit vallen samen met veranderde regulatie en samenstelling van de cellulaire proteostasemachines28, inclusief veranderde niveaus van UNC-45, CHN-1 en UFD-2, eiwitten van de spierkwaliteitscontrolemachines46. In overeenstemming worden myosinevouwing en -afbraak beïnvloed door veranderingen in proteostatische capaciteit bij de overgang naar volwassenheid47. We vroegen ons daarom af of dergelijke veranderingen van invloed kunnen zijn op chaperonne-interacties. We hebben bijvoorbeeld de impact van sti-1, ahsa-1 en daf-41 knockdown op de motiliteit in de loop van de tijd gemonitord. We ontdekten dat hoewel met sti-1-, ahsa-1- en daf-41-RNAi behandelde dieren een verminderde beweeglijkheid vertoonden tijdens de larvale ontwikkeling, de motiliteit sterk afnam bij unc-45 (ts) volwassen wormen. Bovendien was de MYO-3-organisatie bij unc-45(ts) mutante dieren behandeld met sti-1, ahsa-1 of daf-41 RNAi vergelijkbaar met die van wildtype wormen in het vierde larvale stadium (L4), hoewel de mutanten verstoorde sarcoeren vertoonden nadat de dieren volwassen waren geworden(figuur 3). Daarentegen bleven zowel unc-45(ts) gemuteerde dieren die met een lege vectorcontrole werden behandeld als wilde dieren onaangetast(figuur 3). Zo kan proteostasedynamiek als functie van leeftijd of omgevingsomstandigheden27,45,46,48,49 chaperonne-interacties kritisch beïnvloeden.

Figure 1
Figuur 1: Opstelling van RNAi synthetische interactieschermen met behulp van C. elegans die een mutatie dragen in een gen dat codeert voor een chaperonne van belang. (A) Schematische weergave van de basisopstelling van gerichte chaperonne-interactieschermen. (B) Hitvalidatie vereist bevestiging van de genetische interactie met behulp van een andere chaperonnemutant, evenals het valideren van de specify van RNAi knockdown. (C-D) Eenvoudige uitlezingen, zoals motiliteitsdefecten, kunnen worden gekwantificeerd om verergerende of verlichtende interacties te bepalen, respectievelijk met behulp van verlamming of thrashing-assays. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Weefselspecifieke RNAi van de mitochondriale chaperonne hsp-6 kan worden gebruikt om genetische interacties in één weefsel te onderzoeken. Wild type darm- en spierspecifieke RNAi-stammen werden behandeld met hsp-6 RNAi en (A) ontwikkelingsachterstand werd gescoord of (B) beelden werden genomen op de eerste dag van de volwassenheid. Gegevens zijn gemiddeld ± SEM, N=6. Schaalbalk is 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Leeftijdsafhankelijke effecten van RNAi. (A) Beweeglijkheid met de leeftijd. Wild type of unc-45 (e286) embryo's werden geplaatst op sti-1, ahsa-1 of daf-41 RNAi-zaadplaten bij 15 °C en gescoord voor motiliteit met behulp van een thrashing assay in elk ontwikkelingsstadium, L1-L4, jongvolwassen en dag 1 van volwassenheid. Gegevens zijn gemiddeld ± SEM, N=15. (B) Confocale beelden van lichaamswandspier. Dieren werden behandeld als in A en gefixeerd op de L4, jongvolwassen en dag 1 van de volwassenheidsfasen en immuno-gekleurd met anti-MYO-3-antilichamen. Schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Oplossing Bereidingsinstructies Opslag
1 m CaCl2 (1 L) Voeg 147,01 g CaCl2·2H2O toe Winkel bij RT
Voeg dH2O toe aan 1 L
Autoclaaf of filter (0,22 μm)
1 M KH2PO4, pH 6,0 (1 L) Voeg 136.09 g KH2PO4 toe Winkel bij RT
Voeg 800 ml dH2O toe
Meng met behulp van magneetroerder tot opgelost
Titreer de pH met KOH
Voeg dH2O toe aan 1 L
Autoclaaf of filter (0,22 μm)
1 m mgSO4 (1 l) Voeg 248,58 g MgSO4·7H2O toe Winkel bij RT
Voeg dH2O toe aan 1 L
Autoclaaf of filter (0,22 μm)
Cholesteroloplossing (50 ml) Voeg 250 mg cholesterol toe aan een Falcon-buis van 50 ml Bewaren bij -20 °C
Volledig oplossen in 40 ml ethanol
Voeg ethanol toe aan 50 ml
1 M IPTG (50 ml) Voeg 11,9 g IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) toe aan een Falcon-buis van 50 ml Bewaren in het donker bij -20 °C
Volledig oplossen in 40 ml dH2O
Voeg dH2O toe aan 50 ml
Filter (0,22 μm), aliquot 1mL buizen
Ampicilline voorraad (50 ml) Voeg 5 g ampicilline toe aan een Falcon-buis van 50 ml Bewaren bij -20 °C
Volledig oplossen in 40 ml dH2O
Voeg dH2O toe aan 50 ml
Filter (0,22 μm), verdeel 1 ml aliquot in Eppendorf-buizen
Tetracycline voorraad (50 ml) Voeg 250 mg tetracycline toe aan een Falcon-buis van 50 ml Bewaren bij -20 °C
Volledig oplossen in 40 ml ethanol
Voeg ethanol toe aan 50 ml
Aliquot 1 ml buizen
M9 buffer (1 L) Voeg 5,8 g Na2HPO4·7H2O toe Winkel bij RT
Voeg 3 g KH2PO4 toe
Voeg 5 g NaCl toe
Voeg 0,25 g MgSO4·7H2O toe
Voeg dH2O toe aan 1 L
Filter (0,22 μm)
1x PBS-T (pH 7,4) ( 1 L) Voeg 8 g NaCl toe Winkel bij RT
Voeg 200 mg KCl toe
Voeg 1,44 g Na2HPO4·7H2O toe
Voeg 240 mg KH2PO4 toe
Volledig oplossen in 800 ml dH2O
Titreer pH met KOH tp pH 7,4
Voeg 500 μL Tween-20 toe
Voeg dH2O toe aan 1 L
5x monsterbuffer Voeg 6,8 ml dH2O toe Bewaren bij -20 °C
Voeg 2 ml 0,5 M Tris pH 6,8 toe
Voeg 3,2 ml glycerol toe
Voeg 1,6 ml 20% SDS toe
Voeg 0,8 ml ß-mercaptoethanol toe
1% broomfenol blauw

