Summary
Para estudiar las interacciones chaperona-chaperona y chaperona-sustrato, realizamos pantallas de interacción sintética en Caenorhabditis elegans utilizando interferencia de ARN en combinación con mutaciones leves o sobreexpresión de chaperonas y monitoreamos la disfunción proteica específica del tejido a nivel del organismo.
Abstract
El correcto plegamiento y ensamblaje de proteínas y complejos proteicos es esencial para la función celular. Las células emplean vías de control de calidad que corrigen, secuestran o eliminan las proteínas dañadas para mantener un proteoma saludable, asegurando así la proteostasis celular y previniendo un mayor daño proteico. Debido a las funciones redundantes dentro de la red de proteostasis, la detección de fenotipos detectables mediante el derribo o mutaciones en genes que codifican chaperonas en el organismo multicelular Caenorhabditis elegans da como resultado la detección de fenotipos menores o nulos en la mayoría de los casos. Hemos desarrollado una estrategia de detección dirigida para identificar las chaperonas necesarias para una función específica y, por lo tanto, cerrar la brecha entre el fenotipo y la función. Específicamente, monitoreamos las nuevas interacciones de chaperonas utilizando pantallas de interacción sintética de ARNi, derribando la expresión de chaperonas, una chaperona a la vez, en animales portadores de una mutación en un gen que codifica chaperona o sobreexpresando una chaperona de interés. Al interrumpir dos chaperonas que individualmente no presentan fenotipo grueso, podemos identificar chaperonas que agravan o exponen un fenotipo específico cuando ambas perturban. Demostramos que este enfoque puede identificar conjuntos específicos de chaperonas que funcionan juntas para modular el plegamiento de una proteína o complejos de proteínas asociados con un fenotipo dado.
Introduction
Las células hacen frente al daño de las proteínas mediante el empleo de maquinarias de control de calidad que reparan, secuestran o eliminan cualquier proteína dañada1,2. El plegamiento y el ensamblaje de complejos de proteínas están respaldados por chaperonas moleculares, un grupo diverso de proteínas altamente conservadas que pueden reparar o secuestrar proteínas dañadas3,4,5,6,7. La eliminación de proteínas dañadas está mediada por el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS)8 o por la maquinaria de autofagia9 en colaboración con chaperonas10,11,12. La homeostasis proteica (proteostasis) se mantiene, por lo tanto, mediante redes de control de calidad compuestas por maquinarias de plegamiento y degradación3,13. Sin embargo, comprender las interacciones entre los diversos componentes de la red de proteostasis in vivo es un desafío importante. Si bien las pantallas de interacción proteína-proteína aportan información importante sobre las interacciones físicas y los complejos de chaperonas14,15, es deficiente comprender la organización y los mecanismos compensatorios dentro de las redes de chaperonas específicas de los tejidos in vivo.
Las interacciones genéticas se utilizan a menudo como una herramienta poderosa para examinar la relación entre pares de genes que están involucrados en vías biológicas comunes o compensatorias16,17,18. Tales relaciones se pueden medir combinando pares de mutaciones y cuantificando el impacto de una mutación en un gen en la gravedad fenotípica causada por una mutación en el segundo gen16. Si bien la mayoría de estas combinaciones no muestran ningún efecto en términos de fenotipo, algunas interacciones genéticas pueden agravar o aliviar la gravedad del fenotipo medido. Las mutaciones agravantes se observan cuando el fenotipo del mutante de doble deleción es más grave que el fenotipo esperado visto al combinar los mutantes de deleción simple, lo que implica que los dos genes funcionan en vías paralelas, afectando juntos a una función dada. Por el contrario, se observan mutaciones de alivio cuando el fenotipo del mutante de doble deleción es menos grave que el fenotipo observado con los mutantes de deleción simple, lo que implica que los dos genes actúan juntos como un complejo o participan en la misma vía16,18. En consecuencia, se han utilizado diversos fenotipos que se pueden cuantificar, incluidos fenotipos amplios, como la letalidad, las tasas de crecimiento y el tamaño de la cría, así como fenotipos específicos, como los reporteros transcripcionales, para identificar interacciones genéticas. Por ejemplo, Jonikas et al. se basaron en un reportero de estrés de ER para examinar las interacciones de la red de proteostasis de respuesta proteica desplegada por Saccharomyces cerevisiae ER utilizando análisis de deleción de genes por pares19.
Las pantallas de interacción genética implican el cruce sistemático de mutaciones de deleción por pares para generar un conjunto completo de mutantes dobles20. Sin embargo, en modelos animales, y específicamente en C. elegans,este enfoque a gran escala no es factible. En cambio, las cepas mutantes pueden ser probadas por sus patrones de interacción genética mediante la regulación a la baja de la expresión génica utilizando la interferencia de ARN (RNAi)21. C. elegans es un potente sistema para pantallas basado en RNAi22,23. En C. elegans, laentrega de ARN de doble cadena (dsRNA) se logra mediante la alimentación bacteriana, lo que lleva a la propagación de moléculas de dsRNA a numerosos tejidos. De esta manera, las moléculas de dsRNA introducidas impactan al animal a través de un procedimiento rápido y sencillo21. Una pantalla de interacción genética utilizando RNAi puede, por lo tanto, revelar el impacto de la regulación a la baja de un conjunto de genes o la mayoría de los genes codificantes de C. elegans utilizando bibliotecas de RNAi24. En dicha pantalla, los golpes que impactan en el comportamiento del mutante de interés pero no en la cepa de tipo salvaje son potenciales modificadores del fenotipo que se está monitoreando25. Aquí, aplicamos una combinación de mutaciones y cribado de ARNi para mapear sistemáticamente las interacciones de chaperonas específicas de tejidos en C. elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de placas de medios de crecimiento de nematodos para RNAi
- A una botella de 1 L, agregue 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-Peptona, 17 g de agar y agua destilada hasta 1 L y autoclave.
- Enfríe la botella a 55 °C.
