Herstellung von Zero Mode Waveguides für die hochkonzentrierte Einzelmolekülmikroskopie

Summary

Hier wird eine Nanosphärenlithographiemethode zur parallelen Herstellung von Nullmoduswellenleitern beschrieben, bei denen es sich um Arrays von Nanoaperturen in einem metallbeschichteten Glasmikroskopie-Coverlip für die Einzelmolekülbildgebung bei nano- bis mikromolaren Konzentrationen von Fluorophoren handelt. Die Methode nutzt die Kolloidalkristall-Selbstorganisation, um eine Hohlleiterschablone zu erstellen.

Abstract

In der Einzelmolekülfluoreszenzenzymologie begrenzt die Hintergrundfluoreszenz von markierten Substraten in Lösung die Fluorophorkonzentration oft auf pico- bis nanomolare Bereiche, mehrere Größenordnungen weniger als viele physiologische Ligandenkonzentrationen. Optische Nanostrukturen, sogenannte Zero Mode Waveguides (ZMWs), bei denen es sich um Aperturen mit einem Durchmesser von 100-200 nm handelt, die in einem dünnen leitenden Metall wie Aluminium oder Gold hergestellt werden, ermöglichen die Abbildung einzelner Moleküle bei mikromolaren Konzentrationen von Fluorophoren, indem sie die Anregung des sichtbaren Lichts auf zeptoliterische effektive Volumina beschränken. Der Bedarf an teuren und spezialisierten Nanofabrikationsgeräten hat jedoch die weit verbreitete Verwendung von ZMWs ausgeschlossen. Typischerweise werden Nanostrukturen wie ZMWs durch direktes Schreiben mit Elektronenstrahllithographie erhalten, die sequenziell und langsam ist. Hier wird die kolloidale oder Nanosphärenlithographie als alternative Strategie verwendet, um Masken im Nanometerbereich für die Wellenleiterherstellung herzustellen. Dieser Bericht beschreibt den Ansatz ausführlich mit praktischen Überlegungen für jede Phase. Das Verfahren ermöglicht es, Tausende von Aluminium- oder Gold-ZMWs parallel mit endgültigen Wellenleiterdurchmessern und Tiefen von 100-200 nm zu machen. Es werden nur gängige Laborgeräte und ein thermischer Verdampfer für die Metallabscheidung benötigt. Indem ZMWs für die biochemische Gemeinschaft zugänglicher gemacht werden, kann diese Methode die Untersuchung molekularer Prozesse bei zellulären Konzentrationen und Raten erleichtern.

Introduction

Einzelmolekültechniken wie Einzelmolekül-Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (smFRET) oder Einzelmolekül-Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) sind leistungsfähige Werkzeuge für die molekulare Biophysik, die die Untersuchung dynamischer Bewegungen, Konformationen und Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle in Prozessen wie Transkription^1,2,3, Translation^4,5,6und vielen anderen ermöglichen⁷. Für smFRET ist die TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) eine gängige Methode, da viele angebundene Moleküle im Laufe der Zeit verfolgt werden können und die von TIR erzeugte evaneszente Welle auf einen 100-200-nm-Bereich neben dem Coverslip⁸beschränkt ist. Trotz dieser Beschränkung des Anregungsvolumens müssen jedoch noch interessante Fluorophore in pM- oder nM-Bereiche verdünnt werden, um Einzelmolekülsignale oberhalb der Hintergrundfluoreszenz⁹zu detektieren. Da die Michaelis-Menten-Konstanten zellulärer Enzyme typischerweise im Bereich von μM bis mM^{10 liegen,}sind biochemische Reaktionen in Einzelmolekülstudien in der Regel viel langsamer als die in der Zelle. Zum Beispiel findet die Proteinsynthese bei 15-20 Aminosäuren pro Sekunde in E. coli^11,12statt, während die meisten prokaryotischen Ribosomen in smFRET-Experimenten bei 0,1-1 Aminosäure pro Sekunde¹³übersetzen. In der Proteinsynthese zeigten Kristallstrukturen und smFRET an festgefahrenen Ribosomen, dass Transfer-RNAs (tRNAs) vor der tRNA-mRNA-Translokation Schritt^14,15zwischen “hybriden” und “klassischen” Zuständen schwanken. Wenn jedoch physiologische Konzentrationen des Translokations-GTPase-Faktors EF-G vorhanden waren, wurde in smFRET 6 eine andere Konformation beobachtet, die zwischen dem hybriden und dem klassischen Zustand^liegt. Die Untersuchung dynamischer molekularer Prozesse mit ähnlichen Geschwindigkeiten und Konzentrationen wie in der Zelle ist wichtig, bleibt aber eine technische Herausforderung.