Tabel 1: Oplossingsrecepten

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een geïntegreerd beeld van het proteostasenetwerk dat weerspiegelt hoe het is georganiseerd en functioneert in verschillende metazoïsche cellen en weefsels ontbreekt nog steeds. Om deze tekortkoming aan te pakken, is specifieke informatie nodig over de interacties van verschillende componenten van dit netwerk, zoals moleculaire chaperones, in specifieke weefsels in de loop van ontwikkeling en veroudering. Hier lieten we zien hoe het gebruik van weefselspecifieke verstoringen ons in staat stelde om het chaperonnenetwerk in een bepaald weefsel te onderzoeken. Om weefselspecifieke chaperonne genetische interacties te onderzoeken, werden drie verschillende benaderingen overwogen. In de eerste benadering werd UNC-45, een chaperonne die sterk tot expressie komt in spiercellen, gebruikt om te screenen op chaperonne-interacties via feeding-RNAi25. Hoewel het gebruik van een gespecialiseerde chaperonne zorgt voor het onderscheiden van weefselspecifiekheid, kan het alleen rapporteren over dat zeer gerichte subnetwerk waaraan het bijdraagt. Merk op dat de meeste C. elegans-neuronen resistent zijn tegen op voeding gebaseerde RNAi-afgifte50 en dus vereist het gebruik van deze benadering om genetische interacties in neuronale cellen te identificeren het kruisen van de gemuteerde chaperonne die is onderzocht met een RNAi-verbeterde stam51. In een tweede benadering werd een weefselspecifieke promotor gebruikt om overexpressie van een chaperonne in de spier te stimuleren en zo specifiek de spiervouwomgeving te beïnvloeden40. Het overdrukken van een enkele chaperonne kan echter over het algemeen gunstig zijn voor de vouwomgeving en dus verstoring maskeren die wordt veroorzaakt door de twee chaperones samen. De derde benadering was gebaseerd op weefselspecifieke RNAi knockdown om chaperonne-interacties in een bepaald weefsel te onderzoeken41. Een voordeel van deze aanpak is dat het mogelijk is om neuronale cellen te richten die resistent zijn tegen RNAi-afgifte via voeding42. Toch vereist deze aanpak het gebruik van een milde mutant (hoewel niet gespecialiseerd), evenals dat deze mutant wordt gekruist in een rde-1 nulmutant die een weefselspecifiek rde-1-reddingsgen draagt. Belangrijk is dat deze benaderingen kunnen worden gecombineerd om de chaperonnefunctie in een enkel weefsel of zelfs een enkele cel te moduleren.