- Añadir 25 mL de 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, y 1 mL de solución de colesterol (Tabla 1) para hacer nematodos medios de crecimiento (NGM).
- Añadir 1 ml de ampicilina (100 mg/ml) y 0,5 ml de 1 M de IPTG (Tabla 1) para hacer la solución de NGM-ARNi.
NOTA: La bacteria E. coli HT115 (DE3) de uso común contiene una ADN polimerasa T7 inducible por IPTG utilizada para expresar los plásmidos que codifican dsRNA. Estos plásmidos también codifican para la resistencia a la ampicilina. - Mezcle la solución tibia removiendo la botella.
- En la campana o utilizando procedimientos estériles, vierta la solución de NGM en placas o usando una bomba peristáltica, dispense la solución en placas. Utilice placas de 6 pozos, 12 pozos, 40 mm o 60 mm para esta pantalla. El agar debe llenar aproximadamente 2/3 de la profundidad de la placa.
- Deje que las placas se sequen durante la noche en el banco a temperatura ambiente, manteniendo las placas cubiertas. Las placas NGM para RNAi se pueden almacenar a 4 °C durante un mes.
2. Cultivo de bacterias RNAi y siembra de las placas
- En la campana o mediante procedimientos estériles, añadir 1 ml de ampicilina (100 mg/ml) y 2,5 ml de tetraciclina (5 mg/ml) (Tabla 1) a una solución de LB de 1 L preautoclave y mezclar.
NOTA: Las bacterias HT115 (DE3) E. coli de uso común son resistentes a la tetraciclina. - En la campana o utilizando procedimientos estériles, agregue 600 μL de solución de LB a cada pozo en placas estériles de 96 ormentos de 2 ml de profundidad. Lo mejor es utilizar una pipeta multicanal para dispensar los medios.
- Mediante procedimientos estériles, inocular pozos con bacterias HT115(DE3) E. coli transformadas con un plásmido codificante de dsRNA dirigido a un gen de interés o a un plásmido vacío, como control. Cubra las placas e incube a 37 °C durante la noche. Las bibliotecas que consisten en clones bacterianos que expresan dsRNA, correspondientes a ~ 94% de los genes predichos de C. elegans se construyeron previamente22,23 y están disponibles comercialmente. La biblioteca de acompañantes utilizada aquí fue construida por el laboratorio del Dr. Richard Morimoto26.
- Utilizando procedimientos estériles, seeste 75, 150 o 250 μL de bacterias en las placas de ARNi NGM de 12 pozos, 40 mm y 6 o 60 mm, respectivamente. Marque claramente el nombre del gen objetivo en la placa. Las bacterias deben cubrir el 30-50% de la superficie del agar y no deben tocar los bordes de la placa.
- Deje que las placas se sequen durante al menos 2 días en el banco a temperatura ambiente, manteniendo las placas cubiertas.
NOTA: Las placas se pueden incubar a 37 °C durante la noche. Asegúrese de que los pozos interiores estén secos antes de usar o almacenar las placas. Para todos los fines a largo plazo (es decir, secado o almacenamiento) mantenga las placas en la oscuridad. Las placas secas y secuedradas se pueden almacenar a 4 °C hasta por un mes.
3. Sincronización no estresante de embriones
- Use una púa de gusano para mover alrededor de 100 huevos de una placa de gusano no sincronizada a una placa NGM recién secuenada.
- Cultive animales durante 5 días a 15 °C, 3,5 días a 20 °C o 2,5 días a 25 °C. Los animales deben llegar al primer día de puesta de huevos.
NOTA: Los gusanos se cultivan comúnmente a 20 ° C. Sin embargo, diferentes cepas mutantes chaperonas pueden requerir temperaturas de cultivo específicas. Por ejemplo, muchas cepas sensibles a la temperatura se cultivan a 15 °C, pero se desplazan a 25 °C para exponer su fenotipo. - Agregue 1 ml de tampón M9(Tabla 1)lentamente y lejos del césped bacteriano. Gire la placa para que el tampón cubra completamente la placa. Luego inclínelo hacia un lado y retire el líquido del plato y lave a los animales del plato.
NOTA: Cuando se utilizan animales sensibles a la temperatura o mutantes chaperones, es mejor mantener los tampones utilizados en el protocolo a la temperatura de cultivo de los animales. - Repita el paso 3.3 tres veces o hasta que todos los animales se laven del plato.
- Usando una punta de plástico estándar, corte un cuadrado de agar del plato lavado donde se concentran los huevos y coloque el trozo de agar en un plato NGM recién sembrado.
NOTA: Se requieren ~ 200 huevos para producir suficientes animales que ponen huevos; demasiados animales consumen la bacteria demasiado rápido. Los niveles bajos de alimentos pueden afectar la proteostasis27. - Cultive los animales durante 5 días a 15 °C, 3,5 días a 20 °C o 2,5 días a 25 °C. En este punto, las placas deben cubrirse con huevos sincronizados.
NOTA: Los animales se pueden cambiar a una nueva placa durante un corto período de tiempo para una sincronización más estricta. Sin embargo, es importante usar solo adultos en las primeras etapas de la puesta de huevos, ya que los animales pueden retener los huevos en su útero afectando la sincronización. - Agregue 1 ml de tampón M9 lentamente y lejos del césped bacteriano.
- Gire la placa para que el tampón cubra completamente la placa. Luego inclínelo hacia un lado y retire el líquido del plato y lave a los animales del plato.
- Repita el paso 3.7 tres veces o hasta que todos los animales se laven del plato.
- Agregue 1 ml de tampón M9 y use un raspador de células para liberar los huevos de la placa.
- Recoge el tampón M9 que contiene los huevos de las placas.
- Centrifugar el tampón M9 que contiene los huevos a 3.000 x g durante 2 min.
- Retire el sobrenadante y agregue el búfer M9 para alcanzar un volumen de 1 ml.
- Resuspenda los huevos para interrumpir cualquier trozo de huevos y bacterias.
