Använda Caenorhabditis elegans för att screena för vävnadsspecifika förkläde interaktioner

Summary

För att studera interaktioner mellan förkläde och förkläde- och förkläde- och substrat utför vi syntetiska interaktionsskärmar i Caenorhabditis elegans med hjälp av RNA-interferens i kombination med milda mutationer eller överuttryck av förkläden och övervakar vävnadsspecifik proteindysfunktion på organismnivå.

Abstract

Korrekt vikning och montering av proteiner och proteinkomplex är avgörande för cellulär funktion. Celler använder kvalitetskontrollvägar som korrigerar, spärrar eller eliminerar skadade proteiner för att upprätthålla en hälsosam proteom, vilket säkerställer cellulär proteostas och förhindrar ytterligare proteinskador. På grund av överflödiga funktioner inom proteostasis nätverket, screening för detekterbara fenotyper med hjälp av knockdown eller mutationer i förkläde-kodning gener i multicellular organism Caenorhabditis elegans resulterar i upptäckt av mindre eller inga fenotyper i de flesta fall. Vi har utvecklat en riktad screeningstrategi för att identifiera förkläden som krävs för en specifik funktion och därmed överbrygga klyftan mellan fenotyp och funktion. Specifikt övervakar vi nya förkläde interaktioner med RNAi syntetiska interaktionsskärmar, knock-down förkläde uttryck, en förkläde i taget, hos djur som bär en mutation i en förkläde-kodning gen eller över uttrycker ett förkläde av intresse. Genom att störa två förkläden som individuellt inte presenterar någon grov fenotyp, kan vi identifiera förkläden som förvärrar eller exponerar en specifik fenotyp när båda störs. Vi visar att detta tillvägagångssätt kan identifiera specifika uppsättningar av förkläden som fungerar tillsammans för att modulera vikning av ett protein eller proteinkomplex i samband med en given fenotyp.

Introduction

Celler hanterar proteinskador genom att använda kvalitetskontrollmaskiner som reparerar, spärrar eller tar bort skadade proteiner^1,2. Vikning och montering av proteinkomplex stöds av molekylära förkläde, en mångfaldig grupp mycket bevarade proteiner som kan reparera eller binda skadade proteiner^3,4,5,6,7. Avlägsnandet av skadade proteiner förmedlas av ubiquitin-proteasomsystemet (UPS)⁸ eller av autofagimaskineriet⁹ i samarbete med förkläde^10,11,12. Proteinhomeostas (proteostas) upprätthålls därför av kvalitetskontrollnätverk som består av viknings- och nedbrytningsmaskiner^3,13. Att förstå interaktionerna mellan de olika komponenterna i proteostasisnätverket in vivo är dock en stor utmaning. Medan proteinproteininteraktionsskärmar bidrar med viktig information om fysiska interaktioner och förklädekomplex^14,15, saknas förståelse för organisationen och kompensatoriska mekanismer inom vävnadsspecifika förklädenätverk in vivo.

Genetiska interaktioner används ofta som ett kraftfullt verktyg för att undersöka förhållandet mellan par av gener som är involverade i vanliga eller kompensatoriska biologiska^{vägar 16,17,18}. Sådana relationer kan mätas genom att kombinera par mutationer och kvantifiera effekten av en mutation i en gen på den fenotypiska svårighetsgraden orsakad av en mutation i den andra^{genen 16}. Medan de flesta sådana kombinationer inte visar någon effekt när det gäller fenotyp, vissa genetiska interaktioner kan antingen förvärra eller lindra svårighetsgraden av den uppmätta fenotypen. Försvårande mutationer observeras när fenotypen av dubbel borttagning mutant är allvarligare än den förväntade fenotyp sett vid kombinera den enda borttagning mutanter, vilket innebär att de två generna fungerar i parallella vägar, tillsammans påverkar en given funktion. Däremot observeras lindrande mutationer när fenotypen av den dubbla borttagningsmutanten är mindre allvarlig än fenotypen som ses med de enda borttagningsmutanterna, vilket innebär att de två generna fungerar tillsammans som ett komplex eller deltar i samma väg^16,18. Följaktligen har olika fenotyper som kan kvantifieras, inklusive breda fenotyper, såsom dödlighet, tillväxthastigheter och kullstorlek, liksom specifika fenotyper, såsom transkriptionella reportrar, använts för att identifiera genetiska interaktioner. Till exempel förlitade sig Jonikas et al. på en ER stressreporter för att undersöka interaktioner mellan Saccharomyces cerevisiae ER utvecklat proteinsvar proteostasnätverk med hjälp av parvisa genborttagningsanalyser¹⁹.

