For at studere chaperone-chaperone og chaperone-substrat interaktioner, udfører vi syntetiske interaktion skærme i Caenorhabditis elegans ved hjælp af RNA interferens i kombination med milde mutationer eller over-udtryk for chaperoner og overvåge vævsspecifikke protein dysfunktion på organismeniveau.
Korrekt foldning og samling af proteiner og proteinkomplekser er afgørende for cellulær funktion. Celler anvender kvalitetskontrolveje, der korrigerer, afholder eller eliminerer beskadigede proteiner for at opretholde et sundt proteom, hvilket sikrer cellulære proteostase og forhindrer yderligere proteinskader. På grund af overflødige funktioner inden for proteostase netværk, screening for påviselige fænotyper ved hjælp af knockdown eller mutationer i chaperone-kodning gener i multicellulære organisme Caenorhabditis elegans resulterer i påvisning af mindre eller ingen fænotyper i de fleste tilfælde. Vi har udviklet en målrettet screeningsstrategi for at identificere chaperoner, der kræves til en bestemt funktion og dermed bygge bro mellem fænotype og funktion. Specifikt overvåger vi nye chaperone interaktioner ved hjælp af RNAi syntetiske interaktion skærme, banke-down chaperone udtryk, en anstandsdame ad gangen, i dyr, der bærer en mutation i en anstandsdame-kodning gen eller over-udtrykke en anstandsdame af interesse. Ved at forstyrre to chaperoner, der individuelt præsenterer ingen brutto fænotype, kan vi identificere chaperoner, der forværrer eller udsætter en bestemt fænotype, når begge forstyrres. Vi viser, at denne tilgang kan identificere specifikke sæt chaperoner, der fungerer sammen for at modulere foldningen af et protein- eller proteinkomplekser forbundet med en given fænotype.
Celler klare proteinskader ved at anvende kvalitetskontrol machineries at reparere, binde eller fjerne eventuelle beskadigede proteiner1,2. Foldning og samling af proteinkomplekser understøttes af molekylære chaperoner, en forskelligartet gruppe af meget konserverede proteiner, der kan reparere eller binde beskadigede proteiner3,4,5,6,7. Fjernelsen af beskadigede proteiner medieres af ubiquitin-proteasome-systemet (UPS)8 eller af autophagy-maskinerne9 i samarbejde med chaperoner10,11,12. Protein homøostase (proteostase) vedligeholdes derfor af kvalitetskontrolnetværk, der består af folde- og nedbrydningsmaskiner3,13. Det er imidlertid en stor udfordring at forstå samspillet mellem de forskellige komponenter i proteostasenetværket in vivo. Mens protein-protein interaktion skærme bidrage med vigtige oplysninger om fysiske interaktioner og chaperone komplekser14,15, forståelse af organisation og kompenserende mekanismer inden for vævsspecifikke chaperone netværk in vivo mangler.
Genetiske interaktioner bruges ofte som et kraftfuldt værktøj til at undersøge forholdet mellem par af gener, der er involveret i fælles eller kompenserende biologiske veje16,17,18. Sådanne relationer kan måles ved at kombinere par mutationer og kvantificere virkningen af en mutation i et gen på den fænotypiske sværhedsgrad forårsaget af en mutation i det andet gen16. Mens de fleste sådanne kombinationer ikke viser nogen effekt i form af fænotype, nogle genetiske interaktioner kan enten forværre eller lindre sværhedsgraden af den målte fænotype. Skærpende mutationer observeres, når fænotypen af dobbelt sletning mutant er mere alvorlig end den forventede fænotype set ved at kombinere enkelt sletning mutanter, hvilket indebærer, at de to gener fungerer i parallelle veje, sammen påvirker en given funktion. I modsætning hertil observeres lindre mutationer, når fænotypen af dobbelt sletning mutant er mindre alvorlig end fænotypen set med enkelt sletning mutanter, hvilket indebærer, at de to gener fungerer sammen som et kompleks eller deltage i den samme vej16,18. Derfor er forskellige fænotyper, der kan kvantificeres, herunder brede fænotyper, såsom dødelighed, vækstrater og brødstørrelse, samt specifikke fænotyper, såsom transskriptionelle journalister, blevet brugt til at identificere genetiske interaktioner. For eksempel, Jonikas et al. påberåbt sig en ER stress reporter til at undersøge interaktioner af Saccharomyces cerevisiae ER udfoldet protein respons proteostase netværk ved hjælp af parvis gensletning analyser19.