- Repita el procedimiento de lavado descrito en los pasos 3.11-3.13 cinco veces. El pellet de huevo debe aparecer blanco. Si todavía es amarillo / marrón, repita el lavado hasta que se alcance un gránulo blanco.
NOTA: Las bacterias que permanecen en los huevos pueden contaminar las bacterias que expresan dsRNA. - Retire la mayor parte del sobrenadante, dejando unos 200 μL. Los huevos sincronizados se pueden usar para pantallas de ARNi.
4. Ensayos fenotípicos comunes
- Cultivo de animales durante experimentos
- Coloque una gota de ~ 30 huevos cerca del césped bacteriano en cada placa con semillas de ARNi. Como referencia, también coloque ~ 30 huevos en placas secuesdas con bacterias vacías que contienen vectores (L4440).
- Cultive animales sincronizados por la edad en placas con semillas de ARNi NGM. La duración del experimento dependerá de la etapa en la que se controlará a los animales y de la temperatura de cultivo. Ajuste la temperatura de cultivo cuando use animales mutantes sensibles a la temperatura. Ajuste la duración del cultivo cuando use animales mutantes con retraso en el desarrollo.
NOTA: Si bien el tiempo puede variar, una vez que los animales alcanzan la edad adulta, la puesta de huevos (y el consumo rápido de alimentos resultante), así como el colapso de proteostsis dependiente de la edad28, podrían afectar los resultados. Por lo tanto, se recomienda puntuar a los animales antes del inicio de la puesta de huevos (día 1 de la edad adulta). Los animales de tipo salvaje alcanzan esta etapa después de 4,5 días a 15 °C, 3 días a 20 °C o 2 días a 25 °C. - El número de repeticiones utilizadas dependerá del tamaño del conjunto de genes examinado. Para la biblioteca de chaperonas (97 genes), repita los experimentos al menos cuatro veces. El tamaño de la población depende del ensayo utilizado. En los ensayos de comportamiento discutidos aquí, puntúa >15 animales por condición experimental en cada repetición. Los datos y los análisis estadísticos también dependen en gran medida del tipo de ensayo utilizado. Los datos en los ensayos discutidos aquí se pueden presentar como medios ± SEM.
- Compare los animales tratados con ARNi y control de vectores vacíos como poblaciones independientes. Los valores de P se pueden calcular utilizando ANOVA unidireccional o bidireccional, dependiendo de los cambios examinados, es decir, agravando o aliviando solo o ambos. Al examinar un solo tratamiento de ARNi frente a control, los valores de P se pueden calcular utilizando la prueba de suma de rango de Mann-Whitney unidirección o bidireccional. Aparte de la significación estadística, considere un umbral para los aciertos basado en el grado de impacto en el fenotipo.
- Detención/retraso en el desarrollo
- Cultive animales sincronizados por edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados en bacterias de control que contienen vectores vacíos alcancen la edad adulta, pero antes de que comience la puesta de huevos.
- Monitoree a los animales usando un estereomicroscópica y cuente el número de larvas y adultos para calificar el porcentaje de animales con retraso en el desarrollo. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias de control que contienen vectores vacíos. El tratamiento con ARNi hsp-1 o hsp-90 da como resultado la detención del desarrollo de animales de tipo salvaje y se puede utilizar como un control positivo.
- Para calificar el porcentaje de animales con retraso en el desarrollo a lo largo del tiempo, repita el paso 4.2.2.
NOTA: Si hay adultos que ponen huevos en el plato, transfiera los animales retrasados por el desarrollo a una nueva placa NGM-RNAi etiquetada para el mismo gen objetivo para evitar confusiones con la progenie.
- Defectos de esterilidad o puesta de huevos
- Cultive animales sincronizados por edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados en bacterias vacías de control de vectores comiencen a poner huevos.
- Monitoree a los animales usando un estereomiroscopio y puntúe el porcentaje de animales sin óvulos visibles en su útero. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias vacías de control de vectores.
- Alternativamente, monitoree a los animales usando un estereomiroscopio y puntúe el porcentaje de animales con un útero lleno de huevos, definido como EGg Poneción defectuosa (Egl-d) fenotipo29.
- Letalidad embrionaria
- Cultive animales sincronizados por edad como en el paso 4.1 hasta que los animales comiencen a poner huevos.
- Transfiera ~ 100 huevos a un plato vacío. Extiende los huevos en filas para simplificar el conteo.
- Anote el porcentaje de huevos no eclostos en el plato después de 24-48 horas. Como referencia, compare con los huevos de animales tratados con bacterias de control de vectores vacías.
- Ensayo de parálisis
- Para los adultos del día 1, cultive animales sincronizados por la edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados en bacterias vacías de control de vectores alcancen la edad adulta, pero antes de que comience la puesta de huevos.
- Dibuja una línea en la parte posterior de una placa de agar NGM normal usando un marcador fino.
- Coloque de 5 a 10 animales en la línea marcada.
- Configure un temporizador y espere 10 minutos.
- Puntúe el porcentaje de animales que permanecen en la línea como gusanos paralizados. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias vacías de control de vectores. Los animales de tipo salvaje tratados con ARNi unc-45 muestran un fenotipo de parálisis severa y pueden usarse como control positivo.
NOTA: Este ensayo destaca a los animales que muestran parálisis media a severa. Tales animales generalmente se encuentran rectos en el plato, en lugar de presentar la forma curva común. Además, un parche limpio de bacterias es visible alrededor de las cabezas de los gusanos paralizados.
- Ensayo de golpiza
- Cultive animales sincronizados por la edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados con bacterias vacías de control de vectores alcancen la edad adulta, pero antes de que comience la puesta de huevos.
- Pipete 100 μL de tampón M9 a la temperatura de cultivo de los animales en una placa de 96 pozos.
- Coloque ~ 15 gusanos, uno por pozo, en los pozos que contienen tampón M9.
- Deje que los animales se ajusten durante 5 min.
