Uso de Caenorhabditis elegans para detectar interacciones de chaperonas específicas del tejido

Summary

Para estudiar las interacciones chaperona-chaperona y chaperona-sustrato, realizamos pantallas de interacción sintética en Caenorhabditis elegans utilizando interferencia de ARN en combinación con mutaciones leves o sobreexpresión de chaperonas y monitoreamos la disfunción proteica específica del tejido a nivel del organismo.

Abstract

El correcto plegamiento y ensamblaje de proteínas y complejos proteicos es esencial para la función celular. Las células emplean vías de control de calidad que corrigen, secuestran o eliminan las proteínas dañadas para mantener un proteoma saludable, asegurando así la proteostasis celular y previniendo un mayor daño proteico. Debido a las funciones redundantes dentro de la red de proteostasis, la detección de fenotipos detectables mediante el derribo o mutaciones en genes que codifican chaperonas en el organismo multicelular Caenorhabditis elegans da como resultado la detección de fenotipos menores o nulos en la mayoría de los casos. Hemos desarrollado una estrategia de detección dirigida para identificar las chaperonas necesarias para una función específica y, por lo tanto, cerrar la brecha entre el fenotipo y la función. Específicamente, monitoreamos las nuevas interacciones de chaperonas utilizando pantallas de interacción sintética de ARNi, derribando la expresión de chaperonas, una chaperona a la vez, en animales portadores de una mutación en un gen que codifica chaperona o sobreexpresando una chaperona de interés. Al interrumpir dos chaperonas que individualmente no presentan fenotipo grueso, podemos identificar chaperonas que agravan o exponen un fenotipo específico cuando ambas perturban. Demostramos que este enfoque puede identificar conjuntos específicos de chaperonas que funcionan juntas para modular el plegamiento de una proteína o complejos de proteínas asociados con un fenotipo dado.

Introduction

Las células hacen frente al daño de las proteínas mediante el empleo de maquinarias de control de calidad que reparan, secuestran o eliminan cualquier proteína dañada^1,2. El plegamiento y el ensamblaje de complejos de proteínas están respaldados por chaperonas moleculares, un grupo diverso de proteínas altamente conservadas que pueden reparar o secuestrar proteínas dañadas^3,4,5,6,7. La eliminación de proteínas dañadas está mediada por el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS)⁸ o por la maquinaria de autofagia⁹ en colaboración con chaperonas^10,11,12. La homeostasis proteica (proteostasis) se mantiene, por lo tanto, mediante redes de control de calidad compuestas por maquinarias de plegamiento y degradación^3,13. Sin embargo, comprender las interacciones entre los diversos componentes de la red de proteostasis in vivo es un desafío importante. Si bien las pantallas de interacción proteína-proteína aportan información importante sobre las interacciones físicas y los complejos de chaperonas^14,15, es deficiente comprender la organización y los mecanismos compensatorios dentro de las redes de chaperonas específicas de los tejidos in vivo.

Las interacciones genéticas se utilizan a menudo como una herramienta poderosa para examinar la relación entre pares de genes que están involucrados en vías biológicas comunes o compensatorias^16,17,18. Tales relaciones se pueden medir combinando pares de mutaciones y cuantificando el impacto de una mutación en un gen en la gravedad fenotípica causada por una mutación en el segundo gen¹⁶. Si bien la mayoría de estas combinaciones no muestran ningún efecto en términos de fenotipo, algunas interacciones genéticas pueden agravar o aliviar la gravedad del fenotipo medido. Las mutaciones agravantes se observan cuando el fenotipo del mutante de doble deleción es más grave que el fenotipo esperado visto al combinar los mutantes de deleción simple, lo que implica que los dos genes funcionan en vías paralelas, afectando juntos a una función dada. Por el contrario, se observan mutaciones de alivio cuando el fenotipo del mutante de doble deleción es menos grave que el fenotipo observado con los mutantes de deleción simple, lo que implica que los dos genes actúan juntos como un complejo o participan en la misma vía^16,18. En consecuencia, se han utilizado diversos fenotipos que se pueden cuantificar, incluidos fenotipos amplios, como la letalidad, las tasas de crecimiento y el tamaño de la cría, así como fenotipos específicos, como los reporteros transcripcionales, para identificar interacciones genéticas. Por ejemplo, Jonikas et al. se basaron en un reportero de estrés de ER para examinar las interacciones de la red de proteostasis de respuesta proteica desplegada por Saccharomyces cerevisiae ER utilizando análisis de deleción de genes por pares¹⁹.