Genetiske interaktion skærme indebærer systematisk krydser parvis sletning mutationer til at generere et omfattende sæt af dobbelt mutanter20. Men i dyremodeller, og specifikt i C. elegans,er denne store tilgang ikke mulig. I stedet kan mutantstammer testes for deres genetiske interaktionsmønstre ved at nedregulerende genekspression ved hjælp af RNA-interferens (RNAi)21. C. elegans er et kraftfuldt system til skærme baseret på RNAi22,23. I C. elegansopnås dobbeltstrenget RNA (dsRNA) levering ved bakteriel fodring, hvilket fører til spredning af dsRNA-molekyler til mange væv. På denne måde påvirker de indførte dsRNA-molekyler dyret via en hurtig og enkel procedure21. En genetisk interaktion skærm ved hjælp af RNAi kan derfor afsløre virkningen af ned-regulering af et sæt af gener eller de fleste C. elegans kodning gener ved hjælp af RNAi biblioteker24. I en sådan skærm, hits, der påvirker adfærd mutant af interesse, men ikke den vilde type stamme er potentielle modifikatorer af fænotypen overvåges25. Her anvender vi en kombination af mutationer og RNAi screening til systematisk at kortlægge vævsspecifikke chaperoneinteraktioner i C. elegans.
Et integreret billede af proteostasenetværket, der afspejler, hvordan det er organiseret og fungerer i forskellige metazoceller og væv, mangler stadig. For at løse denne mangel kræves der specifikke oplysninger om samspillet mellem forskellige komponenter i dette netværk, såsom molekylære chaperoner, i specifikke væv i løbet af udvikling og aldring. Her viste vi, hvordan brugen af vævsspecifikke forstyrrelser gjorde det muligt for os at undersøge chaperonenetværket i et givet væv. For at udforske vævsspecif…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Caenorhabditis Genetics Center, finansieret af NIH National Center for Research Resources (NCRR), for nogle af nematode stammer. Monoklonale antistoffer udviklet af H.F. Epstein blev fremstillet fra Developmental Studies Hybridoma Bank udviklet i regi af NICHD og vedligeholdt af Department of Biology, University of Iowa. Denne forskning blev støttet af et tilskud fra Israel Science Foundation (bevilling nr. 278/18) og af et tilskud fra Israels ministerium for videnskab og teknologi og udenrigsministeriet og internationalt samarbejde, Generaldirektoratet for Landefremme, Den Italienske Republik (tilskud nr. 3-14337). Vi takker medlemmer af Ben-Zvi laboratoriet for hjælp til at forberede dette manuskript.
12-well-plates | SPL | BA3D16B | |
40 mm plates | Greiner Bio-one | 627160 | |
60 mm plates | Greiner Bio-one | 628102 | |
6-well plates | Thermo Scientific | 140675 | |
96 well 2 mL 128.0/85mm | Greiner Bio-one | 780278 | |
Agar | Formedium | AGA03 | |
Ampicillin | Formedium | 69-52-3 | |
bromophenol blue | Sigma | BO126-25G | |
CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | |
Camera | Qimaging | q30548 | |
Cholesterol | Amresco | 0433-250G | |
Confocal | Leica | DM5500 | |
Filter (0.22 µm) | Sigma | SCGPUO2RE | |
Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ165FC | |
Glycerol | Frutarom | 2355519000024 | |
IPTG | Formedium | 367-93-1 | |
KCl | Merck | 104936 | |
KH2PO4 | Merck | 1.04873.1000 | |
KOH | Bio-Lab | 001649029100 | |
MgSO4 | Fisher | 22189-08-8 | Gift from the Morimoto laboratory |
Myosin MHC A (MYO-3) antibody | Hybridoma Bank | 5-6 | |
Na2HPO4·7H2O | Sigma | s-0751 | |
NaCl | Bio-Lab | 001903029100 | |
Peptone | Merck | 61930705001730 | |
Plate pouring pump | Integra | does it p920 | |
RNAi Chaperone library | NA | NA | |
SDS | VWR Life Science | 0837-500 | |
ß-mercaptoethanol | Bio world | 41300000-1 | |
stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
Tetracycline | Duchefa Biochemie | 64-75-5 | |
Tris | Bio-Lab | 002009239100 | |
Tween-20 | Fisher | BP337-500 |