- Examine a cada animal bajo el estereomitroscopio, inicie un temporizador contando 15 s y cuente el número de curvas corporales que cada animal realiza en ese período de tiempo. Los valores contados se pueden normalizar a curvas corporales por minuto. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias vacías de control de vectores.
NOTA: Este ensayo de motilidad es muy sensible y puede detectar diferencias muy leves entre los tratamientos. Sin embargo, la motilidad en líquido y la motilidad en agar pueden diferir.
5. Validación del derribo de proteínas
- Coloque 250-300 huevos sincronizados en una placa NGM-RNAi de 60 mm secuesta con las bacterias relevantes que expresan dsRNA o que contienen vectores vacíos (L4440).
NOTA: El derribo de ARNi podría resultar en una acumulación aberrante de embriones, en una falta de embriones o en una detención del desarrollo que podría afectar la expresión génica. Esto debe tenerse en cuenta al determinar la edad de los animales que se examinarán. - Para adultos del día 1, cultive animales durante 4,5 días a 15 °C, 3 días a 20 °C o 2 días a 25 °C.
- Recoger y transferir un total de 200 animales adultos jóvenes a la tapa de un relleno de tubo de 1,5 ml con 200 μL de PBS-T.
NOTA: Cuando se utilizan animales sensibles a la temperatura o mutantes chaperones, es mejor mantener los tampones utilizados en el protocolo a la temperatura de cultivo de los animales. - Cierre la tapa con cuidado y centrífuga a 1.000 x g durante 1 min.
- Añadir 800 μL de PBS-T(Tabla 1)y centrifugar a 1.000 x g durante 1 min.
- Retire con cuidado los 900 μL superiores.
- Repita los pasos 5.4-5.6 tres veces.
- Retire 900 μL, dejando 100 μL de solución que contiene los 200 gusanos.
- Añadir 25 μL de búfer de muestra 5x (Tabla 1).
- Calentar las muestras durante 10 min a 92°C mientras agita a 1000 rpm. Las muestras pueden congelarse y conservarse a -20 °C.
- Cargue 20 μL de cada muestra y ejecute en un gel SDS-PAGE.
- Realizar análisis de western blot utilizando anticuerpos apropiados para determinar la estabilidad relativa de la proteína.
- Determine la intensidad de las bandas utilizando software densitométrico, como el módulo de gel ImageJ disponible gratuitamente. Normalice todos los valores a los medidos en la(s) muestra(s) de control.
NOTA: El objetivo de la eliminación de ARNi en nuestras pantallas es reducir los niveles de proteína de una chaperona / co-chaperona específica. Por lo tanto, la mejor manera de evaluar la eficiencia del derribo de ARNi es mediante el análisis de western blot. Esto requiere anticuerpos específicos. Alternativamente, la qPCR se puede utilizar para cuantificar los niveles de ARNm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uso de mutaciones sensibles a la temperatura en UNC-45 para detectar interacciones agravantes o de alivio en condiciones permisivas o restrictivas, respectivamente
El ensamblaje y mantenimiento muscular ofrece un sistema eficaz para estudiar las interacciones de chaperonas específicas del tejido. La unidad funcional de los músculos contráctiles, el sarcómero, presenta una disposición cristalina de proteínas estructurales y reguladoras. La estabilidad de la proteína motora miosina y su incorporación en los filamentos gruesos de los sarcómeros musculares contráctiles depende de la cooperación de chaperonas y componentes de UPS30. Un ejemplo de una de esas chaperonas es la chaperona de miosina conservada y especializada UNC-45 que se expresa principalmente en el músculo de la pared corporal31,32,33,34,35. Se ha demostrado que las mutaciones en UNC-45 inducen desorganización de la miosina y defectos graves de motilidad en C. elegans31,36. Los módulos en tándem UNC-45 se ensamblan en una plataforma de acoplamiento multisoposición37 que refuerza la colaboración entre UNC-45, HSP-90 y HSP-1 y probablemente otras chaperonas y co-chaperonas en el ensamblaje de filamentos de miosina25,36,37,38. Para confirmar las interacciones unc-45 conocidas e identificar nuevas interacciones genéticas en la proteostasis muscular, establecimos una estrategia utilizando mutaciones unc-45 sensibles a la temperatura de C. elegans como un fondo genético sensibilizado para el cribado de interacción de chaperona específica del tejido19,25.
Sustituciones de aminoácidos individuales en C. elegans UNC-45 (L822F y E781K, correspondientes a los alelos e286 y m94, respectivamente; unc-45(ts)) son responsables de los defectos de motilidad dependientes de la temperatura y de los fenotipos de desorganización de la miosina cuando los animales afectados se cultivan en condiciones restrictivas (>22 °C). En contraste, estos mutantes unc-45(ts) no muestran defectos de movimiento u organización de miosina a la temperatura permisiva (15 °C)31. En el enfoque propuesto, los animales unc-45(e286) sincronizados por edad en la primera etapa larvaria (L1) fueron agotados de diferentes chaperonas moleculares por RNAi (97 genes) y luego monitoreados para detectar defectos de motilidad en condiciones permisivas (15 °C) (Figura 1). Confirmamos la interacción conocida de las proteínas UNC-45 y HSP-90 en nuestro cribado de interacciones genéticas e identificamos tres co-chaperonas hsp-90, sti-1, ahsa-1 y daf-41,como causantes específicos de un defecto de movimiento sintético en animales mutantes unc-45(ts) pero no en animales de tipo salvaje25. Pasamos a examinar si los fenotipos sintéticos asociados a sti-1-, ahsa-1- o daf-41-fueron causados por la desorganización de la miosina mediante el monitoreo de la disposición subcelular de la cadena pesada de miosina A (MYO-3), utilizando técnicas de inmuno-tinción establecidas39. Mientras que el tratamiento de animales salvajes con RNAi sti-1, ahsa-1 o daf-41 no afectó a la organización de miofilamentos, el agotamiento de estos genes en animales mutantes unc-45(e286) dio lugar a una interrupción completa de las estructuras sarcoméricas y a la mala localización de MYO-3, incluso en condiciones permisivas (15 °C). Este efecto fue comparable al observado con mutantes únicos unc-45(e286) cultivados a la temperatura restrictiva (25 °C)25. Estos resultados se confirmaron utilizando otro alelo unc-45(ts),a saber, unc-45 (m94) animales mutantes25.