Las pantallas de interacción genética implican el cruce sistemático de mutaciones de deleción por pares para generar un conjunto completo de mutantes dobles²⁰. Sin embargo, en modelos animales, y específicamente en C. elegans,este enfoque a gran escala no es factible. En cambio, las cepas mutantes pueden ser probadas por sus patrones de interacción genética mediante la regulación a la baja de la expresión génica utilizando la interferencia de ARN (RNAi)²¹. C. elegans es un potente sistema para pantallas basado en RNAi^22,23. En C. elegans, laentrega de ARN de doble cadena (dsRNA) se logra mediante la alimentación bacteriana, lo que lleva a la propagación de moléculas de dsRNA a numerosos tejidos. De esta manera, las moléculas de dsRNA introducidas impactan al animal a través de un procedimiento rápido y sencillo²¹. Una pantalla de interacción genética utilizando RNAi puede, por lo tanto, revelar el impacto de la regulación a la baja de un conjunto de genes o la mayoría de los genes codificantes de C. elegans utilizando bibliotecas de RNAi²⁴. En dicha pantalla, los golpes que impactan en el comportamiento del mutante de interés pero no en la cepa de tipo salvaje son potenciales modificadores del fenotipo que se está monitoreando²⁵. Aquí, aplicamos una combinación de mutaciones y cribado de ARNi para mapear sistemáticamente las interacciones de chaperonas específicas de tejidos en C. elegans.

Protocol

1. Preparación de placas de medios de crecimiento de nematodos para RNAi A una botella de 1 L, agregue 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-Peptona, 17 g de agar y agua destilada hasta 1 L y autoclave. Enfríe la botella a 55 °C. Añadir 25 mL de 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, y 1 mL de solución de colesterol (Tabla 1) para hacer nematodos medios de crecimiento (NGM). Añadir 1 ml de ampicilina (100 m…

Representative Results

Uso de mutaciones sensibles a la temperatura en UNC-45 para detectar interacciones agravantes o de alivio en condiciones permisivas o restrictivas, respectivamenteEl ensamblaje y mantenimiento muscular ofrece un sistema eficaz para estudiar las interacciones de chaperonas específicas del tejido. La unidad funcional de los músculos contráctiles, el sarcómero, presenta una disposición cristalina de proteínas estructurales y reguladoras. La estabilidad de la proteína motora miosina y su incorpora…

Discussion

Sigue faltando una imagen integrada de la red de proteostasis que refleje cómo está organizada y funciona en diferentes células y tejidos metazoarios. Para abordar esta deficiencia, se requiere información específica sobre las interacciones de varios componentes de esta red, como las chaperonas moleculares, en tejidos específicos durante el curso del desarrollo y el envejecimiento. Aquí, mostramos cómo el uso de perturbaciones específicas del tejido nos permitió examinar la red de chaperonas en un tejido dado. …

Materials

12-well-plates	SPL	BA3D16B
40 mm plates	Greiner Bio-one	627160
60 mm plates	Greiner Bio-one	628102
6-well plates	Thermo Scientific	140675
96 well 2 mL 128.0/85mm	Greiner Bio-one	780278
Agar	Formedium	AGA03
Ampicillin	Formedium	69-52-3
bromophenol blue	Sigma	BO126-25G
CaCl2	Merck	1.02382.0500
Camera	Qimaging	q30548
Cholesterol	Amresco	0433-250G
Confocal	Leica	DM5500
Filter (0.22 µm)	Sigma	SCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscope	Leica	MZ165FC
Glycerol	Frutarom	2355519000024
IPTG	Formedium	367-93-1
KCl	Merck	104936
KH2PO4	Merck	1.04873.1000
KOH	Bio-Lab	001649029100
MgSO4	Fisher	22189-08-8	Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibody	Hybridoma Bank	5-6
Na2HPO4·7H2O	Sigma	s-0751
NaCl	Bio-Lab	001903029100
Peptone	Merck	61930705001730
Plate pouring pump	Integra	does it p920
RNAi Chaperone library	NA	NA
SDS	VWR Life Science	0837-500
ß-mercaptoethanol	Bio world	41300000-1
stereomicroscope	Leica	MZ6
Tetracycline	Duchefa Biochemie	64-75-5
Tris	Bio-Lab	002009239100
Tween-20	Fisher	BP337-500