Genetiska interaktionsskärmar innebär systematiskt korsning parvis borttagning mutationer för att generera en omfattande uppsättning dubbla mutanter²⁰. Men i djurmodeller, och specifikt i C. elegans, är detta storskaliga tillvägagångssätt inte genomförbart. Istället kan mutanta stammar testas för sina genetiska interaktionsmönster genom att nedreglera genuttrycket med hjälp av RNA-interferens (RNAi)²¹. C. elegans är ett kraftfullt system för skärmar baserade på RNAi^22,23. I C. elegansuppnås dubbelsträngad RNA (dsRNA) leverans genom bakteriell utfodring, vilket leder till spridning av dsRNA-molekyler till många vävnader. På detta sätt påverkar de introducerade dsRNA-molekylerna djuret via ett snabbt och enkelt förfarande²¹. En genetisk interaktionsskärm med RNAi kan därför avslöja effekten av att nedreglera en uppsättning gener eller de flesta C. eleganskodande gener med hjälp av RNAi-bibliotek²⁴. I en sådan skärm, träffar som påverkar beteendet hos mutanten av intresse men inte den vilda typen stam är potentiella modifierare av fenotyp övervakas²⁵. Här tillämpar vi en kombination av mutationer och RNAi screening för att systematiskt kartlägga vävnadsspecifika förklädesinteraktioner i C. elegans.

Protocol

1. Förberedelse av nematod tillväxtmedieplattor för RNAi Tillsätt 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Peptone, 17 g agar och destillerat vatten upp till 1 L och autoklav på en 1 L-flaska. Kyl flaskan till 55 °C. Tillsätt 25 ml 1 M KH2PO4,pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl2,1 ml 1 M MgSO4och 1 ml kolesterollösning(tabell 1)för att göra nematodtillväxtmedia (NGM). Tillsätt 1 ml ampicillin (100 mg/ml) och 0,5 ml 1 M IPTG(tabell 1)<…

Representative Results

Använda temperaturkänsliga mutationer i UNC-45 för att screena för att förvärra eller lindra interaktioner under tillåtande eller restriktiva förhållandenMuskelmontering och underhåll erbjuder ett effektivt system för att studera vävnadsspecifika förkläde interaktioner. Den funktionella enheten av kontraktila muskler, sarkom, presenterar ett kristallint-liknande arrangemang av strukturella och reglerande proteiner. Stabiliteten hos motorproteinet myosin och dess införlivande i de tjock…

Discussion

En integrerad bild av proteostasnätverket som återspeglar hur det är organiserat och fungerar i olika metazoiska celler och vävnader saknas fortfarande. För att ta itu med denna brist krävs specifik information om interaktioner mellan olika komponenter i detta nätverk, såsom molekylära förkläde, i specifika vävnader under utveckling och åldrande. Här visade vi hur användningen av vävnadsspecifika problem gjorde det möjligt för oss att undersöka förkläde nätverket i en given vävnad. För att utforsk…

Materials

12-well-plates	SPL	BA3D16B
40 mm plates	Greiner Bio-one	627160
60 mm plates	Greiner Bio-one	628102
6-well plates	Thermo Scientific	140675
96 well 2 mL 128.0/85mm	Greiner Bio-one	780278
Agar	Formedium	AGA03
Ampicillin	Formedium	69-52-3
bromophenol blue	Sigma	BO126-25G
CaCl2	Merck	1.02382.0500
Camera	Qimaging	q30548
Cholesterol	Amresco	0433-250G
Confocal	Leica	DM5500
Filter (0.22 µm)	Sigma	SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ165FC
Glycerol	Frutarom	2355519000024
IPTG	Formedium	367-93-1
KCl	Merck	104936
KH2PO4	Merck	1.04873.1000
KOH	Bio-Lab	001649029100
MgSO4	Fisher	22189-08-8	Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody	Hybridoma Bank	5-6
Na2HPO4·7H2O	Sigma	s-0751
NaCl	Bio-Lab	001903029100
Peptone	Merck	61930705001730
Plate pouring pump	Integra	does it p920
RNAi Chaperone library	NA	NA
SDS	VWR Life Science	0837-500
ß-mercaptoethanol	Bio world	41300000-1
stereomicroscope	Leica	MZ6
Tetracycline	Duchefa Biochemie	64-75-5
Tris	Bio-Lab	002009239100
Tween-20	Fisher	BP337-500