De kwaliteitscontrolemachines kunnen de functie van veel genproducten beïnvloeden door de proteostase te verstoren. Dit is een grote uitdaging bij het gebruik van genetische interacties om het kwaliteitscontrolenetwerk te verkennen18. Bijvoorbeeld, chronische expressie van aggregatiegevoelige eiwitten of proteostase ineenstorting bij veroudering resulteerde in fenotypische verergering van veel niet-gerelateerde metastabiele eiwitten in C. elegans en gist45,52,53. Bovendien werd clathrine-gemedieerde endocytose in zoogdiercellen geremd bij functionele sekwestratie van Hsc70 naar eiwitaggregaten. Toch werd aangetoond dat endocytose kon worden gered door Hsc70-overexpressie, terwijl aggregatie niet54,55kon. Evenzo identificeerde een genetische screen in Drosophila, ontworpen om regulatoren van de hitteschokrespons te ontdekken, een missense-mutatie in vluchtspieractine die constitutief de hitteschokrespons activeerde56. Alles bij elkaar kan verstoring van het proteostasenetwerk metastabie-eiwitten blootleggen of stress veroorzaken die de resultaatspecifi specificiteit kan beïnvloeden. Niettemin kan het analyseren van genetische interacties zeer specifieke en functionele inzichten opleveren. Epistatische analyses van gistgenen die nodig zijn voor vouwing in het endoplasmatisch reticulum identificeerden bijvoorbeeld specifieke genetische interacties tussen moleculaire chaperonnes die vervolgens werden gevalideerd19. Evenzo identificeerde een verergerende screening voor chaperones die de toxiciteit van twee aggregatiegevoelige modellen verbeteren (zoals gemeten door motiliteit) een specifieke subset van 18 chaperones, waarvan orthologen de huntingtineaggregatie in menselijke cellen beïnvloedden26. Hier toonden we aan dat verschillende verstoringen van het proteostasenetwerk specifieke en functionele chaperonne-interacties kunnen blootleggen.

Het belangrijkste voordeel van het gebruik van op RNAi-voeding gebaseerde genetische interactieschermen is de relatieve eenvoud van de methode. Zelfs het gebruik van een algemene gedragsoutput, zoals beweeglijkheid, kan nieuwe genetische interacties onthullen(figuur 3). Variabiliteit en gedeeltelijke effecten van expressie knockdown kunnen echter de robuustheid en specificiteit van de resultaten beperken57. Bovendien zijn genetische interacties niet indicatief voor fysieke interacties en zou de relatie tussen twee genen dus indirect kunnen zijn. Het verkennen van de aard van de interacties en het weggooien van niet-specifieke interacties kan tijdrovend zijn57,58,59. Dit is een probleem dat moet worden aangepakt bij het instellen en valideren van het scherm. Het gebruik van nul-allelen in genetische screening maakt het bijvoorbeeld mogelijk om te bepalen of deze genen in dezelfde of verschillende routes in een bepaald biologisch proces functioneren. Echter, met behulp van gedeeltelijk verlies van genfunctie, hypomorfe allelen, zoals temperatuurgevoelige allelen, of RNAi-afhankelijke down-regulatie van expressie, resulteert in resterende activiteiten die verergerende of verlichtende fenotypes kunnen opleveren, ongeacht of de genen in dezelfde of in parallelle routes werken59. De aard van elke interactie vereist dus verdere analyse. Het gebruik van hypomorfe allelen en RNAi zou echter een breed scala aan interactoren kunnen identificeren, waaronder genen in hetzelfde eiwitcomplex of dezelfde route of in een redundante route59. Hoewel deze grotere reikwijdte van mogelijke interacties meer hits kan opleveren in een genetisch scherm, kan het ook leiden tot niet-specifieke interacties, zoals bijvoorbeeld de niet-specifieke blootstelling van temperatuurgevoelige allelen in proteostase-ineenstorting45,53.

Hitvalidatie en niet-specifieke interacties kunnen op verschillende manieren worden onderzocht. Het aantal treffers moet laag zijn. Bijvoorbeeld, down-regulatie van chaperone-expressie in een unc-45 mutante achtergrond resulteerde in een klein percentage hits (4%), waarbij de meeste chaperone-gen-downregulatie geen effect op de motiliteit vertoonde. Een vergelijkbaar percentage werd waargenomen wanneer DNJ-24M over-uitgedrukt was (6%). Zoals hierboven vermeld, identificeerde een screen voor chaperonne-interacties met aggregatiegevoelige eiwitten 18 chaperones van 219 gescreend (8%).