Eine Strategie zur Erhöhung der fluoreszierenden Substratkonzentration ist die Verwendung metallbasierter, subsichtbarer Wellenlängenöffnungen, sogenannte Zero Mode Waveguides (ZMWs), um begrenzte Anregungsfelder zu erzeugen, die selektiv Biomoleküle anregen, die innerhalb der Aperturen lokalisiert sind¹⁶ (Abbildung 1). Die Öffnungen sind typischerweise 100−200 nm im Durchmesser und 100−150 nm in der Tiefe¹⁷. Oberhalb einer Cutoff-Wellenlänge bezogen auf die Größe und Form der Brunnen (λ_c ≈ 2,3-facher Durchmesser für kreisförmige Wellenleiter mit Wasser als dielektrischem Medium¹⁸⁾sind im Wellenleiter keine Ausbreitungsmoden erlaubt, daher der Begriff Nullmodus-Wellenleiter. Ein oszillierendes elektromagnetisches Feld, eine evaneszente Welle, exponentiell zerfallende Intensität, tunnelt jedoch immer noch eine kurze Strecke in den Wellenleiter^18,19. Obwohl sie den evaneszenten TIR-Wellen ähneln, haben ZMW-evaneszente Wellen eine kürzere Zerfallskonstante, was zu einem effektiven Anregungsbereich von 10-30 nm innerhalb des Wellenleiters führt. Bei mikromolaren Konzentrationen fluoreszierend markierter Liganden sind nur ein oder wenige Moleküle gleichzeitig im Anregungsgebiet vorhanden. Diese Einschränkung des Anregungsvolumens und die daraus resultierende Reduktion der Hintergrundfluoreszenz ermöglicht die Fluoreszenzbildgebung einzelner Moleküle in biologisch relevanten Konzentrationen. Dies wurde auf viele Systeme²⁰angewendet, einschließlich FCS-Messungen der Einzelproteindiffusion^21,Einzelmolekül-FRET-Messungen von niedrigaffinen Liganden-Protein-22 und Protein-Protein-Interaktionen²³und spektro-elektrochemische Messungen von einzelnen molekularen Umsatzereignissen²⁴.

ZMWs wurden durch direktes Strukturieren einer Metallschicht mit Ionenstrahlfräsen^25,26 oder Elektronenstrahllithographie (EBL)^hergestellt,gefolgt von Plasmaätzen¹⁶,²⁷. Diese maskenlosen Lithographiemethoden erzeugen Wellenleiter in Serie und erfordern in der Regel Zugang zu spezialisierten Nanofabrikationsanlagen, was eine weit verbreitete Einführung der ZMW-Technologie verhindert. Eine andere Methode, ultraviolette Nanoimprint-Lithographie-Lift-off^28,verwendet eine Quarz-Diaform, um eine inverse ZMW-Schablone wie einen Stempel auf einen Widerstandsfilm zu drücken. Während diese Methode stromlinienförmiger ist, benötigt sie immer noch EBL für die Herstellung der Quarzform. Dieser Artikel stellt das Protokoll für eine einfache und kostengünstige vorgefertigte Herstellungsmethode vor, die kein EBL- oder Ionenstrahlfräsen erfordert und auf der engen Verpackung von Nanosphären basiert, um eine lithographische Maske zu bilden.

Die Nanosphären- oder “natürliche” Lithographie, die erstmals 1982 von Deckman und Dunsmuir^29,30vorgeschlagen wurde, verwendet die Selbstorganisation monodisperser kolloidaler Partikel, die von Dutzenden von Nanometern bis zu Dutzenden von Mikrometern³¹reichen, um Vorlagen für die Oberflächenstrukturierung durch Ätzen und / oder Abscheiden von Materialien zu erstellen. Die zweidimensionalen (2D) oder dreidimensionalen (3D) erweiterten periodischen Anordnungen kolloidaler Partikel, die als kolloidale Kristalle bezeichnet werden, zeichnen sich durch eine helle Iriseszenz aus Streuung und Beugung^{aus 32}aus. Obwohl diese Maskierungsmethode weniger weit verbreitet ist als Elektronenstrahl- oder Photolithographie, ist sie einfach, kostengünstig und leicht zu verkleinern, um Feature-Größen unter 100 nm zu erzeugen.

Die Selbstorganisation kolloidaler Partikel bestimmt den Erfolg der Verwendung kolloidaler Kristalle als Masken für die Oberflächenstrukturierung. Wenn die Größe und Form der Partikel homogen sind, können kolloidale Partikel leicht mit hexagonaler Packung selbst zusammengesetzt werden, angetrieben durch entropische Erschöpfung³³. Die Wasserverdampfung nach der Tropfenbeschichtung ist ein effektiver Weg, um die kolloidalen Partikel zu sedimentieren, obwohl andere Methoden Tauchbeschichtung³⁴, Spinbeschichtung³⁵, elektrophoretische Abscheidung³⁶und Konsolidierung an einer Luft-Wasser-Grenzfläche³⁷umfassen. Das unten vorgestellte Protokoll basiert auf der Verdunstungssedimentationsmethode, die am einfachsten zu implementieren war. Die dreieckigen Zwischenstellen zwischen dicht gepackten Polystyrolperlen bilden Öffnungen, in denen ein Opfermetall plattiert wird, wodurch Pfosten entstehen (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 1). Kurzes Glühen der Perlen vor diesem Schritt passt die Form und den Durchmesser dieser Pfosten an. Die Perlen werden entfernt, eine letzte Metallschicht wird um die Pfosten herum abgelagert und dann werden die Pfosten entfernt. Nach den beiden Metallabscheidungsschritten auf die kolloidale Nanomaske, der Entfernung der Zwischenpfosten und der oberflächenchemischen Modifikation zur Passivierung und Anbindeung sind die ZMW-Arrays für die Einzelmolekülbildgebung einsatzbereit. Eine weitergehende Charakterisierung der optischen Eigenschaften des ZMW nach der Herstellung findet sich in einem begleitenden Artikel³⁸. Neben einem thermischen Verdampfer zur Dampfabscheidung der Metalle sind keine Spezialwerkzeuge erforderlich.

Protocol

HINWEIS: Alle Schritte können im allgemeinen Laborbereich ausgeführt werden. 1. Reinigung von Glasabdeckungen Um eine saubere Oberfläche für die Verdunstungsablagerung kolloidaler Partikel zu schaffen, legen Sie 24 x 30 mm optische Borosilikatglasabdeckungen (0,16−0,19 mm Dicke) zur Reinigung in die gerillten Einsätze eines Coplinglas-Glasfärbeglases.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Abdecklippen aufrecht stehen und gut getrennt sind, damit alle Oberflächen während …

Representative Results

Die Selbstorganisation der kolloidalen Polystyrolpartikel durch Verdunstungssedimentation (Schritte 2.1−2.13) kann zu einer Reihe von Ergebnissen führen, da sie eine Kontrolle der Lösungsmittelverdampfungsrate erfordert. Da die Ablagerungen jedoch schnell sind (10-15 min pro Runde), kann das Verfahren schnell für unterschiedliche Umgebungsbedingungen im Labor optimiert werden. Abbildung 3A zeigt eine wohlgeformte kolloidale Schablone nach Ablagerung und Verdampfung. Makroskopisch ist de…

Discussion

Für die kolloidale Selbstorganisation (Protokollabschnitt 2) beschleunigt die Verwendung von Ethanol anstelle von Wasser als Suspensionslösungsmittel den Verdampfungsprozess, so dass die Schablonen in 2−3 min nach der Abscheidung fertig sind und nicht wie bei den vorherigen Methoden^{48,49 in 1−2}h. Das hier vorgestellte Verdunstungssedimentationsprotokoll ist auch einfacher als frühere Sedimentationsprotokolle, die die Kontrolle von Oberflächenneigung, Temp…

Materials

1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone	Sigma	32201	1 L
Coplin glass staining jar	Fisher Scientific	08-817	Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips	VWR	48404-467	24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol	Sigma	E7023	1 L
KOH	Sigma	30603	Potassium hydroxide
Petri dishes	Fisher Scientific	R80115TS	100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator	Branson	Z245143	Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container	Fisher Scientific	50-110-8222	26 x 18 x 15 in.
Desk fan	O2Cool	FD05001A	Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker	Fisher Scientific	02-555-25B	250 mL
Humidity meter	Fisher Scientific	11-661-19
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	21-402-903	1.5 mL
Polystyrene microspheres	Polysciences	18602-15	1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent	Sigma	X100	100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate	Fisher Scientific	AA11062RY	Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate	Fisher Scientific	HP88857100	13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller	McMaster-Carr	38615K71	Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe	McMaster-Carr	9251T93	Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant	Transene	Type A
Aluminum pellets	Kurt J. Lesker	EVMAL40QXHB	For electron beam evaporation
Chloroform	Sigma	288306	1 L
Copper etchant	Transene	49-1
Copper pellets	Kurt J. Lesker	EVMCU40QXQA	For electron beam evaporation
Gold pellets	Kurt J. Lesker	EVMAUXX40G	For electron beam evaporation
Lens paper	Thorlabs	MC-5
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Scotch tape	Staples	MMM119
Thin film deposition system	Kurt J. Lesker	PVD-75	Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets	Kurt J. Lesker	EVMTI45QXQA	For electron beam evaporation
Toluene	Sigma	244511	1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software	COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter	Photometrics, Inc.