Para identificar chaperonas que desestabilizan UNC-45, a continuación examinamos chaperonas que mejoraron la motilidad de los animales unc-45 (286) a 25 ° C, basándose en la eliminación de genes por RNAi. Mientras que los animales mutantes unc-45(e286) mostraron graves defectos de movimiento a 25 °C, la motilidad de los animales tratados con ARNi frente a los genes que codifican cuatro de las 97 chaperonas examinadas mejoró significativamente. Aquí también, los resultados se confirmaron utilizando animales mutantes unc-45 (m94). Por lo tanto, el uso de mutaciones sensibles a la temperatura permite establecer pantallas agravantes y de alivio, dependiendo de la temperatura a la que se realice la pantalla.
Uso de la sobreexpresión específica del tejido de una chaperona para detectar interacciones agravantes
A continuación, utilizamos la sobreexpresión tisular específica de una sola chaperona como una perturbación leve de la red de chaperonas musculares para fines de detección. Específicamente, utilizamos animales que sobre-expresan el tipo salvaje dnj-24,codificando el homólogo de C. elegans de la proteína Hsp40 DNAJB6 en el músculo de la pared corporal de C. elegans (DNJ-24M). Como se mencionó anteriormente, los animales L1 DNJ-24M fueron tratados con ARNi para diferentes chaperonas y monitoreados para detectar defectos de motilidad (20 °C) (Figura 1). Mientras que los animales DNJ-24M no mostraron defectos de motilidad notables, tres genes (de los 48 genes codificantes de chaperonas examinados; 6%), a saber, hsp-1, rme-8y dnj-8, afectaron específicamente la motilidad de los animales que expresan DNJ-24M, pero no a los animales de tipo salvaje. Es de destacar que la prueba de la especificidad de los golpes utilizando animales que sobre-expresan una chaperona diferente, a saber, HSP-90, en el músculo (HSP90M), no mostró ningún efecto sobre la motilidad de HSP90M sobre hsp-1, rme-8o dnj-8 RNAi tratamiento40. En conjunto, la plataforma de detección, que emplea una perturbación leve en la red de chaperonas, como la expresión de proteínas mutantes metaestables o la sobreexpresión específica del tejido, dio como resultado una tasa de aciertos altamente específica (normalmente ~ 5%).
Uso de ARNi específico del tejido para detectar interacciones genéticas específicas del tejido
Las cepas sensibles al ARNi específico del tejido permiten la eliminación de genes específicos del tejido mientras siguen utilizando la alimentación bacteriana para la administración de dsRNA. Estas cepas son mutantes para la proteína argonauta RDE-1, un componente importante en la vía RNAi requerida para el silenciamiento génico efectivo21. Sin embargo, la expresión de RDE-1 de tipo salvaje bajo el control de un promotor específico del tejido condujo a un derribo efectivo del gen específico del tejido41,42. Por lo tanto, esta herramienta permite detectar pruebas de interacción genética sin utilizar chaperonas específicas de tejidos, como UNC-45 o DNAJ-24M. Por ejemplo, el derribo de hsp-6 (mortalin) en animales de tipo salvaje durante el desarrollo resultó en una fuerte detención del desarrollo (96±1% de los animales tratados con ARNi). Al mismo tiempo, el derribo de hsp-6 en una cepa que expresa RDE-1 de tipo salvaje en el músculo no causó detención del desarrollo, mientras que la expresión de RDE-1 de tipo salvaje en células intestinales dio lugar a un fuerte fenotipo de detención del desarrollo (90±3%; Figura 2). Por lo tanto, la función HSP-6 en las células intestinales es necesaria para el desarrollo normal. Una mutación en hsp-6 (mg585) que causa un retraso leve en el crecimiento puede, por lo tanto, usarse para detectar interacciones agravantes o de alivio de chaperonas cruzando ese gen mutado en una cepa de ARNi específica del intestino y examinando la biblioteca de ARNi de chaperona.
Monitoreo de los cambios dependientes de la edad en el entorno de plegamiento utilizando interacciones genéticas
Los animales muestran una disminución de la motilidad dependiente de la edad que se asocia con la desorganización sarcomérica43,44,45. Los cambios en la capacidad de plegamiento de proteínas coinciden con la alteración de la regulación y composición de la maquinaria de proteostasis celular28, incluyendo niveles alterados de UNC-45, CHN-1 y UFD-2, proteínas de la maquinaria de control de calidad muscular46. De acuerdo, el plegamiento y la degradación de la miosina se ven afectados por alteraciones en la capacidad proteostática en la transición a la edad adulta47. Por lo tanto, preguntamos si tales cambios podrían afectar las interacciones de chaperonas. Por ejemplo, monitoreamos el impacto del knockdown de sti-1, ahsa-1 y daf-41 en la motilidad a lo largo del tiempo. Encontramos que aunque los animales tratados con STI-1-, ahsa-1- y daf-41-RNAi mostraron una motilidad reducida durante el desarrollo larvario, la motilidad disminuyó fuertemente en los gusanos adultos unc-45(ts). Además, la organización de MYO-3 en animales mutantes unc-45(ts) tratados con sti-1, ahsa-1 o daf-41 RNAi fue similar a la de los gusanos de tipo salvaje en la cuarta etapa larvaria (L4), aunque los mutantes exhibieron sarcómeros interrumpidos después de que los animales alcanzaron la edad adulta(Figura 3). Por el contrario, tanto los animales mutantes unc-45(ts) tratados con un control vectorial vacío como los animales de tipo salvaje no se vieron afectados (Figura 3). Por lo tanto, la dinámica de la proteostasis en función de la edad o las condiciones ambientales27,45,46,48,49 podría afectar críticamente las interacciones de chaperonas.