Er moeten verschillende mutante allelen, overexpressielijnen of ziektemodellen worden gebruikt. Het gebruik van verschillende mutante allelen die verschillende effecten hebben op de chaperonnefunctie, evenals verschillende stammen met verschillende genetische achtergronden, kan de specificiteit van eventuele schermhits ondersteunen. Als alternatief kan het gebruik van mutatie of overexpressie van een andere chaperonne die niet tot vergelijkbare verstoring leidt, dienen als een negatieve controle. Bijvoorbeeld, zowel unc-45(e286) als unc-45(m94) vertoonden verergerend gedrag wanneer sti-1, ahsa-1 of daf-41 down-gereguleerd waren. Bovendien werd een vergelijkbare interactie waargenomen wanneer dieren die de ahsa-1 (ok3501) deletiemutant droegen, werden behandeld met hsp-90 RNAi25.

De identiteit van de chaperonnehits en hun bekende interacties moeten worden onderzocht. Chaperones die in een unc-45-verzwarende scherm worden geïdentificeerd, zijn bijvoorbeeld een zeer specifieke set chaperones die nodig zijn voor de HSP-90 ATPase-cyclus, inclusief die voor een klantronselaar (STI-1), een remodellerings-co-chaperonne (AHSA-1) en een co-chaperonne voor klantrijping (DAF-41). In feite vormt deze set co-chaperones een complete HSP-90 vouwcyclus60. Evenzo identificeerde een DNJ-24M-scherm HSP-1, de belangrijkste chaperonnepartner van Hsp40s40.

Veranderingen in interacties gedurende de levensduur van het dier moeten ook worden onderzocht. Bijvoorbeeld, chaperones geïdentificeerd in unc-45 verergerende scherm hadden een sterke invloed op de beweeglijkheid en myosine organisatie op volwassen leeftijd, maar hadden een milder effect tijdens de ontwikkeling. Dit kan te wijten zijn aan veranderingen in het proteostasenetwerk op volwassen leeftijd28 of aan veranderingen in myosinevouwvereisten tussen myo-vezelvouwing en onderhoud.

Gebruik complementaire biochemische benaderingen om interacties tussen de eiwitten rechtstreeks te onderzoeken, evenals hun lokalisatie in de cel. Bijvoorbeeld, de HSP-90 co-chaperones, STI-1, AHSA-1 en DAF-41, zijn gelokaliseerd in het sarcomeer waar ze interageren met myosine25.

C. elegans is een gerenommeerd metazoïcummodel voor het bewaken van kwaliteitscontrole. Het wordt vaak gebruikt om cellulaire en organismale proteostase te monitoren met behulp van een variabele toolkit van celbiologie, biochemische en genetische benaderingen. Hier gebruikten we genetische screeningsbenaderingen en beschikbare hulpmiddelen57,58,59,zoals een mutantenbank, beschikbare RNAi-bibliotheken22,23 en weefselspecifieke RNAi-stammen41,42, om chaperonne-interacties in een levend dier tijdens ontwikkeling en veroudering te volgen. Het gebruik van eenvoudige gedragstests, zoals motiliteit, vereenvoudigt het scherm van veel mogelijke genparen om nieuwe genetische interacties te verkennen. Dit kan vervolgens dienen als een platform om chaperonnelokalisatie en fysieke interacties verder te onderzoeken met behulp van biochemische hulpmiddelen om hun potentiële interacties in vivo en in vitro mechanistisch te bestuderen. Het hier beschreven protocol is met succes gebruikt om nieuwe chaperonne-interacties in C. elegans lichaamswandspier 25,40te identificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We danken het Caenorhabditis Genetics Center, gefinancierd door het NIH National Center for Research Resources (NCRR), voor enkele van de nematodenstammen. Monoklonale antilichamen ontwikkeld door H.F. Epstein werden verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de afdeling Biologie, Universiteit van Iowa. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van de Israel Science Foundation (subsidie nr. 278/18) en door een subsidie van het Israëlische ministerie van Wetenschap en Technologie, en het ministerie van Buitenlandse Zaken en Internationale Samenwerking, directoraat-generaal voor landenbevordering, Italiaanse Republiek (subsidie nr. 3-14337). We bedanken leden van het Ben-Zvi laboratorium voor hulp bij het voorbereiden van dit manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O'Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Tags

Biologie Nummer 160 Caenorhabditis elegans chaperonne genetische interacties proteostase RNAi scherm temperatuurgevoelig
<em>Caenorhabditis elegans gebruiken</em> om te screenen op weefselspecifieke chaperonne-interacties
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., … More

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter