Summary

Brug caenorhabditis elegans til skærmen for vævsspecifikke chaperone interaktioner

Published: June 07, 2020
doi:

Summary

For at studere chaperone-chaperone og chaperone-substrat interaktioner, udfører vi syntetiske interaktion skærme i Caenorhabditis elegans ved hjælp af RNA interferens i kombination med milde mutationer eller over-udtryk for chaperoner og overvåge vævsspecifikke protein dysfunktion på organismeniveau.

Abstract

Korrekt foldning og samling af proteiner og proteinkomplekser er afgørende for cellulær funktion. Celler anvender kvalitetskontrolveje, der korrigerer, afholder eller eliminerer beskadigede proteiner for at opretholde et sundt proteom, hvilket sikrer cellulære proteostase og forhindrer yderligere proteinskader. På grund af overflødige funktioner inden for proteostase netværk, screening for påviselige fænotyper ved hjælp af knockdown eller mutationer i chaperone-kodning gener i multicellulære organisme Caenorhabditis elegans resulterer i påvisning af mindre eller ingen fænotyper i de fleste tilfælde. Vi har udviklet en målrettet screeningsstrategi for at identificere chaperoner, der kræves til en bestemt funktion og dermed bygge bro mellem fænotype og funktion. Specifikt overvåger vi nye chaperone interaktioner ved hjælp af RNAi syntetiske interaktion skærme, banke-down chaperone udtryk, en anstandsdame ad gangen, i dyr, der bærer en mutation i en anstandsdame-kodning gen eller over-udtrykke en anstandsdame af interesse. Ved at forstyrre to chaperoner, der individuelt præsenterer ingen brutto fænotype, kan vi identificere chaperoner, der forværrer eller udsætter en bestemt fænotype, når begge forstyrres. Vi viser, at denne tilgang kan identificere specifikke sæt chaperoner, der fungerer sammen for at modulere foldningen af et protein- eller proteinkomplekser forbundet med en given fænotype.

Introduction

Celler klare proteinskader ved at anvende kvalitetskontrol machineries at reparere, binde eller fjerne eventuelle beskadigede proteiner1,2. Foldning og samling af proteinkomplekser understøttes af molekylære chaperoner, en forskelligartet gruppe af meget konserverede proteiner, der kan reparere eller binde beskadigede proteiner3,4,5,6,7. Fjernelsen af beskadigede proteiner medieres af ubiquitin-proteasome-systemet (UPS)8 eller af autophagy-maskinerne9 i samarbejde med chaperoner10,11,12. Protein homøostase (proteostase) vedligeholdes derfor af kvalitetskontrolnetværk, der består af folde- og nedbrydningsmaskiner3,13. Det er imidlertid en stor udfordring at forstå samspillet mellem de forskellige komponenter i proteostasenetværket in vivo. Mens protein-protein interaktion skærme bidrage med vigtige oplysninger om fysiske interaktioner og chaperone komplekser14,15, forståelse af organisation og kompenserende mekanismer inden for vævsspecifikke chaperone netværk in vivo mangler.

Genetiske interaktioner bruges ofte som et kraftfuldt værktøj til at undersøge forholdet mellem par af gener, der er involveret i fælles eller kompenserende biologiske veje16,17,18. Sådanne relationer kan måles ved at kombinere par mutationer og kvantificere virkningen af en mutation i et gen på den fænotypiske sværhedsgrad forårsaget af en mutation i det andet gen16. Mens de fleste sådanne kombinationer ikke viser nogen effekt i form af fænotype, nogle genetiske interaktioner kan enten forværre eller lindre sværhedsgraden af den målte fænotype. Skærpende mutationer observeres, når fænotypen af dobbelt sletning mutant er mere alvorlig end den forventede fænotype set ved at kombinere enkelt sletning mutanter, hvilket indebærer, at de to gener fungerer i parallelle veje, sammen påvirker en given funktion. I modsætning hertil observeres lindre mutationer, når fænotypen af dobbelt sletning mutant er mindre alvorlig end fænotypen set med enkelt sletning mutanter, hvilket indebærer, at de to gener fungerer sammen som et kompleks eller deltage i den samme vej16,18. Derfor er forskellige fænotyper, der kan kvantificeres, herunder brede fænotyper, såsom dødelighed, vækstrater og brødstørrelse, samt specifikke fænotyper, såsom transskriptionelle journalister, blevet brugt til at identificere genetiske interaktioner. For eksempel, Jonikas et al. påberåbt sig en ER stress reporter til at undersøge interaktioner af Saccharomyces cerevisiae ER udfoldet protein respons proteostase netværk ved hjælp af parvis gensletning analyser19.

Genetiske interaktion skærme indebærer systematisk krydser parvis sletning mutationer til at generere et omfattende sæt af dobbelt mutanter20. Men i dyremodeller, og specifikt i C. elegans,er denne store tilgang ikke mulig. I stedet kan mutantstammer testes for deres genetiske interaktionsmønstre ved at nedregulerende genekspression ved hjælp af RNA-interferens (RNAi)21. C. elegans er et kraftfuldt system til skærme baseret på RNAi22,23. I C. elegansopnås dobbeltstrenget RNA (dsRNA) levering ved bakteriel fodring, hvilket fører til spredning af dsRNA-molekyler til mange væv. På denne måde påvirker de indførte dsRNA-molekyler dyret via en hurtig og enkel procedure21. En genetisk interaktion skærm ved hjælp af RNAi kan derfor afsløre virkningen af ned-regulering af et sæt af gener eller de fleste C. elegans kodning gener ved hjælp af RNAi biblioteker24. I en sådan skærm, hits, der påvirker adfærd mutant af interesse, men ikke den vilde type stamme er potentielle modifikatorer af fænotypen overvåges25. Her anvender vi en kombination af mutationer og RNAi screening til systematisk at kortlægge vævsspecifikke chaperoneinteraktioner i C. elegans.

Protocol

1. Forberedelse af nematode vækst medieplader til RNAi Til en 1 L flaske, tilsæt 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Peptone, 17 g agar og destilleret vand op til 1 L og autoklave. Kølig flaske til 55 °C. Tilsæt 25 mL af 1 M KH2PO4, pH 6,0, 1 mL af 1 M CaCl2,1 mL på 1 M MgSO4og 1 mL kolesterolopløsning (tabel 1) for at lave nematode vækstmedier (NGM). Der tilsættes 1 mL ampicillin (100 mg/mL) og 0,5 mL 1 M IPTG (tabel …

Representative Results

Brug af temperaturfølsomme mutationer i UNC-45 til at screene for at forværre eller lindre interaktioner under henholdsvis eftergivende eller restriktive forholdMuskel samling og vedligeholdelse tilbyder et effektivt system til at studere vævsspecifikke chaperone interaktioner. Den funktionelle enhed af kontraktile muskler, sarkomen, præsenterer en krystallinsk-lignende arrangement af strukturelle og lovgivningsmæssige proteiner. Stabiliteten af motorprotein myosin og dets indarbejdelse i de tyk…

Discussion

Et integreret billede af proteostasenetværket, der afspejler, hvordan det er organiseret og fungerer i forskellige metazoceller og væv, mangler stadig. For at løse denne mangel kræves der specifikke oplysninger om samspillet mellem forskellige komponenter i dette netværk, såsom molekylære chaperoner, i specifikke væv i løbet af udvikling og aldring. Her viste vi, hvordan brugen af vævsspecifikke forstyrrelser gjorde det muligt for os at undersøge chaperonenetværket i et givet væv. For at udforske vævsspecif…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Caenorhabditis Genetics Center, finansieret af NIH National Center for Research Resources (NCRR), for nogle af nematode stammer. Monoklonale antistoffer udviklet af H.F. Epstein blev fremstillet fra Developmental Studies Hybridoma Bank udviklet i regi af NICHD og vedligeholdt af Department of Biology, University of Iowa. Denne forskning blev støttet af et tilskud fra Israel Science Foundation (bevilling nr. 278/18) og af et tilskud fra Israels ministerium for videnskab og teknologi og udenrigsministeriet og internationalt samarbejde, Generaldirektoratet for Landefremme, Den Italienske Republik (tilskud nr. 3-14337). Vi takker medlemmer af Ben-Zvi laboratoriet for hjælp til at forberede dette manuskript.

Materials

12-well-plates SPL BA3D16B
40 mm plates Greiner Bio-one 627160
60 mm plates Greiner Bio-one 628102
6-well plates Thermo Scientific 140675
96 well 2 mL 128.0/85mm Greiner Bio-one 780278
Agar Formedium AGA03
Ampicillin Formedium 69-52-3
bromophenol blue Sigma BO126-25G
CaCl2 Merck 1.02382.0500
Camera Qimaging q30548
Cholesterol Amresco 0433-250G
Confocal Leica DM5500
Filter (0.22 µm) Sigma SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ165FC
Glycerol Frutarom 2355519000024
IPTG Formedium 367-93-1
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 1.04873.1000
KOH Bio-Lab 001649029100
MgSO4 Fisher 22189-08-8 Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody Hybridoma Bank 5-6
Na2HPO4·7H2O Sigma s-0751
NaCl Bio-Lab 001903029100
Peptone Merck 61930705001730
Plate pouring pump Integra does it p920
RNAi Chaperone library NA NA
SDS VWR Life Science 0837-500
ß-mercaptoethanol Bio world 41300000-1
stereomicroscope Leica MZ6
Tetracycline Duchefa Biochemie 64-75-5
Tris Bio-Lab 002009239100
Tween-20 Fisher BP337-500

References

  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O’Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Play Video

Cite This Article
Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions. J. Vis. Exp. (160), e61140, doi:10.3791/61140 (2020).

View Video