Figura 1: Configuración de pantallas de interacción sintética de ARNi utilizando C. elegans portador de una mutación en un gen que codifica una chaperona de interés. (A) Representación esquemática de la configuración básica de las pantallas de interacción de chaperonas objetivo. (B) La validación de golpes requiere la confirmación de la interacción genética utilizando otro mutante chaperone, así como la validación de la especificación del derribo de ARNi. (C-D) Las lecturas simples, como los defectos de motilidad, se pueden cuantificar para determinar interacciones agravantes o de alivio, utilizando ensayos de parálisis o golpes, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El ARNi tisular específico de la chaperona mitocondrial hsp-6 se puede utilizar para examinar las interacciones genéticas en un tejido. Las distensiones de ARNi específicas de intestino y músculo de tipo salvaje se trataron con ARNi hsp-6 y (A) se puntúa el retraso en el desarrollo o (B) se tomaron imágenes en el primer día de la edad adulta. Los datos son ± SEM, N=6. La barra de escala es de 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Efectos del ARNi dependientes de la edad. (A) Motilidad con la edad. Los embriones de tipo salvaje o unc-45 (e286) se colocaron en placas de semillas de RNAi sti-1, ahsa-1 o daf-41 a 15 ° C y se calificaron para la motilidad utilizando un ensayo de golpeteo en cada etapa de desarrollo, L1-L4, adulto joven y día 1 de la edad adulta. Los datos son ± SEM, N=15. (B) Imágenes confocales del músculo de la pared corporal. Los animales fueron tratados como en A y fijados en la L4, adulto joven y día 1 de las etapas adultas e inmuno-teñidos con anticuerpos anti-MYO-3. La barra de escala es de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución | Instrucciones de preparación | Almacenamiento |
| 1 M CaCl2 (1 L) | Añadir 147.01 g CaCl2·2H2O | Tienda en RT |
| Añadir dH2O a 1 L | ||
| Autoclave o filtro (0,22 μm) | ||
| 1 M KH2PO4, pH 6.0 (1 L) | Añadir 136.09 g KH2PO4 | Tienda en RT |
| Añadir 800 mL dH2O | ||
| Mezclar con agitador magnético hasta que se disuelva | ||
| Valorar el pH usando KOH | ||
| Añadir dH2O a 1 L | ||
| Autoclave o filtro (0,22 μm) | ||
| 1 M mgSO4 (1 L) | Añadir 248.58 g MgSO4·7H2O | Tienda en RT |
| Añadir dH2O a 1 L | ||
| Autoclave o filtro (0,22 μm) | ||
| Solución de colesterol (50 ml) | Agregue 250 mg de colesterol a un tubo Falcon de 50 ml | Conservar a -20 °C |
| Disolver completamente en etanol de 40 ml | ||
| Añadir etanol a 50 ml | ||
| 1 M IPTG (50 ml) | Añadir 11,9 g de IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopyranoside) a un tubo Falcon de 50 ml | Conservar en la oscuridad a -20 °C |
| Disolver completamente en 40 mL dH2O | ||
| Añadir dH2O a 50 mL | ||
| Filtro (0,22 μm), tubos alícuotas de 1 ml | ||
| Stock de ampicilina (50 ml) | Añadir 5 g de ampicilina a un tubo Falcon de 50 ml | Conservar a -20 °C |
| Disolver completamente en 40 mL dH2O | ||
| Añadir dH2O a 50 mL | ||
| Filtro (0,22 μm), distribuya 1 ml de alícuota en tubos Eppendorf | ||
| Stock de tetraciclina (50 ml) | Añadir 250 mg de tetraciclina a un tubo Falcon de 50 ml | Conservar a -20 °C |
| Disolver completamente en etanol de 40 ml | ||
| Añadir etanol a 50 ml | ||
| Tubos alícuotas de 1 ml | ||
| Búfer M9 (1 L) | Añadir 5,8 g de Na2HPO4·7H2O | Tienda en RT |
| Añadir 3 g KH2PO4 | ||
| Añadir 5 g de NaCl | ||
| Añadir 0,25 g MgSO4·7H2O | ||
| Añadir dH2O a 1 L | ||
| Filtro (0.22 μm) | ||
| 1X PBS-T (pH 7.4) ( 1 L) | Añadir 8 g de NaCl | Tienda en RT |
| Añadir 200 mg de KCl | ||
| Añadir 1.44 g Na2HPO4·7H2O | ||
| Añadir 240 mg KH2PO4 | ||
| Disolver completamente en 800 mL dH2O | ||
| Valorar el pH usando KOH tp pH 7.4 | ||
| Añadir 500 μL Tween-20 | ||
| Añadir dH2O a 1 L | ||
| Búfer de muestra 5x | Añadir 6.8 mL dH2O | Conservar a -20 °C |
| Añadir 2 mL 0.5M Tris pH 6.8 | ||
| Añadir 3.2 ml de glicerol | ||
| Añadir 1.6 mL 20% SDS | ||
| Añadir 0.8 mL ß-mercaptoetanol | ||
| 1% azul de bromofenol |
Tabla 1: Recetas de solución
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sigue faltando una imagen integrada de la red de proteostasis que refleje cómo está organizada y funciona en diferentes células y tejidos metazoarios. Para abordar esta deficiencia, se requiere información específica sobre las interacciones de varios componentes de esta red, como las chaperonas moleculares, en tejidos específicos durante el curso del desarrollo y el envejecimiento. Aquí, mostramos cómo el uso de perturbaciones específicas del tejido nos permitió examinar la red de chaperonas en un tejido dado. Para explorar las interacciones genéticas de chaperonas específicas de tejidos, se consideraron tres enfoques diferentes. En el primer enfoque, UNC-45, una chaperona que se expresa altamente en las células musculares, se utilizó para detectar interacciones de chaperonas a través de la alimentación-ARNi25. Si bien el uso de una chaperona especializada permite discernir la especificidad del tejido, solo puede informar sobre esa subred altamente enfocada a la que contribuye. Tenga en cuenta que la mayoría de las neuronas de C. elegans son resistentes a la entrega de ARNi basada en la alimentación50 y, por lo tanto, el uso de este enfoque para identificar interacciones genéticas en las células neuronales requiere cruzar la chaperona mutante examinada con una cepa mejorada con ARNi51. En un segundo enfoque, se utilizó un promotor específico del tejido para impulsar la sobreexpresión de una chaperona en el músculo y, por lo tanto, afectar específicamente el entorno de plegamiento muscular40. Sin embargo, la sobre-expresión de un solo acompañante podría ser generalmente beneficiosa para el entorno de plegado y, por lo tanto, enmascarar la interrupción causada por las dos chaperonas juntas. El tercer enfoque se basó en el derribo de ARNi específico del tejido para examinar las interacciones de chaperonas en un tejido dado41. Una ventaja de este enfoque es que permite dirigirse a las células neuronales que son resistentes a la entrega de ARNi a través de la alimentación42. Aún así, este enfoque requiere el uso de un mutante leve (aunque no especializado), así como que este mutante se cruce en un mutante nulo rde-1 que lleve un gen de rescate rde-1 específico del tejido. Es importante destacar que estos enfoques se pueden combinar para modular potencialmente la función de la chaperona en un solo tejido o incluso en una sola célula.
La maquinaria de control de calidad puede afectar la función de muchos productos genéticos al perturbar la proteostasis. Este es un desafío importante cuando se utilizan interacciones genéticas para explorar la red de control de calidad18. Por ejemplo, la expresión crónica de proteínas propensas a la agregación o el colapso de la proteostasis en el envejecimiento resultaron en un agravamiento fenotípico de muchas proteínas metaestables no relacionadas en C. elegans ylevaduras 45,52,53. Además, la endocitosis mediada por clatrina en células de mamíferos se inhibió tras el secuestro funcional de Hsc70 a agregados de proteínas. Sin embargo, se demostró que la endocitosis podía ser rescatada por la sobreexpresión de Hsc70, mientras que la agregación no podía54,55. Asimismo, un cribado genético en Drosophila diseñado para descubrir reguladores de la respuesta de choque térmico identificó una mutación sin sentido en la actina muscular de vuelo que activó constitutivamente la respuesta de choque térmico56. En conjunto, la perturbación de la red de proteostasis puede exponer proteínas metaestables o inducir estrés que puede afectar la especificidad del resultado. Sin embargo, el análisis de las interacciones genéticas puede producir una visión altamente específica y funcional. Por ejemplo, los análisis epistáticos de genes de levadura requeridos para el plegamiento en el retículo endoplásmico identificaron interacciones genéticas específicas entre chaperonas moleculares que posteriormente fueron validadas19. Del mismo modo, una prueba agravante de chaperonas que mejoran la toxicidad de dos modelos propensos a la agregación (medidos por la motilidad) identificó un subconjunto específico de 18 chaperonas, ortólogos de los cuales afectaron la agregación de huntingtina en células humanas26. Aquí, mostramos que varias perturbaciones de la red de proteostasis pueden descubrir interacciones chaperonas específicas y funcionales.
La principal ventaja de usar pantallas de interacción genética basadas en la alimentación de ARNi es la relativa simplicidad del método. Incluso el empleo de una producción conductual general, como la motilidad, puede revelar nuevas interacciones genéticas(Figura 3). Sin embargo, la variabilidad y los efectos parciales del knockdown de la expresión pueden limitar la robustez y especificidad de los resultados57. Además, las interacciones genéticas no son indicativas de interacciones físicas y, por lo tanto, la relación entre dos genes podría ser indirecta. Explorar la naturaleza de las interacciones y descartar interacciones no específicas puede llevar mucho tiempo57,58,59. Esta es una preocupación que debe abordarse en la configuración y validación de la pantalla. Por ejemplo, el uso de alelos nulos en el cribado genético permite determinar si estos genes funcionan en la misma o distintas vías en un proceso biológico dado. Sin embargo, utilizando la pérdida parcial de la función génica, los alelos hipomórficos, como los alelos sensibles a la temperatura, o la regulación a la baja de la expresión dependiente del ARNi, dan como resultado actividades residuales que pueden producir fenotipos agravantes o aliviadores, independientemente de si los genes actúan en la misma vía o en vías paralelas59. Por lo tanto, la naturaleza de cualquier interacción requiere un análisis más profundo. Sin embargo, el uso de alelos hipomórficos y ARNi podría identificar una amplia gama de interactores, incluidos genes en el mismo complejo o vía de proteína o en una vía redundante59. Si bien este mayor alcance de posibles interacciones puede producir más impactos en una pantalla genética, también puede conducir a interacciones no específicas, como, por ejemplo, la exposición no específica de alelos sensibles a la temperatura en el colapso de la proteostasis45,53.
La validación de golpes y las interacciones no específicas se pueden examinar de varias maneras. El número de aciertos debe ser bajo. Por ejemplo, la regulación a la baja de la expresión de chaperonas en un fondo mutante unc-45 resultó en un pequeño porcentaje de aciertos (4%), y la mayoría de la regulación a la baja del gen de chaperonas no mostró ningún efecto sobre la motilidad. Se observó una tasa similar cuando DNJ-24M estaba sobre-expresado (6%). Como se señaló anteriormente, una pantalla para las interacciones de chaperonas con proteínas propensas a la agregación identificó 18 chaperonas de 219 examinadas (8%).
Se deben utilizar varios alelos mutantes, líneas de sobreexpresión o modelos de enfermedad. El uso de diferentes alelos mutantes que tienen diferentes impactos en la función de la chaperona, así como diferentes cepas con diferentes antecedentes genéticos, puede apoyar la especificidad de cualquier golpe de pantalla. Alternativamente, el uso de la mutación o la sobreexpresión de una chaperona diferente que no conduce a una perturbación similar puede servir como un control negativo. Por ejemplo, tanto unc-45(e286) como unc-45(m94) mostraron un comportamiento agravante cuando sti-1, ahsa-1 o daf-41 fueron regulados a la baja. Además, se observó una interacción similar cuando los animales portadores del mutante de deleción ahsa-1(ok3501) fueron tratados con rNAi hsp-90 25.
Se debe examinar la identidad de los golpes chaperone y sus interacciones conocidas. Por ejemplo, las chaperonas identificadas en una pantalla agravante unc-45 son un conjunto altamente específico de chaperonas requeridas para el ciclo HSP-90 ATPasa, incluidas las que codifican un reclutador de clientes (STI-1), un co-chaperone de remodelación (AHSA-1) y un co-chaperone de maduración del cliente (DAF-41). De hecho, este conjunto de co-chaperonas forma un ciclo de plegado HSP-90 completo60. Asimismo, una pantalla DNJ-24M identificó a HSP-1, el principal socio acompañante de Hsp40s40.
También se deben examinar los cambios en las interacciones a lo largo de la vida útil del animal. Por ejemplo, las chaperonas identificadas en la pantalla agravante unc-45 tuvieron un fuerte impacto en la motilidad y la organización de la miosina en la edad adulta, pero tuvieron un efecto más leve durante el desarrollo. Esto podría deberse a cambios en la red de proteostasis en la edad adultade 28 años o a cambios en los requisitos de plegamiento de miosina entre el plegamiento de miofibra y el mantenimiento.
Utilice enfoques bioquímicos complementarios para examinar directamente las interacciones entre las proteínas, así como su localización en la célula. Por ejemplo, las co-chaperonas HSP-90, STI-1, AHSA-1 y DAF-41, se localizan en el sarcómero donde interactúan con la miosina25.
C. elegans es un modelo metazoiano bien establecido para monitorear el control de calidad. A menudo se utiliza para monitorear la proteostasis celular y de organismos utilizando un conjunto de herramientas variables de biología celular, enfoques bioquímicos y genéticos. Aquí, empleamos enfoques de detección genética y herramientas disponibles57,58,59,como un banco de mutantes, bibliotecas de ARNi disponibles22,23 y cepas de ARNi específicas de tejido41,42,para monitorear las interacciones de chaperonas en un animal vivo durante el desarrollo y el envejecimiento. El uso de ensayos conductuales simples, como la motilidad, simplifica la detección de muchos posibles pares de genes para explorar nuevas interacciones genéticas. Esto puede servir como una plataforma para explorar más a fondo la localización de chaperonas y las interacciones físicas utilizando herramientas bioquímicas para estudiar mecánicamente sus posibles interacciones in vivo e in vitro. El protocolo aquí descrito se ha utilizado con éxito para identificar nuevas interacciones chaperonas en el músculo de la pared corporal de C. elegans 25,40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Centro de Genética Caenorhabditis, financiado por el Centro Nacional de Recursos de Investigación (NCRR) de los NIH, por algunas de las cepas de nematodos. Los anticuerpos monoclonales desarrollados por H.F. Epstein se obtuvieron del Developmental Studies Hybridoma Bank desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido por el Departamento de Biología de la Universidad de Iowa. Esta investigación fue apoyada por una subvención de la Fundación de Ciencias de Israel (subvención No. 278/18) y por una subvención del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Israel, y el Ministerio de Relaciones Exteriores y Cooperación Internacional, Dirección General de Promoción del País, República Italiana (subvención No. 3-14337). Agradecemos a los miembros del laboratorio Ben-Zvi por su ayuda en la preparación de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well-plates | SPL | BA3D16B | |
| 40 mm plates | Greiner Bio-one | 627160 | |
| 60 mm plates | Greiner Bio-one | 628102 | |
| 6-well plates | Thermo Scientific | 140675 | |
| 96 well 2 mL 128.0/85mm | Greiner Bio-one | 780278 | |
| Agar | Formedium | AGA03 | |
| Ampicillin | Formedium | 69-52-3 | |
| bromophenol blue | Sigma | BO126-25G | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | |
| Camera | Qimaging | q30548 | |
| Cholesterol | Amresco | 0433-250G | |
| Confocal | Leica | DM5500 | |
| Filter (0.22 µm) | Sigma | SCGPUO2RE | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ165FC | |
| Glycerol | Frutarom | 2355519000024 | |
| IPTG | Formedium | 367-93-1 | |
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873.1000 | |
| KOH | Bio-Lab | 001649029100 | |
| MgSO4 | Fisher | 22189-08-8 | Gift from the Morimoto laboratory |
| Myosin MHC A (MYO-3) antibody | Hybridoma Bank | 5-6 | |
| Na2HPO4·7H2O | Sigma | s-0751 | |
| NaCl | Bio-Lab | 001903029100 | |
| Peptone | Merck | 61930705001730 | |
| Plate pouring pump | Integra | does it p920 | |
| RNAi Chaperone library | NA | NA | |
| SDS | VWR Life Science | 0837-500 | |
| ß-mercaptoethanol | Bio world | 41300000-1 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
| Tetracycline | Duchefa Biochemie | 64-75-5 | |
| Tris | Bio-Lab | 002009239100 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 |
References
- Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
- Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
- Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
- Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J.
- Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
- Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B.
- Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
- Bett, J. S.
- Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
- Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
- Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
- Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
- O'Brien, D., van Oosten-Hawle, P.
- Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
- Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
- Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
- Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
- Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
- Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
- Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
- Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
- Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
- Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21 (2014).
- Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
- Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891 (2019).
- Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
- Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
- Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644 (2013).
- Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
- Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
- Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
- Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
- Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
- Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
- Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
- Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485 (2011).
- Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
- Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531 (2016).
- Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
- Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921 (2013).
- Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
- Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
- Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
- Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218 (2013).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
- Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
- Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
- Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
- Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).
